第十四章高效液相色谱法优秀PPT.ppt

第十四章 高效液相色谱法第一页，本课件共有74页学习大纲学习大纲14-1 14-1 概述概述概述概述14-2 14-2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪14-3 14-3 液相色谱的固定相与流动相液相色谱的固定相与流动相液相色谱的固定相与流动相液相色谱的固定相与流动相14-4 14-4 高效液相色谱的方法高效液相色谱的方法高效液相色谱的方法高效液相色谱的方法14-5 14-5 色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择第十四章第十四章 高效液相色谱法高效液相色谱法一、高效液相色谱法一、高效液相色谱法一、高效液相色谱法一、高效液相色谱法二、二、二、二、HPLCHPLC与经典与经典与经典与经典LCLC区别区别区别区别三、三、三、三、HPLCHPLC与与与与GCGC区别区别区别区别四、四、四、四、HPLCHPLC的特点和应用的特点和应用的特点和应用的特点和应用一、高压输液系统一、高压输液系统一、高压输液系统一、高压输液系统二、进样系统二、进样系统二、进样系统二、进样系统 三、色谱柱三、色谱柱三、色谱柱三、色谱柱 四、检测器四、检测器四、检测器四、检测器 一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相一、分配色谱一、分配色谱一、分配色谱一、分配色谱二、吸附色谱二、吸附色谱二、吸附色谱二、吸附色谱三、离子交换色谱三、离子交换色谱三、离子交换色谱三、离子交换色谱 四、离子色谱四、离子色谱四、离子色谱四、离子色谱五、离子对色谱法五、离子对色谱法五、离子对色谱法五、离子对色谱法六、尺寸排阻色谱法六、尺寸排阻色谱法六、尺寸排阻色谱法六、尺寸排阻色谱法七、亲合色谱七、亲合色谱七、亲合色谱七、亲合色谱 第二页，本课件共有74页14-1 概述概述 高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱(HPLCHPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方是以溶剂液体为流动相的色谱方是以溶剂液体为流动相的色谱方是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：法。按照固定相不同可分为：法。按照固定相不同可分为：法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱液液分配色谱液液分配色谱液液分配色谱；吸附色谱；吸附色谱；吸附色谱；吸附色谱(液液液液固色谱固色谱固色谱固色谱)；离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱；尺寸排阻色谱；尺寸排阻色谱；尺寸排阻色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱)。一、高效液相色谱法一、高效液相色谱法 早期液相色谱是在直径早期液相色谱是在直径早期液相色谱是在直径早期液相色谱是在直径15cm,15cm,长长长长50500cm50500cm的玻璃柱中进行的。填的玻璃柱中进行的。填的玻璃柱中进行的。填的玻璃柱中进行的。填充的固定相颗粒直径多在充的固定相颗粒直径多在充的固定相颗粒直径多在充的固定相颗粒直径多在150200m150200m范围内。但流速低范围内。但流速低范围内。但流速低范围内。但流速低(1mL/min)(100m 100m 且不均匀且不均匀柱内径柱内径2 26mm6mm固定相粒径固定相粒径10m7pH7时，该检测器不够时，该检测器不够时，该检测器不够时，该检测器不够灵敏。灵敏。灵敏。灵敏。6 6、其它检测器、其它检测器、其它检测器、其它检测器 MSMSIRIREvaporative light scattering detector(Evaporative light scattering detector(光散射光散射光散射光散射)极谱极谱极谱极谱 首首首首 页页页页上上上上一一一一页页页页下下下下一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第二十七页，本课件共有74页检测器性能指标检测器性能指标检测器性能指标检测器性能指标 （1 1）噪音和漂移：）噪音和漂移：）噪音和漂移：）噪音和漂移：在仪器稳定之后，记录基线在仪器稳定之后，记录基线在仪器稳定之后，记录基线在仪器稳定之后，记录基线1 1小时，基线带宽为噪音，小时，基线带宽为噪音，小时，基线带宽为噪音，小时，基线带宽为噪音，基线在基线在基线在基线在1 1小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速和溶剂的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。流速和溶剂的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。流速和溶剂的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。流速和溶剂的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。（2 2）灵敏度）灵敏度）灵敏度）灵敏度(sensitivity)(sensitivity)：表示一定量的样品物质通过检测器时所表示一定量的样品物质通过检测器时所表示一定量的样品物质通过检测器时所表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。对浓度型检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号给出的信号大小。对浓度型检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号给出的信号大小。对浓度型检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号给出的信号大小。对浓度型检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小，单位为的大小，单位为的大小，单位为的大小，单位为mVml/gmVml/g。对质量型检测器，它表示在单位时间内通过检测。对质量型检测器，它表示在单位时间内通过检测。对质量型检测器，它表示在单位时间内通过检测。对质量型检测器，它表示在单位时间内通过检测器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为mVs/gmVs/g。（3 3）检测限）检测限）检测限）检测限(detection limit)(detection limit)：指恰好产生可辨别的信号时进入检测器指恰好产生可辨别的信号时进入检测器指恰好产生可辨别的信号时进入检测器指恰好产生可辨别的信号时进入检测器的某组分的量。又称为的某组分的量。又称为的某组分的量。又称为的某组分的量。又称为敏感度敏感度敏感度敏感度(detectability)(detectability)。D D3N/S3N/S，式中，式中，式中，式中N N为噪声，为噪声，为噪声，为噪声，S S为灵敏度。通常是把一个已知量的标准溶液注入到检测器中来测定其检测限为灵敏度。通常是把一个已知量的标准溶液注入到检测器中来测定其检测限为灵敏度。通常是把一个已知量的标准溶液注入到检测器中来测定其检测限为灵敏度。通常是把一个已知量的标准溶液注入到检测器中来测定其检测限的大小。的大小。的大小。的大小。检测限是检测器的一个主要性能指标，检测限是检测器的一个主要性能指标，检测限是检测器的一个主要性能指标，检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性其数值越小，检测器性其数值越小，检测器性其数值越小，检测器性能越好能越好能越好能越好。首首首首 页页页页上上上上一一一一页页页页下下下下一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第二十八页，本课件共有74页（4 4）线性范围）线性范围）线性范围）线性范围(linear range)(linear range)：指检测器的响应信号与组分量成直线关系指检测器的响应信号与组分量成直线关系指检测器的响应信号与组分量成直线关系指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的浓度）之比。浓度）之比。浓度）之比。浓度）之比。线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些尽可能大些尽可能大些尽可能大些，能，能，能，能同时测定主成分和痕量成分。同时测定主成分和痕量成分。同时测定主成分和痕量成分。同时测定主成分和痕量成分。（5 5）池体积：）池体积：）池体积：）池体积：除制备色谱外，大多数除制备色谱外，大多数除制备色谱外，大多数除制备色谱外，大多数HPLCHPLC检测器的池体积都检测器的池体积都检测器的池体积都检测器的池体积都小于小于小于小于10µl10µl。在使用细管径柱时，池体积应减少到。在使用细管径柱时，池体积应减少到。在使用细管径柱时，池体积应减少到。在使用细管径柱时，池体积应减少到12µl12µl甚至更甚至更甚至更甚至更低，低，低，低，不然检测系统带来的峰扩张问题就会很严重不然检测系统带来的峰扩张问题就会很严重不然检测系统带来的峰扩张问题就会很严重不然检测系统带来的峰扩张问题就会很严重。而且这时池体、检测器与色谱。而且这时池体、检测器与色谱。而且这时池体、检测器与色谱。而且这时池体、检测器与色谱柱的连接、接头等都要精心设计，否则会严重影响柱效和灵敏度。柱的连接、接头等都要精心设计，否则会严重影响柱效和灵敏度。柱的连接、接头等都要精心设计，否则会严重影响柱效和灵敏度。柱的连接、接头等都要精心设计，否则会严重影响柱效和灵敏度。首首首首 页页页页上上上上一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第二十九页，本课件共有74页14-3 液相色谱的固定相与流动相液相色谱的固定相与流动相一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相 stationary phases of LC1 1、液、液、液、液-液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相（1 1）全多孔型担体）全多孔型担体）全多孔型担体）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用现采用现采用现采用10m10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2 2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）30 3040m40m的玻璃微球，表面附着一层厚度为的玻璃微球，表面附着一层厚度为的玻璃微球，表面附着一层厚度为的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 1 2m 2m的多孔的多孔的多孔的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；硅胶。表面积小，柱容量底；硅胶。表面积小，柱容量底；硅胶。表面积小，柱容量底；首首首首 页页页页下下下下一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第三十页，本课件共有74页（3 3）化学键合固定相）化学键合固定相）化学键合固定相）化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相:目前目前目前目前应用最广、性能最佳应用最广、性能最佳应用最广、性能最佳应用最广、性能最佳的固定相；的固定相；的固定相；的固定相；a.a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOCSiOC b.b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C SiOSi C 稳定，耐水、耐稳定，耐水、耐稳定，耐水、耐稳定，耐水、耐 光、耐有机溶剂，应用最广；光、耐有机溶剂，应用最广；光、耐有机溶剂，应用最广；光、耐有机溶剂，应用最广；c.c.硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型：SiCSiC d.d.硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型：SiNSiN首首首首 页页页页上上上上一一一一页页页页下下下下一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第三十一页，本课件共有74页化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1 1）传质快传质快传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2 2）寿命长寿命长寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，耐水、耐光、耐有机溶剂，耐水、耐光、耐有机溶剂，耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定稳定稳定稳定；（3 3）选择性好选择性好选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；，可键合不同官能团，提高选择性；，可键合不同官能团，提高选择性；，可键合不同官能团，提高选择性；（4 4）有利于梯度洗脱有利于梯度洗脱有利于梯度洗脱有利于梯度洗脱；（5 5）存在着）存在着）存在着）存在着双重分离机制双重分离机制双重分离机制双重分离机制（键合基团的覆盖率决定分离机（键合基团的覆盖率决定分离机（键合基团的覆盖率决定分离机（键合基团的覆盖率决定分离机 理）高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；理）高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；理）高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；理）高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；首首首首 页页页页上上上上一一一一页页页页下下下下一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第三十二页，本课件共有74页2 2、离子交换色谱分离固定相、离子交换色谱分离固定相、离子交换色谱分离固定相、离子交换色谱分离固定相结构类别：结构类别：结构类别：结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄薄薄薄壳壳壳壳玻玻玻玻璃璃璃璃珠珠珠珠为为为为担担担担体体体体，表表表表面面面面涂约涂约涂约涂约1%1%的离子交换树脂；的离子交换树脂；的离子交换树脂；的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄薄薄薄壳壳壳壳键键键键合合合合型型型型；微微微微粒粒粒粒硅硅硅硅胶胶胶胶键键键键合型（键合离子交换基团）合型（键合离子交换基团）合型（键合离子交换基团）合型（键合离子交换基团）树脂类别：树脂类别：（1 1）阳阳阳阳离离离离子子子子交交交交换换换换树树树树脂脂脂脂（强强强强酸酸酸酸性性性性、弱酸性）弱酸性）弱酸性）弱酸性）（2 2）阴阴阴阴离离离离子子子子交交交交换换换换树树树树脂脂脂脂（强强强强碱碱碱碱性性性性、弱碱性）弱碱性）弱碱性）弱碱性）首首首首 页页页页上上上上一一一一页页页页下下下下一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第三十三页，本课件共有74页3 3、空间排阻分离固定相、空间排阻分离固定相、空间排阻分离固定相、空间排阻分离固定相（1 1）软质凝胶）软质凝胶）软质凝胶）软质凝胶 葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶、琼琼琼琼脂脂脂脂凝凝凝凝胶胶胶胶等等等等。多多多多孔孔孔孔网网网网状状状状结结结结构构构构；水水水水为为为为流流流流动动动动相相相相。适适适适用于常压排阻分离。用于常压排阻分离。用于常压排阻分离。用于常压排阻分离。（2 2）半硬质凝胶）半硬质凝胶）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯苯苯苯乙乙乙乙烯烯烯烯-二二二二乙乙乙乙烯烯烯烯基基基基苯苯苯苯交交交交联联联联共共共共聚聚聚聚物物物物，有有有有机机机机凝凝凝凝胶胶胶胶；非非非非极极极极性性性性有有有有机机机机溶溶溶溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂。剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂。剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂。剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂。（3 3）硬质凝胶）硬质凝胶）硬质凝胶）硬质凝胶 多多多多孔孔孔孔硅硅硅硅胶胶胶胶、多多多多孔孔孔孔玻玻玻玻珠珠珠珠等等等等；化化化化学学学学稳稳稳稳定定定定性性性性、热热热热稳稳稳稳定定定定性性性性好好好好、机机机机械械械械强强强强度度度度大大大大，流流流流动动动动相相相相性性性性质质质质影影影影响响响响小小小小，可可可可在在在在较较较较高高高高流流流流速速速速下下下下使使使使用用用用。可可可可控控控控孔孔孔孔径径径径玻玻玻玻璃璃璃璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。4 4、液、液、液、液-固吸附分离固定相固吸附分离固定相固吸附分离固定相固吸附分离固定相种种种种 类：类：类：类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：结构类型：结构类型：结构类型：全多孔型和薄壳型；全多孔型和薄壳型；全多孔型和薄壳型；全多孔型和薄壳型；粒粒粒粒 度：度：度：度：5 510 m10 m；首首首首 页页页页上上上上一一一一页页页页下下下下一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第三十四页，本课件共有74页二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相 mobile phases of LC1 1、流动相特性、流动相特性、流动相特性、流动相特性（1 1）液相色谱的流动相又称为：）液相色谱的流动相又称为：）液相色谱的流动相又称为：）液相色谱的流动相又称为：淋洗液淋洗液淋洗液淋洗液，洗脱剂洗脱剂洗脱剂洗脱剂。流动相组成改。流动相组成改。流动相组成改。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；变，极性改变，可显著改变组分分离状况；变，极性改变，可显著改变组分分离状况；变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2 2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3 3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。反。反。反。2 2、流动相类别、流动相类别、流动相类别、流动相类别按流动相组成分：按流动相组成分：按流动相组成分：按流动相组成分：单组分和多组分；单组分和多组分；单组分和多组分；单组分和多组分；按极性分：按极性分：按极性分：按极性分：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；按使用方式分：按使用方式分：按使用方式分：按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。固定组成淋洗和梯度淋洗。固定组成淋洗和梯度淋洗。固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：常用溶剂：常用溶剂：常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。首首首首 页页页页上上上上一一一一页页页页下下下下一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第三十五页，本课件共有74页3 3、流动相选择、流动相选择、流动相选择、流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液采用正相液采用正相液采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。时间缩短。时间缩短。时间缩短。常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水水水水(最大最大最大最大)甲酰胺甲酰胺甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈乙腈乙腈 甲醇甲醇甲醇甲醇 乙醇乙醇乙醇乙醇 丙醇丙醇丙醇丙醇 丙酮丙酮丙酮丙酮 二氧六环二氧六环二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚乙醚乙醚 异丙醚异丙醚异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷溴乙烷溴乙烷 苯苯苯苯 四氯化碳四氯化碳四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷环己烷环己烷 己烷己烷己烷己烷 煤油煤油煤油煤油(最小最小最小最小)首首首首 页页页页上上上上一一一一页页页页下下下下一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第三十六页，本课件共有74页4 4、选择流动相时应注意的几个问题、选择流动相时应注意的几个问题、选择流动相时应注意的几个问题、选择流动相时应注意的几个问题（1 1）高效液相色谱灵敏度高，尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质）高效液相色谱灵敏度高，尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质）高效液相色谱灵敏度高，尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质）高效液相色谱灵敏度高，尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。不纯的溶剂还会引起基线不稳，或不纯的溶剂还会引起基线不稳，或不纯的溶剂还会引起基线不稳，或不纯的溶剂还会引起基线不稳，或产生产生产生产生“伪峰伪峰伪峰伪峰”。（2 2）化学稳定性好）化学稳定性好）化学稳定性好）化学稳定性好，避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3 3）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选 择性，防止产生沉淀并在柱中沉积。择性，防止产生沉淀并在柱中沉积。择性，防止产生沉淀并在柱中沉积。择性，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4 4）溶剂与检测器匹配。）溶剂与检测器匹配。）溶剂与检测器匹配。）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长 要长。要长。要长。要长。所谓溶剂的所谓溶剂的所谓溶剂的所谓溶剂的紫外截止波长紫外截止波长紫外截止波长紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，它严重干扰组分的吸收测量。烈吸收，它严重干扰组分的吸收测量。烈吸收，它严重干扰组分的吸收测量。烈吸收，它严重干扰组分的吸收测量。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。达到最高灵敏度。达到最高灵敏度。达到最高灵敏度。（5 5）低粘度（粘度适中）低粘度（粘度适中）低粘度（粘度适中）低粘度（粘度适中）若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。检测器内形成气泡，影响分离。检测器内形成气泡，影响分离。检测器内形成气泡，影响分离。首首首首 页页页页上上上上一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第三十七页，本课件共有74页14-4 高效液相色谱的方法高效液相色谱的方法 按分离原理可将按分离原理可将按分离原理可将按分离原理可将HPLCHPLC分为分配色谱、吸附色谱、离子交换分为分配色谱、吸附色谱、离子交换分为分配色谱、吸附色谱、离子交换分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。一、分配色谱一、分配色谱一、分配色谱一、分配色谱1 1、原理：、原理：、原理：、原理：根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。2 2、流动相、流动相、流动相、流动相:HPLC HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将极性的差别程度，可将极性的差别程度，可将极性的差别程度，可将液液色谱液液色谱液液色谱液液色谱分为分为分为分为正相分配色谱正相分配色谱正相分配色谱正相分配色谱（流动相极性小于（流动相极性小于（流动相极性小于（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱反相分配色谱反相分配色谱反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。分离）。分离）。分离）。首首首首 页页页页下下下下一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第三十八页，本课件共有74页液液色谱固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：（1 1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为30 30 4040 mm的实心玻璃球和厚度约为的实心玻璃球和厚度约为的实心玻璃球和厚度约为的实心玻璃球和厚度约为1 2 1 2 mm的多孔性外层所的多孔性外层所的多孔性外层所的多孔性外层所组成。组成。组成。组成。（2 2）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径30 50 30 50 mm的多孔型颗粒。的多孔型颗粒。的多孔型颗粒。的多孔型颗粒。（3 3）全多孔型微粒载体，由）全多孔型微粒载体，由）全多孔型微粒载体，由）全多孔型微粒载体，由nmnm级的硅胶微粒堆积而成，又级的硅胶微粒堆积而成，又级的硅胶微粒堆积而成，又级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为称堆积硅珠。这种载体粒度为称堆积硅珠。这种载体粒度为称堆积硅珠。这种载体粒度为5 10 5 10 mm。由于颗粒小，。由于颗粒小，。由于颗粒小，。由于颗粒小，所所所所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。第三十九页，本课件共有74页由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可因此常用的只有几种，按极性由高到低为：可因此常用的只有几种，按极性由高到低为：可因此常用的只有几种，按极性由高到低为：可因此常用的只有几种，按极性由高到低为：,-,-氧二丙腈、聚乙二醇、三甲氧二丙腈、聚乙二醇、三甲氧二丙腈、聚乙二醇、三甲氧二丙腈、聚乙二醇、三甲撑二醇、十八烷、角鲨烷。撑二醇、十八烷、角鲨烷。撑二醇、十八烷、角鲨烷。撑二醇、十八烷、角鲨烷。根据涂渍方法的不同，可将固定相分为根据涂渍方法的不同，可将固定相分为根据涂渍方法的不同，可将固定相分为根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型机械涂渍型机械涂渍型机械涂渍型和和和和化学键合型化学键合型化学键合型化学键合型，后，后，后，后者应用更为广泛。者应用更为广泛。者应用更为广泛。者应用更为广泛。3 3、固定液、固定液、固定液、固定液（1 1）机械涂渍固定相：）机械涂渍固定相：）机械涂渍固定相：）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%(0.5-1.5%涂布量涂布量涂布量涂布量)或或或或全多孔型载体全多孔型载体全多孔型载体全多孔型载体(5-10%(5-10%涂布量涂布量涂布量涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的的的的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。为减少固定液的流失，通常在柱前为减少固定液的流失，通常在柱前为减少固定液的流失，通常在柱前为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱加一根很短的前置柱加一根很短的前置柱加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析，该柱涂有与分析，该柱涂有与分析，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。液饱和。液饱和。液饱和。这种色谱方法适合于分离这种色谱方法适合于分离这种色谱方法适合于分离这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃芳烃、稠环芳烃及烷烃芳烃、稠环芳烃及烷烃芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物等化合物等化合物等化合物首首首首 页页页页上上上上一一一一页页页页下下下下一一一一页页页页末末末末 页页页页退退退退 出出出出第四十页，本课件共有74页（2 2）化学键合固定相）化学键合固定相）化学键合固定相）化学键合固定相 Si-O-RSi-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断 裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。Si-R(Si-R(或或或或Si-N)Si-