微生物的菌种选育学习教案.pptx

微生物的菌种选育微生物的菌种选育(xun y)第一页，共45页。5.5.微生物的菌种微生物的菌种选育选育(xun y)(xun y)第1页/共45页第二页，共45页。理想发酵(f jio)工业用菌要求1 1、遗传性状稳定；、遗传性状稳定；、遗传性状稳定；、遗传性状稳定；2 2、生长速度快，不易、生长速度快，不易、生长速度快，不易、生长速度快，不易(b y)(b y)被噬菌体等异种微生物污染；被噬菌体等异种微生物污染；被噬菌体等异种微生物污染；被噬菌体等异种微生物污染；3 3、目标产物的产量尽可能接近理想转化率；、目标产物的产量尽可能接近理想转化率；、目标产物的产量尽可能接近理想转化率；、目标产物的产量尽可能接近理想转化率；4 4、最好是胞外产物；、最好是胞外产物；、最好是胞外产物；、最好是胞外产物；5 5、尽可能减少产物类似物的生成；、尽可能减少产物类似物的生成；、尽可能减少产物类似物的生成；、尽可能减少产物类似物的生成；6 6、培养基简单、来源广、价格低；、培养基简单、来源广、价格低；、培养基简单、来源广、价格低；、培养基简单、来源广、价格低；7 7、对、对、对、对T T、pHpH、离子强度、剪切力不敏感；、离子强度、剪切力不敏感；、离子强度、剪切力不敏感；、离子强度、剪切力不敏感；8 8、溶氧要求低、便于培养能耗低；、溶氧要求低、便于培养能耗低；、溶氧要求低、便于培养能耗低；、溶氧要求低、便于培养能耗低；第2页/共45页第三页，共45页。5.1 5.1 从自然界中获得从自然界中获得(hud)(hud)新菌种新菌种5.1.1 采样采样(ci yn)5.1.2 增殖增殖(zngzh)5.1.3纯化纯化5.1.4性能鉴定性能鉴定调查研究，查阅资料调查研究，查阅资料设计试验方案设计试验方案确定样品的生态环境、季节选确定样品的生态环境、季节选择和地点选择择和地点选择采样采样增殖培养增殖培养(1)控制营养成分控制营养成分(2)控制控制pH(3)温度控制温度控制第3页/共45页第四页，共45页。纯种纯种(chn zhn)分分离离(1)稀释稀释(xsh)法法(2)划线划线(hu xin)法法(3)组织分离组织分离原种斜面原种斜面筛选筛选(1)纸片培养显色法纸片培养显色法(2)透明圈法透明圈法(3)变色圈法变色圈法(4)生长圈法生长圈法(5)抑菌圈法抑菌圈法复筛复筛再复筛再复筛35株株性能鉴定性能鉴定发酵发酵pH、T、通风、搅拌、无菌程度、适应性、通风、搅拌、无菌程度、适应性、副产品和对低劣廉价原料的利用副产品和对低劣廉价原料的利用毒性实验毒性实验菌种鉴定菌种鉴定第4页/共45页第五页，共45页。5.2 5.2 基因突变基因突变(j yn t(j yn t bin)bin)和微生物菌种选育和微生物菌种选育第5页/共45页第六页，共45页。一、一、一、一、3 3 3 3个经典实验个经典实验个经典实验个经典实验(shyn)(shyn)(shyn)(shyn)（一）经典转化试验（一）经典转化试验（一）经典转化试验（一）经典转化试验 最早进行转化（最早进行转化（transformation）实验的是）实验的是F.Griffith（1928 年），他以年），他以Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌，旧称（肺炎链球菌，旧称“肺炎双球菌肺炎双球菌”）作为）作为(zuwi)研究对象。研究对象。5.2.15.2.1遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础第6页/共45页第七页，共45页。（1）动物）动物(dngw)实验实验著名著名(zhmng)的肺炎球菌转化的肺炎球菌转化试验试验S型，致病菌，型，致病菌，具荚膜，菌落表面具荚膜，菌落表面(biomin)光滑（光滑（smoth）R型，非致病菌，型，非致病菌，无荚膜，菌落表面粗糙（无荚膜，菌落表面粗糙（rough）S型型R型型加热灭菌加热灭菌热死热死S菌活菌活R菌菌第7页/共45页第八页，共45页。第8页/共45页第九页，共45页。（2）细菌培养）细菌培养(piyng)试验试验第9页/共45页第十页，共45页。（3）S型菌的无细胞型菌的无细胞(xbo)抽提液试验抽提液试验第10页/共45页第十一页，共45页。Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上在四十年代以更精密的实验设计重复了以上(yshng)实验实验第11页/共45页第十二页，共45页。（1）从活的）从活的S菌中抽提各种细胞成分（菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质，荚膜多糖等），蛋白质，荚膜多糖等）（2）对各组分进行）对各组分进行(jnxng)转化试验转化试验第12页/共45页第十三页，共45页。只有只有(zhyu)DNA 被酶降解破坏的抽提物无转化活性被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA是转化所必需是转化所必需(bx)的转化因子的转化因子第13页/共45页第十四页，共45页。（二）噬菌体感染（二）噬菌体感染（二）噬菌体感染（二）噬菌体感染(gnrn)(gnrn)(gnrn)(gnrn)实验实验实验实验 1952年，年，A.D.Hershey和和M.Chase发表发表(fbio)了证明了证明DNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验是噬菌体的遗传物质基础的著名实验 噬菌体感染实验噬菌体感染实验第14页/共45页第十五页，共45页。35S蛋白质外壳蛋白质外壳(wi k)的噬菌体的噬菌体32PDNA核心核心(hxn)的噬菌体的噬菌体第15页/共45页第十六页，共45页。在在DNA中存在中存在(cnzi)着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。第16页/共45页第十七页，共45页。（三）植物病毒（三）植物病毒（三）植物病毒（三）植物病毒(bngd)(bngd)(bngd)(bngd)的重建实验的重建实验的重建实验的重建实验 为了证明核酸是遗传物质，为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含）用含RNA的烟草花叶病毒（的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物）进行了著名的植物(zhw)病毒重建实验。病毒重建实验。第17页/共45页第十八页，共45页。烟草烟草(ynco)花叶病毒的核酸花叶病毒的核酸抗血清处理，证明抗血清处理，证明(zhngmng)杂种病毒的蛋白质外壳来自病毒杂种病毒的蛋白质外壳来自病毒 1，而非病毒，而非病毒 2杂种病毒杂种病毒(bngd)的后代的蛋白质外壳表现为病毒的后代的蛋白质外壳表现为病毒(bngd)2，而非病毒，而非病毒(bngd)1遗传物质是核酸（遗传物质是核酸（RNA）而非蛋白质而非蛋白质霍氏车前病毒霍氏车前病毒的蛋白质外壳的蛋白质外壳HRVHMV第18页/共45页第十九页，共45页。亚病毒亚病毒(bngd)的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为发现该蛋白内含有核酸。的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为发现该蛋白内含有核酸。其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP c改变折叠状态为改变折叠状态为PrP sc所致所致(su zh)，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。二、朊病的发现二、朊病的发现(fxin)(fxin)与与思考思考第19页/共45页第二十页，共45页。思考思考(sko)1）蛋白质是否可以作为遗传物质？）蛋白质是否可以作为遗传物质？prion是生命是生命(shngmng)的一个特例？还是仅仅为表达调控的一种形式？的一个特例？还是仅仅为表达调控的一种形式？2）蛋白质折叠与功能）蛋白质折叠与功能(gngnng)的关系，是否存在折叠密码？的关系，是否存在折叠密码？DNARNA肽链肽链蛋白质蛋白质第20页/共45页第二十一页，共45页。三、原核三、原核(yun h)(yun h)微生微生物的质粒物的质粒 1.1.定义和特点定义和特点质粒：质粒：一种独立于染色体外，能进行自主一种独立于染色体外，能进行自主(zzh)复制复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。中。第21页/共45页第二十二页，共45页。cccDNAocDNAlDNA第22页/共45页第二十三页，共45页。另一类质粒的复制另一类质粒的复制(fzh)与核染色体的复制与核染色体的复制(fzh)不同步，不同步，在这类细胞中，一般含在这类细胞中，一般含1015个或更多质粒。个或更多质粒。严紧严紧(yn jn)(yn jn)型复制控制（型复制控制（stringent replication controlstringent replication control）松弛型复制松弛型复制(fzh)(fzh)控制（控制（relaxed replication controlrelaxed replication control）质粒的复制与核染色体的复制同步，质粒的复制与核染色体的复制同步，在这类细胞中，一般只含在这类细胞中，一般只含12个质粒；个质粒；质粒是一种独立存在于细胞内的质粒是一种独立存在于细胞内的复制子复制子（replicon）。第23页/共45页第二十四页，共45页。通常以共价闭合环状（通常以共价闭合环状（covalently closed circle，简称，简称(jinchng)CCC）的超螺旋双链）的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；分子存在于细胞中；也发现也发现(fxin)有线型双链有线型双链 DNA质粒和质粒和RNA质粒；质粒；质粒分子的大小范围从质粒分子的大小范围从1kb左右左右(zuyu)到到1000kb；（细菌质粒多在（细菌质粒多在10kb以内）以内）2.2.2.2.质粒的分子结构质粒的分子结构质粒的分子结构质粒的分子结构第24页/共45页第二十五页，共45页。t 提取提取(tq)所有胞内所有胞内DNA后电镜观察；后电镜观察；t 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察(gunch)；t 对于实验室常用对于实验室常用(chn yn)菌，可用质粒所带的某些特点，菌，可用质粒所带的某些特点，t 如抗药性初步判断。如抗药性初步判断。特定的质粒提取方法和后处理使染色体和特定的质粒提取方法和后处理使染色体和RNA均被除掉。均被除掉。3.3.3.3.质粒的检测质粒的检测质粒的检测质粒的检测第25页/共45页第二十六页，共45页。质粒的主要质粒的主要(zhyo)功能功能在某些特殊条件下，质粒有时在某些特殊条件下，质粒有时(yush)能赋予宿主细胞以特殊的机能，能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。从而使宿主得到生长优势。质粒所含的基因对宿主细胞质粒所含的基因对宿主细胞(xbo)一般是非必需的；一般是非必需的；第26页/共45页第二十七页，共45页。质粒所编码质粒所编码的功能的功能(gngnng)和赋和赋予宿主的表予宿主的表型效应型效应致育因子致育因子(ynz)（Fertility factor，F因子因子(ynz)）抗性因子抗性因子(ynz)（Resistance factor，R因子因子(ynz)）产细菌素的质粒（产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）毒性质粒（毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒（代谢质粒（Metabolic plasmid）隐秘质粒（隐秘质粒（cryptic plasmid）4.4.4.4.质粒的主要质粒的主要质粒的主要质粒的主要(zhyo)(zhyo)(zhyo)(zhyo)类型类型类型类型第27页/共45页第二十八页，共45页。（1）F质粒（质粒（F plasmid）又称又称F因子、致育因子（因子、致育因子（fertility factor）或性因子（）或性因子（sex factor），其大小约），其大小约100kb，为，为cccDNA，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖(yuxng shngzh)现象（接合作用）有关的质粒。现象（接合作用）有关的质粒。第28页/共45页第二十九页，共45页。携带携带F质粒的菌株称为质粒的菌株称为(chn wi)F+菌株（相当于雄性），菌株（相当于雄性），无无F质粒的菌株称为质粒的菌株称为(chn wi)F-菌株（相当于雌性）。菌株（相当于雌性）。第29页/共45页第三十页，共45页。（2）R质粒（质粒（R plasmid）包括包括(boku)(boku)抗药性和抗重金属二大类。抗药性和抗重金属二大类。又称又称R因子因子(ynz)（R factor）、抗性因子）、抗性因子(ynz)（resisitrance plasmid）。）。第30页/共45页第三十一页，共45页。含调节含调节DNA复制和拷贝数的基因复制和拷贝数的基因(jyn)以及转移基因以及转移基因(jyn)，相对分子量约，相对分子量约11107，具有转移功能；，具有转移功能；抗性转移因子抗性转移因子（resistance transfer factor，RTF）抗性决定抗性决定(judng)因子（因子（r-determinant）大小不很固定，相对大小不很固定，相对(xingdu)分子量从几百万至分子量从几百万至11108以上，无转移功能，含各种抗性基因，如抗青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。以上，无转移功能，含各种抗性基因，如抗青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。R质粒一般由两个相连的质粒一般由两个相连的DNA片段组成片段组成第31页/共45页第三十二页，共45页。由由RTFRTF和和r r决定决定(judng)(judng)子结合而形成子结合而形成R R质粒的过质粒的过程：程：抗性质粒在细菌间的传递抗性质粒在细菌间的传递(chund)是细菌产生抗药性的重要原因之一。是细菌产生抗药性的重要原因之一。第32页/共45页第三十三页，共45页。R100质粒（质粒（89kb）可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：）可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（汞（mercuric ion，mer）四环素（四环素（tetracycline，tet）链霉素（链霉素（Streptomycin,Str）、）、磺胺磺胺(hun n)（Sulfonamide,Su）、）、氯霉素（氯霉素（Chlorampenicol,Cm）夫西地酸（夫西地酸（fusidic acid，fus）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。R质粒的种类质粒的种类(zhngli)很多，很多，例如，例如，R1（94kb）和）和R100（89.3kb）等。）等。第33页/共45页第三十四页，共45页。（3）Col质粒（质粒（colicin plasmid，col plasmid）又称大肠杆菌又称大肠杆菌(d chn n jn)素质粒或产大肠杆菌素质粒或产大肠杆菌(d chn n jn)素因子（素因子（colicinogenic factor，col factor）。）。细菌素（细菌素（bacteriocin）是质粒编码的蛋白质，）是质粒编码的蛋白质，一般由细菌产生，可抑制或杀死其他近缘细菌一般由细菌产生，可抑制或杀死其他近缘细菌或同种不同菌株的代谢或同种不同菌株的代谢(dixi)产物，但不产物，但不具有很广的杀菌谱。具有很广的杀菌谱。第34页/共45页第三十五页，共45页。细菌素结构细菌素结构(jigu)基因、基因、涉及细菌素运输及发挥作用（涉及细菌素运输及发挥作用（processing）的蛋白质的基因、）的蛋白质的基因、赋予宿主对该细菌素具有赋予宿主对该细菌素具有“免疫力免疫力”的相关产物的基因的相关产物的基因一般都位于质粒或转座子上，一般都位于质粒或转座子上，细菌素可以细菌素可以(ky)杀死同种但不携带该质粒的菌株。杀死同种但不携带该质粒的菌株。第35页/共45页第三十六页，共45页。细菌素一般根据细菌素一般根据(gnj)产生菌的种类进行命名：产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（大肠杆菌（E.coli）产生）产生(chnshng)的细菌素为的细菌素为colicins（大肠杆菌素），（大肠杆菌素），而质粒被称为而质粒被称为Col质粒。质粒。Col E1Col E1质粒：相对分子量小（质粒：相对分子量小（9kb9kb，约，约51065106），无接合作用，是松弛性控制、多拷贝的；），无接合作用，是松弛性控制、多拷贝的；ColbColb质粒：相对分子量大（质粒：相对分子量大（94kb94kb，约，约8107 8107），具有通过接合而转移的功能，属严紧），具有通过接合而转移的功能，属严紧(yn jn)(yn jn)型控制，只有型控制，只有1 12 2个拷贝。个拷贝。第36页/共45页第三十七页，共45页。（4）Ti质粒（质粒（tumor inducing plasmid）即诱癌质粒或冠瘿质粒（即诱癌质粒或冠瘿质粒（crown gall plasmid）。）。Ti质粒是一种质粒是一种200kb的环状质粒，包括毒性区（的环状质粒，包括毒性区（vir）、接合）、接合(jih)转移（转移（con）、复制起始区（）、复制起始区（ori）和）和T-DNA区区4部分。部分。T-DNA区可携带任何外源基因整合到植物基因组中，区可携带任何外源基因整合到植物基因组中，Ti质粒是植物基因工程质粒是植物基因工程(jyn gngchng)中使用最广、效果最佳的克隆载体。中使用最广、效果最佳的克隆载体。第37页/共45页第三十八页，共45页。Agrobacterium tumefaciens（根癌土壤杆菌（根癌土壤杆菌(gnjn)或根癌农杆菌或根癌农杆菌(gnjn)）释放出的）释放出的Ti质粒上的质粒上的T-DNA片断与植物细胞的核基因组整合，合成冠瘿碱类（片断与植物细胞的核基因组整合，合成冠瘿碱类（opines）,破坏控制细胞分裂的激素调节系统，使之变成癌细胞。破坏控制细胞分裂的激素调节系统，使之变成癌细胞。第38页/共45页第三十九页，共45页。（5）Ri质粒（质粒（root inducing plasmid）250kb的的Ri质粒中的一段质粒中的一段T-DNA整合到宿主根部细胞的核基因组中，可发生整合到宿主根部细胞的核基因组中，可发生(fshng)转化。转化。Agrobacterium rhizogenes（发根（发根(f n)土壤杆菌或发根土壤杆菌或发根(f n)农杆菌）可侵染双子叶植物的根部，并诱发大量称为毛状根的不定根。农杆菌）可侵染双子叶植物的根部，并诱发大量称为毛状根的不定根。RiRi质粒是外源基因的良好质粒是外源基因的良好(lingho)(lingho)载体！载体！第39页/共45页第四十页，共45页。（6）mega质粒（质粒（megaplasmid）即巨大质粒，其相对分子量比一般质粒大几十倍至几百倍，存在即巨大质粒，其相对分子量比一般质粒大几十倍至几百倍，存在(cnzi)于于Rhizobium（根瘤菌属）中，（根瘤菌属）中，其上有一系列与共生固氮相关的基因。其上有一系列与共生固氮相关的基因。第40页/共45页第四十一页，共45页。（7）降解）降解(jin ji)质粒质粒 这类质粒是由降解一系列复杂有机物的酶编码这类质粒是由降解一系列复杂有机物的酶编码(bin m)，所以在污水处理、环境保护等方面发挥作用。，所以在污水处理、环境保护等方面发挥作用。只在假单胞菌属（只在假单胞菌属（Pseudomonas）中发现）中发现(fxin)降解质粒。降解质粒。第41页/共45页第四十二页，共45页。降解质粒以其所分解的底物命名，降解质粒以其所分解的底物命名，例如例如(lr)，CAM（樟脑）质粒，（樟脑）质粒，OCT（辛烷）质粒，（辛烷）质粒，XYL（二甲苯）质粒，（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，（扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒，（萘）质粒，TOL（甲苯）质粒等（甲苯）质粒等第42页/共45页第四十三页，共45页。“超级菌超级菌”通过遗传工程手段构建具有数种降解通过遗传工程手段构建具有数种降解(jin ji)质粒的菌株，具有广谱降解质粒的菌株，具有广谱降解(jin ji)能能力的工程菌。力的工程菌。第43页/共45页第四十四页，共45页。第44页/共45页第四十五页，共45页。