毛细管电泳技术及应用全解PPT学习教案.pptx

会计学1毛细管电泳技术及应用毛细管电泳技术及应用(yngyng)全解全解第一页，共68页。电电 泳泳 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电解质溶液中，位于电场中的带电离子(lz)(lz)在电场力的在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子称之为电泳。由于不同离子(lz)(lz)所带电荷及性质的不同，迁移所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。速率不同，可实现分离。1808年，Reuss（俄国）首次发现电泳现象。1937年，Tiselius（瑞典）用于人血清蛋白质混合液的分离：发现样品的迁移(qiny)速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；第1页/共68页第二页，共68页。经典经典(jngdin)(jngdin)电泳电泳 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速(xn s)发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术毛细管电泳。第2页/共68页第三页，共68页。毛细管电泳毛细管电泳(din yn)（Capillary Electrophoresis,CE）高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：采用了采用了25-100m25-100m内径的毛细管；内径的毛细管；采用了高达数千伏的电压。采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够毛细管的采用使产生的热量能够(nnggu)(nnggu)较快散发，大较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，增加，毛细管电泳的柱效远高于毛细管电泳的柱效远高于HPLCHPLC，理论塔板数高达几十万块，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。米，特殊柱子可以达到数百万。第3页/共68页第四页，共68页。分离分离(fnl)过程过程 电场作用(zuyng)下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。阳离子：两种效应(xioyng)的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应(xioyng)的运动方向相反。电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。第4页/共68页第五页，共68页。毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳(din y(din y n n)的特点的特点的特点的特点1.1.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在在3.1min3.1min内分离内分离3636种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，4.1min4.1min内分内分离了离了2424种阳离子；种阳离子；3.3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行；进样量极少，水介质中进行；4.4.应用范围极广应用范围极广 有机物、无机物、生物有机物、无机物、生物(shngw)(shngw)、中性分子；生物、中性分子；生物(shngw)(shngw)大分子等；大分子等；分子生物分子生物(shngw)(shngw)学、医学、药学、化学、环境保护、学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；材料等；第5页/共68页第六页，共68页。n n一、一、一、一、CECE基本原理基本原理基本原理基本原理n n二、电渗现象二、电渗现象二、电渗现象二、电渗现象(xinxing)(xinxing)与电渗流与电渗流与电渗流与电渗流electroosmotic flowelectroosmotic flown n三、影响电渗流的因素三、影响电渗流的因素三、影响电渗流的因素三、影响电渗流的因素n n四、淌度四、淌度四、淌度四、淌度mobilitymobilityn n五、五、五、五、CECE中的参数与关系式中的参数与关系式中的参数与关系式中的参数与关系式n n六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素毛细管电泳理论毛细管电泳理论(lln)(lln)基础基础第6页/共68页第七页，共68页。毛细管电泳毛细管电泳(din yn)(CE)(din yn)(CE)基本原理基本原理 电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同(b tn)(b tn)离离子具有不同子具有不同(b tn)(b tn)的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度当带电离子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、方在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：电场力：FE=qE 阻阻 力：力：F=f故：故：qE=fq离子所带的有效电荷；离子所带的有效电荷；E 电场强度；电场强度；离子在电场中的迁移速度离子在电场中的迁移速度(sd)；f 平动摩擦系数平动摩擦系数(对于球形离子：对于球形离子：f=6；离子的表观液离子的表观液态动力学半径；态动力学半径；介质的粘度；介质的粘度；)第7页/共68页第八页，共68页。所以所以(suy)，迁移速度：，迁移速度：（球形离子(lz)）物质离子在电场物质离子在电场(din chng)中差速迁移是电泳分离的基础。中差速迁移是电泳分离的基础。淌度淌度：单位电场：单位电场(din chng)强度下的平均电泳速度。强度下的平均电泳速度。q离子所带的有效电荷；离子所带的有效电荷；E 电场强度；电场强度；离子的表观液态动力学半径离子的表观液态动力学半径 介质的粘度；介质的粘度；第8页/共68页第九页，共68页。电渗现象电渗现象(xinxing)(xinxing)与电渗流与电渗流 electroosmosis and electroosmosis and electroosmotic flowelectroosmotic flow1.1.电渗流现象电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于当固体与液体接触时，固体表面由于(yuy)(yuy)某种原因带一种电荷，则因静电引力使某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双固界面形成双电层，二者之间存在电位差。电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加(shji)电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow，简称EOF）。第9页/共68页第十页，共68页。2.HPCE2.HPCE2.HPCE2.HPCE中的电渗现象中的电渗现象中的电渗现象中的电渗现象(xinxing)(xinxing)(xinxing)(xinxing)与电渗流与电渗流与电渗流与电渗流 石英毛细管柱，内充液pH3时，表面(biomin)电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散(kusn)层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。第10页/共68页第十一页，共68页。3.CE3.CE3.CE3.CE中电渗流的大小中电渗流的大小中电渗流的大小中电渗流的大小(dxio)(dxio)(dxio)(dxio)与方向与方向与方向与方向 电渗流的大小用电渗流速度电渗流表示，取决于电渗淌度和电场强度E。即 电渗流=E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即 =00真空介电常数；介电常数；毛细管壁的Zeta电势。电渗流=0 E实际(shj)电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 电渗流=Lef/teoLef 毛细管有效长度；teo电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。第11页/共68页第十二页，共68页。CECE中电渗流的方向中电渗流的方向中电渗流的方向中电渗流的方向(fngxing)(fngxing)电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向负极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向正极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性 表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转(fn zhun)剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向正极。第12页/共68页第十三页，共68页。4.CE4.CE4.CE4.CE中电渗流的流形中电渗流的流形中电渗流的流形中电渗流的流形(li xn)(li xn)(li xn)(li xn)电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度(sd)为平均速度(sd)的2倍（引起谱带展宽较大）。第13页/共68页第十四页，共68页。5.CE5.CE5.CE5.CE中电渗流的作用中电渗流的作用中电渗流的作用中电渗流的作用(zuyng)(zuyng)(zuyng)(zuyng)电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流+ef 阳离子运动方向与电渗流一致；-=电渗流-ef 阴离子运动方向与电渗流相反；0=电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成(wn chng)阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在CE中，控制电渗流非常重要。第14页/共68页第十五页，共68页。CECE中影响中影响中影响中影响(y(y ngxingxi ng)ng)电渗流的因素电渗流的因素电渗流的因素电渗流的因素1.1.电场强度的影响电场强度的影响(yngxing)(yngxing)电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。电渗流速度正比于工作电压。2.2.毛细管材料的影响毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表不同材料毛细管的表面电荷面电荷(dinh)(dinh)特性不同，特性不同，产生的电渗流大小不同；产生的电渗流大小不同；第15页/共68页第十六页，共68页。3.3.3.3.电解质溶液性质电解质溶液性质电解质溶液性质电解质溶液性质(xngzh)(xngzh)(xngzh)(xngzh)的影响的影响的影响的影响（1 1）溶液）溶液pHpH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液对于石英毛细管，溶液pHpH增高时，表面电离多，电荷密增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁度增加，管壁zetazeta电势增大，电渗流增大，电势增大，电渗流增大，pH=7pH=7，达到最大；，达到最大；pH3pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持时，采用缓冲溶液来保持pHpH稳定。稳定。（2 2）阴离子的影响）阴离子的影响 在其他条件在其他条件(tiojin)(tiojin)相同，浓度相同而阴离子不同时，相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。渗流下降。第16页/共68页第十七页，共68页。第17页/共68页第十八页，共68页。4.4.4.4.温度温度温度温度(wnd)(wnd)(wnd)(wnd)的影响的影响的影响的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化变化(binhu)(binhu)来自于来自于“焦耳热焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；CE CE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化比。温度每变化(binhu)1(binhu)1，将引起背景电解质溶液黏度变化，将引起背景电解质溶液黏度变化(binhu)2%(binhu)2%3%3%；第18页/共68页第十九页，共68页。5.5.5.5.添加剂的影响添加剂的影响添加剂的影响添加剂的影响(yngxing)(yngxing)(yngxing)(yngxing)（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子(lz)强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2 2）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。使电渗流增大。（3 3）加入表面）加入表面(biomin)(biomin)活性剂，活性剂，可改变电渗流的大小和方向；可改变电渗流的大小和方向；加入阴离子表面加入阴离子表面(biomin)(biomin)活活性剂，如十二烷基硫酸钠（性剂，如十二烷基硫酸钠（SDSSDS），），可以使壁表面可以使壁表面(biomin)(biomin)负电荷负电荷增加，增加，zetazeta电势增大，电渗流增电势增大，电渗流增大；大；加入不同阳离子表面加入不同阳离子表面(biomin)(biomin)活性剂来控制电渗流。活性剂来控制电渗流。第19页/共68页第二十页，共68页。淌度淌度 MobilityMobility 淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。淌度不同是电泳分离的基础。1.1.绝对淌度绝对淌度(absolute mobility)ab(absolute mobility)ab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。度，简称淌度。可在手册中查阅。2.2.有效淌度有效淌度(effective mobility)ef(effective mobility)ef 实际溶液中的淌度实际溶液中的淌度(实验中测定的实验中测定的)。ef=aii ef=aii ai ai 溶质溶质(rngzh)i(rngzh)i 的解离度；的解离度；i i 溶质溶质(rngzh)i(rngzh)i 在在解离状态下的绝对淌度解离状态下的绝对淌度第20页/共68页第二十一页，共68页。CECE中的参数中的参数中的参数中的参数(cnsh)(cnsh)与关系式与关系式与关系式与关系式 1.1.迁移时间（保留时间）迁移时间（保留时间）CECE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论(lln)(lln)也适用。也适用。VV外加电压；外加电压；LL毛细管总长度；毛细管总长度；2.2.分离效率（塔板数）分离效率（塔板数）在在CECE中，仅存在中，仅存在(cnzi)(cnzi)纵向扩散，纵向扩散，2=2Dt2=2Dt 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。子的依据。第21页/共68页第二十二页，共68页。3.3.3.3.分离分离分离分离(fnl)(fnl)(fnl)(fnl)度度度度 影响(yngxing)分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：第22页/共68页第二十三页，共68页。影响分离效率的因素影响分离效率的因素影响分离效率的因素影响分离效率的因素(yn s)(yn s)(yn s)(yn s)区带展宽区带展宽区带展宽区带展宽1.1.纵向纵向(zn xin)(zn xin)扩散的影响扩散的影响 在在HPCEHPCE中，纵向中，纵向(zn xin)(zn xin)扩散引起的峰展宽：扩散引起的峰展宽：2=2Dt2=2Dt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.2.进样的影响进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向(zn xin)(zn xin)扩散。分离效率明显下降；理想情况下，扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：进样塞长度：Winj=(24D t)1/2 Winj=(24D t)1/2实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%1%2%2%。第23页/共68页第二十四页，共68页。3.3.3.3.焦耳焦耳焦耳焦耳(jio r)(jio r)(jio r)(jio r)热与温度梯度的影响热与温度梯度的影响热与温度梯度的影响热与温度梯度的影响 电泳(din yn)过程产生的焦耳热可由下式计算：mm电解质溶液的摩尔电导；电解质溶液的摩尔电导；II工作电流：工作电流：cmcm电解质浓度；电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏坏(phui)(phui)了塞流，导致区带展宽。了塞流，导致区带展宽。改善方法：改善方法：（1 1）减小毛细管内径；）减小毛细管内径；（2 2）控制散热；）控制散热；第24页/共68页第二十五页，共68页。4.4.4.4.溶质溶质溶质溶质(rngzh)(rngzh)(rngzh)(rngzh)与管壁间的相互作用与管壁间的相互作用与管壁间的相互作用与管壁间的相互作用 存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导(din do)，对电渗流影响不大。第25页/共68页第二十六页，共68页。5.5.5.5.其他其他其他其他(qt)(qt)(qt)(qt)影响因素影响因素影响因素影响因素 （1 1）电分散作用对谱带展宽的影响）电分散作用对谱带展宽的影响 当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2 2）“层流层流”现象对谱带展宽的影响现象对谱带展宽的影响 一般情况下，一般情况下，CECE中不存在层流，但当毛细管两端存在压中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现力差时，出现(chxin)(chxin)抛物线形的层流；抛物线形的层流；产生的原因：毛细管两端液面高度不同。产生的原因：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。第26页/共68页第二十七页，共68页。n n一、高效毛细管电泳仪一、高效毛细管电泳仪一、高效毛细管电泳仪一、高效毛细管电泳仪n n二、流程与主要二、流程与主要二、流程与主要二、流程与主要(zhyo)(zhyo)(zhyo)(zhyo)部件部件部件部件n n三、进样方式三、进样方式三、进样方式三、进样方式n n四、检测器四、检测器四、检测器四、检测器毛细管电泳仪毛细管电泳仪第27页/共68页第二十八页，共68页。第28页/共68页第二十九页，共68页。仪器流程仪器流程仪器流程仪器流程(lichng)(lichng)(lichng)(lichng)与主要部件与主要部件与主要部件与主要部件 电压电压(diny)(diny)：0 030kV30kV；分离柱不涂敷任何固定液；分离柱不涂敷任何固定液；紫外或激光诱导荧光检测器；紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：（可检测到：10-1910-1910-21 mol/L10-21 mol/L）第29页/共68页第三十页，共68页。1.1.1.1.高压电源高压电源高压电源高压电源（1 1）0 030 kV 30 kV 稳定、连续可调的直流电源；稳定、连续可调的直流电源；（2 2）具有）具有(jyu)(jyu)恒压、恒流、恒功率输出；恒压、恒流、恒功率输出；（3 3）电场强度程序控制系统；）电场强度程序控制系统；（4 4）电压稳定性：）电压稳定性：0.1%0.1%；（5 5）电源极性易转换；）电源极性易转换；2.2.毛细管柱毛细管柱 （1 1）材料：石英：）材料：石英：各项性能好；玻璃各项性能好；玻璃(b(b l)l)：光学、机械性能：光学、机械性能差；差；（2 2）规格：内径）规格：内径202075m75m，外径，外径350350400m400m；长度；长度=1m电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况(qngkung)下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。最基本、应用广的分离模式；第40页/共68页第四十一页，共68页。二、毛细管凝胶电泳二、毛细管凝胶电泳二、毛细管凝胶电泳二、毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis capillary gel electrophoresis，CGECGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效有效(yuxio)(yuxio)减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、蛋白质、DNADNA等的电荷等的电荷/质量比与分子大小无关，质量比与分子大小无关，CZECZE模式很难分离，模式很难分离，采用采用CGECGE能获得良好分离，能获得良好分离，DANDAN排序的重要手段。排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。丙烯酰胺。柱便宜、易制备。第41页/共68页第四十二页，共68页。1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度(nngd)达到临界浓度(nngd)，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。三、三、三、三、胶束电动胶束电动胶束电动胶束电动(din dn)(din dn)(din dn)(din dn)毛细管色谱（毛细管色谱（毛细管色谱（毛细管色谱（MEKCMEKCMEKCMEKC）Micellar electrokinetic capillary Micellar electrokinetic capillary Micellar electrokinetic capillary Micellar electrokinetic capillary chromatographychromatographychromatographychromatography，MEKCMEKCMEKCMEKC 在电场力的作用(zuyng)下，胶束在柱中移动。第42页/共68页第四十三页，共68页。2.电泳(din yn)流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳(din yn)，负电胶束以较慢的速度向负极移动；5.色谱(s p)与电泳分离模式的结合。3.3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；胶束结合的较牢，流出时间长；4.4.可用来分离中性物质，扩展了高效可用来分离中性物质，扩展了高效(o xio)(o xio)毛细管电泳的应毛细管电泳的应用范围；用范围；第43页/共68页第四十四页，共68页。1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷(dinh)与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷(dinh)，反之带负电荷(dinh)。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；四、毛细管等电聚焦四、毛细管等电聚焦四、毛细管等电聚焦四、毛细管等电聚焦(jjio)(jjio)(jjio)(jjio)Capillary isoelectric focusing Capillary isoelectric focusing Capillary isoelectric focusing Capillary isoelectric focusing，CIEFCIEFCIEFCIEF第44页/共68页第四十五页，共68页。4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成(xngchng)窄溶质带而相互分离；5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过(jnggu)检测器检测；7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。第45页/共68页第四十六页，共68页。1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部(qunb)位于两者之间，并以同一速度移动。2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。五、毛细管等速电泳五、毛细管等速电泳五、毛细管等速电泳五、毛细管等速电泳 Capillary isotachophoresis Capillary isotachophoresis，CITPCITP第46页/共68页第四十七页，共68页。3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口(ch ku)到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4 电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队；4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；capillary isotachophoresis capillary isotachophoresis，CITPCITP第47页/共68页第四十八页，共68页。在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以“电渗泵”取代机械泵，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动(din dn)色谱过程。六、毛细管电动六、毛细管电动六、毛细管电动六、毛细管电动(din dn)(din dn)(din dn)(din dn)色谱色谱色谱色谱 Capillary electrokinetic chromatography Capillary electrokinetic chromatography Capillary electrokinetic chromatography Capillary electrokinetic chromatography，CECCECCECCEC第48页/共68页第四十九页，共68页。七、毛细管微乳电动七、毛细管微乳电动七、毛细管微乳电动七、毛细管微乳电动(din(din dndn)色谱色谱色谱色谱(Microemulsion(Microemulsion electrokinetic electrokinetic chromatography,MEEKC)chromatography,MEEKC)Watern-Octanen-OctaneSO3-SO3-OH OHOH OH OHNa+Na+WaterNa+SO3-WaterButan-1-olSDSSodium ionOH第49页/共68页第五十页，共68页。CE相关技术相关技术1.毛细管电泳柱技术毛细管电泳柱技术 毛细管是毛细管是CE的核心部件的核心部件之一早期之一早期(zoq)研究集中研究集中在毛细管直径、长度、形状在毛细管直径、长度、形状和材料方面，目前集中在管和材料方面，目前集中在管壁的改性和各种柱的制备。壁的改性和各种柱的制备。第50页/共68页第五十一页，共68页。1)动态修饰毛细管内壁 管壁改性主要是消除吸附和控制电渗流，通常采用动态修饰和表面涂层两类方法(fngf)。动态修饰采用在运行缓冲液中加入添加剂，如加入阳离子表面活性剂十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)，能在内壁形成物理吸附层，使EOF反向添加剂还有聚胺、聚乙烯亚胺(PEI)等，甲基纤维素(MC)可形成一中性亲水性覆盖层。第51页/共68页第五十二页，共68页。2)毛细管内壁表面涂层毛细管内壁表面涂层 涂层方法涂层方法(fngf)有很有很多种，包括物理涂布、化学多种，包括物理涂布、化学涂层。最常用的方法涂层。最常用的方法(fngf)是采用双官能团的是采用双官能团的偶联剂，如各种有机硅烷，偶联剂，如各种有机硅烷，第一个官能团第一个官能团(如甲氧基如甲氧基)与与管壁上的游离羟基进行反应，管壁上的游离羟基进行反应，使其与管壁进行共价结合，使其与管壁进行共价结合，再用第二个官能团再用第二个官能团(如乙烯如乙烯基基)与涂渍物与涂渍物(如聚丙烯酰胺如聚丙烯酰胺)进行反应，形成一稳定的进行反应，形成一稳定的涂层此外还有将纤维素、涂层此外还有将纤维素、PEI和聚醚组成多层涂层，和聚醚组成多层涂层，亲水性的绒毛涂层亲水性的绒毛涂层(fuzzy)和联锁聚醚涂层。和联锁聚醚涂层。第52页/共68页第五十三页，共68页。化学键合物理(wl)吸附第53页/共68页第五十四页，共68页。3)凝胶柱和无胶筛分凝胶柱和无胶筛分 CGE的关键是毛细管的关键是毛细管凝胶柱的制备，常用聚丙烯凝胶柱的制备，常用聚丙烯酰胺凝胶栓来进行酰胺凝胶栓来进行DNA片段片段分析和测序。测定蛋白质和分析和测序。测定蛋白质和肽的分子量常用十二烷基肽的分子量常用十二烷基(wn j)硫酸钠聚丙烯酰胺电硫酸钠聚丙烯酰胺电泳泳(SDS-LPAGE)。如将聚丙。如将聚丙烯胺单体溶液中的交联剂甲烯胺单体溶液中的交联剂甲叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺(Bis)浓度降浓度降为零，得到线性非交联的亲为零，得到线性非交联的亲水性聚合物用作操作溶液，水性聚合物用作操作溶液，仍有按分子大小分离的作用，仍有按分子大小分离的作用，称无胶筛分。此法简单，使称无胶筛分。此法简单，使用方便，分离能力比用方便，分离能力比CGE差。差。第54页/共68页第五十五页，共68页。4)CEC的毛细管柱制备的毛细管柱制备 包括开管和填充柱包括开管和填充柱 开管柱：键合色谱涂层毛细开管柱：键合色谱涂层毛细管柱，例如：将核糖核酸酶、管柱，例如：将核糖核酸酶、己糖激酶、腺苷脱氨酶等固己糖激酶、腺苷脱氨酶等固定到毛细管表面，构成一开定到毛细管表面，构成一开管反应器，再和管反应器，再和CE连接，可连接，可进行核酸选择性检测、微量进行核酸选择性检测、微量在线在线(zi xin)合成和分离寡合成和分离寡核昔酸等工作。核昔酸等工作。填充柱：可将填充柱：可将HPLC中众多中众多的固定相微粒填充到毛细管的固定相微粒填充到毛细管中。中。第55页/共68页第五十六页，共68页。2.毛细管电泳检测技术毛细管电泳检测技术(jsh)CE对检测器灵敏度要对检测器灵敏度要求相当高，故检测是求相当高，故检测是CE中中的关键问题。迄今为止除了的关键问题。迄今为止除了原子吸收光谱与红外光谱末原子吸收光谱与红外光谱末用于用于CE外，其它检测手段外，其它检测手段均已用于均已用于CE。现选择重要。现选择重要的几类检测器介绍其最新进的几类检测器介绍其最新进展。展。第56页/共68页第五十七页，共68页。1)紫外检测器紫外检测器(UV)在合适位置除去涂层，在合适位置除去涂层，将透明部分对准光路。将透明部分对准光路。UV检测器集中在提高检测器集中在提高灵敏度，可采用毛细管弯折、灵敏度，可采用毛细管弯折、吹泡技术扩大光路。或采用吹泡技术扩大光路。或采用平面积分检测池，这种设计平面积分检测池，这种设计可使检测光路增加到可使检测光路增加到1cm。也有用光散射二极管也有用光散射二极管(LEDS)作光源，其线性范围和信噪作光源，其线性范围和信噪比优于汞灯。总体比优于汞灯。总体(zngt)来说进展不大。来说进展不大。第57页/共68页第五十八页，共68页。2)激光诱导荧光检测激光诱导荧光检测(jin c)LIF LIF是是CE最灵敏的检最灵敏的检测测(jin c)器之一，极大地器之一，极大地拓展了拓展了CE的应用，的应用，DNA测测序就须用序就须用LIF，单细胞和单，单细胞和单分子检测分子检测(jin c)也离不开也离不开LIF。利用。利用CE-LIF技术可检技术可检出染色的单个出染色的单个DNA分子，有分子，有望用于癌症的早期诊断及临望用于癌症的早期诊断及临床酶和免疫学检测床酶和免疫学检测(jin c)等。等。CELIF和微透析结合和微透析结合可测定脑中神经肽。采用波可测定脑中神经肽。采用波长分辨荧光检测长分辨荧光检测(jin c)器器可提供有关蛋白和可提供有关蛋白和DNA序列序列的一些结构和动态信息。一的一些结构和动态信息。一些适用于二极管激光器的荧些适用于二极管激光器的荧光标记试剂如光标记试剂如CY5等，正等，正在不断开发和应用。在不断开发和应用。第58页/共68页第五十九页，共68页。CE/LIF向三个方向发展：在 原 有 氦 镉 激 光 器(325nm)和 氩 离 子 激 光 器(488nm)之外，发展价廉、长波长(bchng)的二极管激光器；发展更多的荧光标记试剂来扩展应用面；开展更多的应用研究。LIF不但提高了灵敏度，也可增加选择性，缺点在于被测物须用荧光试剂标记成染色。第59页/共68页第六十页，共68页。3).CE/MS联用联用 CE/MS联用联用,弥补了弥补了CE定性定性(dng xng)鉴定的不鉴定的不足，故发展特别快。足，故发展特别快。CE/MS联用主要在两方面发展：一联用主要在两方面发展：一是各种是各种CE模式和模式和MS联用，联用，二是二是CE和各种和各种MS联用。关联用。关键是解决接口装置。最早报键是解决接口装置。最早报道道CE/MS联用是采用单级四联用是采用单级四极杆质谱，现已发展到三级极杆质谱，现已发展到三级四极质谱、离子阱质谱等。四极质谱、离子阱质谱等。CE/MS联用特别适合于复杂联用特别适合于复杂生物体系的分离鉴定。因所生物体系的分离鉴定。因所需样品少，目前大部分工作需样品少，目前大部分工作集中在基因工程产品和蛋白集中在基因工程产品和蛋白样品，样品，CE/MS联用现在已成联用现在已成为为CE研究中的热点。研究中的热点。第60页/共68页第六十一页，共68页。4)电化学检测器（电化学检测器（EC）EC可避免光学类检测可避免光学类检测器遇到器遇到(y do)的光程太短的光程太短的问题，故和的问题，故和LIF同为同为CE中中灵敏度最高的检测器。报道灵敏度最高的检测器。报道最