气相色谱法简易教程PPT学习教案.pptx

会计学1气相色谱法简易气相色谱法简易(jiny)教程教程第一页，共94页。背景背景(bijng)n n色谱法也称色层法，是色谱法也称色层法，是色谱法也称色层法，是色谱法也称色层法，是1906190619061906年俄国植物学家年俄国植物学家年俄国植物学家年俄国植物学家Michael TswettMichael TswettMichael TswettMichael Tswett发现并命名的。发现并命名的。发现并命名的。发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开后形成不同的色带而被分开后形成不同的色带而被分开后形成不同的色带而被分开(fn ki)(fn ki)(fn ki)(fn ki)，由此得名为，由此得名为，由此得名为，由此得名为“色谱法色谱法色谱法色谱法”（Chromatography)Chromatography)Chromatography)Chromatography)。n n后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。n n英国生物学家英国生物学家英国生物学家英国生物学家MartinMartinMartinMartin和和和和SyngeSyngeSyngeSynge。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。识的预言。识的预言。识的预言。n n1944194419441944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（HPLCHPLCHPLCHPLC）等。）等。）等。）等。第1页/共94页第二页，共94页。色谱法的基本原理色谱法的基本原理色谱法的基本原理色谱法的基本原理n n色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同布程度不同布程度不同布程度不同(b tn(b tn)，从而使各组分以不同，从而使各组分以不同，从而使各组分以不同，从而使各组分以不同(b(b tntn)的速度移动而达到分离的目的。的速度移动而达到分离的目的。的速度移动而达到分离的目的。的速度移动而达到分离的目的。第2页/共94页第三页，共94页。慢慢中等中等(zhngdng)快快色谱色谱色谱色谱(s p)(s p)分离分离分离分离Temporal course淋洗液淋洗液第3页/共94页第四页，共94页。22.122.1色谱色谱色谱色谱(s p(s p)的基本概念的基本概念的基本概念的基本概念固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。交换等作用。流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动朝着一个方向移动(ydng)(ydng)的液体、气体等，都称的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。称为展层剂。第4页/共94页第五页，共94页。n n分配分配(fnpi)系数系数n n 可由可由Langmuir方程得出方程得出n n Kd-分配分配(fnpi)系数系数n n q、c-溶质在固相和液相中的溶质在固相和液相中的浓度浓度第5页/共94页第六页，共94页。n n保留时间（保留时间（保留时间（保留时间（tRtR）和保留体积（）和保留体积（）和保留体积（）和保留体积（VRVR）n n 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱色谱色谱色谱(s p(s p)过程的基本热力学参数之一。过程的基本热力学参数之一。过程的基本热力学参数之一。过程的基本热力学参数之一。n n 第6页/共94页第七页，共94页。n n分离度分离度分离度分离度:又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相邻的溶质邻的溶质邻的溶质邻的溶质(rngzh)(rngzh)(rngzh)(rngzh)相互分离的程度。相互分离的程度。相互分离的程度。相互分离的程度。两个相邻洗脱峰之间的距离两个相邻洗脱峰之间的距离(jl)(jl)与两个峰宽的代数平均值与两个峰宽的代数平均值.第7页/共94页第八页，共94页。n n阻滞因子阻滞因子RfRfn n 阻滞因子是在色谱系统中溶阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相定相没有亲和力的流动相 Kd=0Kd=0）的迁移率之比）的迁移率之比n n 其意义在于其意义在于(ziy)(ziy)体现某体现某一种溶质与固定相之间的亲和一种溶质与固定相之间的亲和力大小力大小.第8页/共94页第九页，共94页。n n洗脱体积洗脱体积n n 色谱柱中，使溶质色谱柱中，使溶质(rngzh)从柱中流出所需流从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积动相体积，为洗脱体积n n 不同的溶质不同的溶质(rngzh)，由，由于和固定相的亲和力的不同，于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异。洗脱体积也有所差异。第9页/共94页第十页，共94页。n n理论板，理论板当量高度（理论板，理论板当量高度（理论板，理论板当量高度（理论板，理论板当量高度（HETPHETPHETPHETP），理论塔板数（），理论塔板数（），理论塔板数（），理论塔板数（N N N N）、）、）、）、n n 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离(fnl)(fnl)(fnl)(fnl)度与柱高之间的关系。度与柱高之间的关系。度与柱高之间的关系。度与柱高之间的关系。n n理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段。理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段。理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段。理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段。n n理论板当量高度：该段色谱柱的高度。理论板当量高度：该段色谱柱的高度。理论板当量高度：该段色谱柱的高度。理论板当量高度：该段色谱柱的高度。第10页/共94页第十一页，共94页。n n理论理论理论理论(l(l ln)ln)板数的计算方法板数的计算方法板数的计算方法板数的计算方法N-N-理论理论(lln)(lln)塔板数塔板数 tR-tR-保留时保留时间间W1/2-W1/2-半峰宽半峰宽 Wb-Wb-峰底宽度峰底宽度n理论理论(lln)塔板塔板高度：高度：L-柱长柱长第11页/共94页第十二页，共94页。22.2 色谱分离色谱分离(fnl)方法的分类方法的分类色谱分离方法很多，种类有四、五十种但常用于生物(shngw)大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：第12页/共94页第十三页，共94页。第13页/共94页第十四页，共94页。n n按操作形式不同分类：按操作形式不同分类：按操作形式不同分类：按操作形式不同分类：n n柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。个方向移动而达到分离。个方向移动而达到分离。个方向移动而达到分离。n n纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。n n薄层薄层薄层薄层(bo cn)(bo cn)色谱：将适当粒度的吸附色谱：将适当粒度的吸附色谱：将适当粒度的吸附色谱：将适当粒度的吸附剂铺成薄层剂铺成薄层剂铺成薄层剂铺成薄层(bo cn)(bo cn)，以纸色谱类似的，以纸色谱类似的，以纸色谱类似的，以纸色谱类似的方法进行物质的分离和鉴定。方法进行物质的分离和鉴定。方法进行物质的分离和鉴定。方法进行物质的分离和鉴定。n n n n 纸色谱和薄层纸色谱和薄层纸色谱和薄层纸色谱和薄层(bo cn)(bo cn)色谱主要适用色谱主要适用色谱主要适用色谱主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离于小分子物质的快速检测分析和少量分离于小分子物质的快速检测分析和少量分离于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。用的色谱形式，适用于样品分析、分离。用的色谱形式，适用于样品分析、分离。用的色谱形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。用柱色谱形式。用柱色谱形式。用柱色谱形式。第14页/共94页第十五页，共94页。n n按分离的压力按分离的压力(yl)n n 高压色谱高压色谱n n 中压色谱中压色谱n n 低压色谱低压色谱n n按流动相分按流动相分n n 气相色谱气相色谱n n 液相色谱液相色谱n n 超临界流体色谱超临界流体色谱第15页/共94页第十六页，共94页。22.3 22.3 22.3 22.3 各类色谱技术各类色谱技术各类色谱技术各类色谱技术(jsh)(jsh)(jsh)(jsh)及应用及应用及应用及应用 1 1凝胶过滤凝胶过滤(gul(gul)色谱色谱2 2离子交换色谱离子交换色谱3 3疏水色谱疏水色谱4 4聚焦色谱聚焦色谱5 5反相色谱反相色谱6 6超临界流体色谱超临界流体色谱7 7羟基磷灰石色谱羟基磷灰石色谱8 8灌注色谱灌注色谱9 9应用应用第16页/共94页第十七页，共94页。凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤(gul(gul)技术技术技术技术1)Gel filtration chromatography(GFC)1)Gel filtration chromatography(GFC)原原原原理理理理操作与原理：含有不同组分的溶液，通操作与原理：含有不同组分的溶液，通操作与原理：含有不同组分的溶液，通操作与原理：含有不同组分的溶液，通过网状结构的凝胶粒子过网状结构的凝胶粒子过网状结构的凝胶粒子过网状结构的凝胶粒子(a)(a)，小分，小分，小分，小分子扩散进入子扩散进入子扩散进入子扩散进入(jnr)(jnr)凝胶相，大分凝胶相，大分凝胶相，大分凝胶相，大分子被排阻于凝胶相外，加入洗脱子被排阻于凝胶相外，加入洗脱子被排阻于凝胶相外，加入洗脱子被排阻于凝胶相外，加入洗脱剂后溶液向下推移，大分子及剩剂后溶液向下推移，大分子及剩剂后溶液向下推移，大分子及剩剂后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子进入余的小分子进入余的小分子进入余的小分子进入(jnr)(jnr)下层新的下层新的下层新的下层新的凝胶相中，重复上述扩散和排阻。凝胶相中，重复上述扩散和排阻。凝胶相中，重复上述扩散和排阻。凝胶相中，重复上述扩散和排阻。这样最先流出的为最大的分子，这样最先流出的为最大的分子，这样最先流出的为最大的分子，这样最先流出的为最大的分子，最后流出的为最小分子，分段收最后流出的为最小分子，分段收最后流出的为最小分子，分段收最后流出的为最小分子，分段收集可以获得按分子量大小分布的集可以获得按分子量大小分布的集可以获得按分子量大小分布的集可以获得按分子量大小分布的各组分。各组分。各组分。各组分。分子筛色谱分子筛色谱分子筛色谱分子筛色谱:从上可见，凝胶过滤具有从上可见，凝胶过滤具有从上可见，凝胶过滤具有从上可见，凝胶过滤具有分子筛的作用。分子筛的作用。分子筛的作用。分子筛的作用。第17页/共94页第十八页，共94页。第18页/共94页第十九页，共94页。分子筛凝胶色谱分子筛凝胶色谱(s p)原理原理第19页/共94页第二十页，共94页。分离关系分离关系分离关系分离关系(gun x)(gun x)(gun x)(gun x)：组分：组分：组分：组分0 0 0 0的的的的M M M M最大，不能进入最大，不能进入最大，不能进入最大，不能进入gelgelgelgel，洗脱体积为空隙体积，洗脱体积为空隙体积，洗脱体积为空隙体积，洗脱体积为空隙体积V0V0V0V0；组分；组分；组分；组分t t t t的的的的M M M M最小，最小，最小，最小，能进入到能进入到能进入到能进入到gelgelgelgel的细孔中，其洗脱体积接近柱体的细孔中，其洗脱体积接近柱体的细孔中，其洗脱体积接近柱体的细孔中，其洗脱体积接近柱体积积积积Vt,Vt,Vt,Vt,组分组分组分组分1-21-21-21-2在在在在V0-VtV0-VtV0-VtV0-Vt之间之间之间之间.显然，显然，显然，显然，GFCGFCGFCGFC能分能分能分能分离洗脱体积在离洗脱体积在离洗脱体积在离洗脱体积在V0-VtV0-VtV0-VtV0-Vt之间的组分。对于组分之间的组分。对于组分之间的组分。对于组分之间的组分。对于组分1 1 1 1和和和和2 2 2 2，两峰距离，两峰距离，两峰距离，两峰距离分配系数分配系数m影响因素：分子影响因素：分子(fnz)量量,分子分子(fnz)形形状状,gel孔径结构；与孔径结构；与pH,I,T无关无关.第20页/共94页第二十一页，共94页。2)2)2)2)凝胶介质凝胶介质凝胶介质凝胶介质对介质的要求：对介质的要求：对介质的要求：对介质的要求：1st1st1st1st亲水性高；亲水性高；亲水性高；亲水性高；2nd2nd2nd2nd表表表表面面面面惰惰惰惰性性性性(duxng)(duxng)(duxng)(duxng)，不不不不发发发发生生生生化化化化学学学学和和和和物物物物理理理理变变变变化；化；化；化；3rd3rd3rd3rd高稳定性，有较宽的高稳定性，有较宽的高稳定性，有较宽的高稳定性，有较宽的pHpHpHpH和和和和I I I I适应范围；适应范围；适应范围；适应范围；4th4th4th4th具有一定的孔径分布；具有一定的孔径分布；具有一定的孔径分布；具有一定的孔径分布；5th5th5th5th机械强度高，耐高压操作，寿命长。机械强度高，耐高压操作，寿命长。机械强度高，耐高压操作，寿命长。机械强度高，耐高压操作，寿命长。商品化的介质均能满足商品化的介质均能满足商品化的介质均能满足商品化的介质均能满足1-41-41-41-4条的要求。条的要求。条的要求。条的要求。介质的类型：介质的类型：介质的类型：介质的类型：1st 1st 1st 1st SephadexSephadexSephadexSephadex2nd 2nd 2nd 2nd Sephacryl Sephacryl Sephacryl Sephacryl 3rd 3rd 3rd 3rd Superose/-dex,SepharoseSuperose/-dex,SepharoseSuperose/-dex,SepharoseSuperose/-dex,Sepharose4th 4th 4th 4th CelluloseCelluloseCelluloseCellulose5th 5th 5th 5th TSKgelTSKgelTSKgelTSKgel第21页/共94页第二十二页，共94页。第22页/共94页第二十三页，共94页。凝胶介质特征参数凝胶介质特征参数凝胶介质特征参数凝胶介质特征参数排排排排阻阻阻阻极极极极限限限限(jxin)(exclusion(jxin)(exclusion(jxin)(exclusion(jxin)(exclusion limit)limit)limit)limit)：指指指指不不不不能能能能扩扩扩扩散散散散到到到到凝凝凝凝胶胶胶胶网网网网络络络络内内内内部部部部的的的的最最最最小小小小分分分分子子子子的的的的M M M M。如如如如，Sephadex Sephadex Sephadex Sephadex G50G50G50G50的排阻极限的排阻极限的排阻极限的排阻极限(jxin)(jxin)(jxin)(jxin)为为为为30kD30kD30kD30kD。分分分分级级级级范范范范围围围围(fractionation(fractionation(fractionation(fractionation range)range)range)range)：能能能能阻阻阻阻滞滞滞滞组组组组分分分分并并并并且且且且使使使使组组组组分分分分相相相相互互互互之之之之间间间间得得得得到到到到分分分分离离离离的的的的组组组组分分分分分分分分子子子子量量量量范范范范围围围围。如如如如，Sephadex G50Sephadex G50Sephadex G50Sephadex G50的分级在的分级在的分级在的分级在1.5-30KD1.5-30KD1.5-30KD1.5-30KD内。内。内。内。溶胀率溶胀率溶胀率溶胀率/吸水率：吸水率：吸水率：吸水率：如，如，如，如，Sephadex G50Sephadex G50Sephadex G50Sephadex G50的溶胀率的溶胀率的溶胀率的溶胀率=500 30%=500 30%=500 30%=500 30%。第23页/共94页第二十四页，共94页。凝凝胶胶粒粒径径：软软gelgel粒粒径径较较大大，在在50-15050-150 m m之之间间；硬硬gelgel较较小小，在在5-505-50 m m之之间间。粒粒径径越越小小，HETPHETP越越小小，分离效率越高。分离效率越高。床床体体积积(bed(bed volume)volume)：1g1g干干燥燥gelgel溶溶胀胀后后所所占占有有的的体体积积。如如，Sephadex Sephadex G50G50的的床床体体积积为为9-11 9-11 cm3/gcm3/g干胶。干胶。空空隙隙体体积积(void(void volume)volume)：凝凝胶胶之之间间的的空空隙隙体体积积，即即V0V0。空空隙隙体体积积一一般般用用平平均均(pngjn)(pngjn)分分子子量量在在2000KD2000KD水水溶溶性蓝葡聚糖性蓝葡聚糖(blue dextran)(blue dextran)测定。测定。第24页/共94页第二十五页，共94页。4)4)4)4)影响影响影响影响GFCGFCGFCGFC分离特性的因素分离特性的因素分离特性的因素分离特性的因素线速度：线速度：线速度：线速度：1st 1st 1st 1st HW40FHW40FHW40FHW40F凝凝凝凝胶胶胶胶的的的的排排排排阻阻阻阻极极极极限限限限小小小小，在在在在该该该该凝凝凝凝胶胶胶胶中中中中蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的m m m m=0 0 0 0，故故故故HETP HETP HETP HETP=2Dz/u 2Dz/u 2Dz/u 2Dz/u(Dz(Dz(Dz(Dz udp)=udp)=udp)=udp)=常数。常数。常数。常数。2nd 2nd 2nd 2nd HW55FHW55FHW55FHW55F凝凝凝凝胶胶胶胶的的的的排排排排阻阻阻阻极极极极限限限限较较较较大大大大，在在在在此此此此，m m m m 0,0,0,0,HETP HETP HETP HETP u;u;u;u;在在在在u u u u=0 0 0 0处处处处，直直直直线线线线交交交交于点于点于点于点 2Dz/u 2Dz/u 2Dz/u 2Dz/u。3rd 3rd 3rd 3rd 当当当当u u u u 0.2 0.2 0.2 0.2 cm/min,cm/min,cm/min,cm/min,NaClNaClNaClNaCl的的的的 HETPHETPHETPHETP随随随随 流流流流 速速速速 降降降降 低低低低(jingd)(jingd)(jingd)(jingd)急急急急剧剧剧剧增增增增大大大大。这这这这主主主主要由于分子的扩散影响。要由于分子的扩散影响。要由于分子的扩散影响。要由于分子的扩散影响。第25页/共94页第二十六页，共94页。进样体积：进样体积：进样体积：进样体积：1st 1st 1st 1st 在在在在一一一一定定定定相相相相对对对对料料料料液液液液体体体体积积积积范范范范围围围围内内内内，HETPHETPHETPHETP为常数；为常数；为常数；为常数；2nd 2nd 2nd 2nd 但但但但一一一一定定定定时时时时间间间间之之之之后后后后，HETPHETPHETPHETP随随随随料料料料液液液液相相相相对体积的增加而急剧增大。对体积的增加而急剧增大。对体积的增加而急剧增大。对体积的增加而急剧增大。3rd 3rd 3rd 3rd 意意意意义义义义：为为为为得得得得到到到到较较较较高高高高的的的的分分分分离离离离度度度度，料料料料液液液液体体体体积积积积需需需需根根根根据据据据溶溶溶溶质质质质的的的的m m m m差差差差别别别别控控控控制制制制在在在在适适适适当当当当的的的的范范范范围围围围内内内内，在在在在不不不不影影影影响响响响分分分分离离离离度度度度的前提下取最大值。的前提下取最大值。的前提下取最大值。的前提下取最大值。料液浓度料液浓度料液浓度料液浓度依依依依据据据据(yj)GFC(yj)GFC(yj)GFC(yj)GFC的的的的原原原原理理理理，trtrtrtr和和和和HETPHETPHETPHETP与与与与浓浓浓浓度度度度无无无无关关关关。但但但但实实实实验验验验表表表表明明明明，当当当当浓浓浓浓度度度度较较较较高高高高时时时时，洗洗洗洗脱脱脱脱曲曲曲曲线线线线出出出出现现现现吐吐吐吐舌舌舌舌、拖拖拖拖尾尾尾尾、甚甚甚甚至至至至双双双双峰峰峰峰；使使使使HETPHETPHETPHETP极极极极度度度度上上上上升升升升。这这这这主主主主要要要要为为为为样样样样品品品品黏黏黏黏度度度度高高高高造造造造成成成成。经经经经验验验验表表表表明明明明，料料料料液液液液与与与与流流流流动动动动相相相相的的的的黏黏黏黏度度度度比应控制在比应控制在比应控制在比应控制在2 2 2 2以内。以内。以内。以内。第26页/共94页第二十七页，共94页。分子量分子量分子量分子量M M M M和分配系数和分配系数和分配系数和分配系数(xsh)m(xsh)m(xsh)m(xsh)m1st 1st 1st 1st 在在在在GFCGFCGFCGFC分分分分级级级级范范范范围围围围内内内内m m m m与与与与M M M M关关关关系系系系 此时，分离度方程为此时，分离度方程为此时，分离度方程为此时，分离度方程为 方方方方程程程程示示示示：b b b b值值值值越越越越大大大大，即即即即凝凝凝凝胶胶胶胶分分分分级范围越小，级范围越小，级范围越小，级范围越小，RsRsRsRs越大。越大。越大。越大。2nd 2nd 2nd 2nd 因因因因此此此此，一一一一定定定定料料料料液液液液时时时时，根根根根据据据据组组组组分分分分的的的的M M M M选选选选择择择择分分分分级级级级范范范范围围围围较较较较小小小小的的的的介介介介质质质质，提提提提高高高高RsRsRsRs和和和和料料料料液液液液的的的的处理量。处理量。处理量。处理量。第27页/共94页第二十八页，共94页。凝胶的粒径凝胶的粒径凝胶的粒径凝胶的粒径1st 1st dpdp,HETPHETP.故故故故dpdp是是是是NN的的的的最最最最佳佳佳佳(zu ji)(zu ji)途径；途径；途径；途径；2nd dp2nd dp1010倍倍倍倍,而而而而h h和和和和v v不变，不变，不变，不变，u u1010倍，倍，倍，倍，HETP(=hdp)HETP(=hdp)1010倍，倍，倍，倍，R R1010倍倍倍倍第28页/共94页第二十九页，共94页。5 5）应用）应用）应用）应用1st 1st 分离纯化分离纯化分离纯化分离纯化MM：x0-106x0-106，d:0.x-x00nmd:0.x-x00nm之间；之间；之间；之间；种种种种类类类类：肽肽肽肽、脂脂脂脂质质质质、抗抗抗抗生生生生素素素素、糖、核酸、病毒糖、核酸、病毒糖、核酸、病毒糖、核酸、病毒(50-400nm)(50-400nm)。2nd 2nd 除热原、过敏原除热原、过敏原除热原、过敏原除热原、过敏原如如如如青青青青霉霉霉霉噻噻噻噻唑唑唑唑蛋蛋蛋蛋白白白白(dnbi)(dnbi)Sephadex G25Sephadex G25凝胶柱。凝胶柱。凝胶柱。凝胶柱。3rd3rd脱盐脱盐脱盐脱盐/置换置换置换置换bufferbuffer第29页/共94页第三十页，共94页。4th M4th M4th M4th M测定测定测定测定原理：原理：原理：原理：挑挑挑挑 选选选选(tioxun)(tioxun)(tioxun)(tioxun)标标标标 准准准准 蛋蛋蛋蛋 白白白白 质质质质：cyt cyt cyt cyt C(12500),C(12500),C(12500),C(12500),Mb(16900),Mb(16900),Mb(16900),Mb(16900),胰胰胰胰凝凝凝凝乳乳乳乳蛋蛋蛋蛋白白白白(23200),(23200),(23200),(23200),卵卵卵卵白白白白蛋蛋蛋蛋白白白白(45000)(45000)(45000)(45000)和和和和Hb(64500).Hb(64500).Hb(64500).Hb(64500).条件：在凝胶介质分级范围内条件：在凝胶介质分级范围内条件：在凝胶介质分级范围内条件：在凝胶介质分级范围内.作图：作图：作图：作图：第30页/共94页第三十一页，共94页。6 6 6 6）优点）优点）优点）优点1st 1st 1st 1st 如如如如其其其其他他他他色色色色谱谱谱谱相相相相比比比比，操操操操作作作作简简简简便便便便，介介介介质质质质价价价价廉廉廉廉易易易易得得得得；适适适适合合合合于大规模生产；于大规模生产；于大规模生产；于大规模生产；2nd 2nd 2nd 2nd 溶溶溶溶质质质质和和和和介介介介质质质质不不不不发发发发生生生生任任任任何何何何形形形形式式式式的的的的相相相相互互互互作作作作用用用用，故故故故操操操操作作作作条条条条件件件件(tiojin)(tiojin)(tiojin)(tiojin)温和，回收率接近温和，回收率接近温和，回收率接近温和，回收率接近100%100%100%100%；3rd 3rd 3rd 3rd 分分分分离离离离结结结结束束束束后后后后，无无无无须须须须对对对对分分分分离离离离介介介介质质质质进进进进行行行行清清清清洗洗洗洗和和和和再再再再生生生生，故故故故容易实施循环操作，提高产品纯度；容易实施循环操作，提高产品纯度；容易实施循环操作，提高产品纯度；容易实施循环操作，提高产品纯度；4th4th4th4th作作作作为为为为脱脱脱脱盐盐盐盐手手手手段段段段，GFCGFCGFCGFC比比比比透透透透析析析析法法法法速速速速度度度度快快快快，精精精精度度度度高高高高；与超滤相比，剪切力小，蛋白质的回收率高。与超滤相比，剪切力小，蛋白质的回收率高。与超滤相比，剪切力小，蛋白质的回收率高。与超滤相比，剪切力小，蛋白质的回收率高。5th 5th 5th 5th 分离机理简单，操作参数少，易于放大。分离机理简单，操作参数少，易于放大。分离机理简单，操作参数少，易于放大。分离机理简单，操作参数少，易于放大。7 7 7 7）缺点）缺点）缺点）缺点1st 1st 1st 1st 分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少；分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少；分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少；分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少；2nd 2nd 2nd 2nd 经经经经GFCGFCGFCGFC洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。第31页/共94页第三十二页，共94页。离子交换离子交换(l z jio hun)色谱色谱n n以离子交换树脂(shzh)作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法第32页/共94页第三十三页，共94页。原理原理 (ion exchanger chromatography,IEC)1st 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数荷电溶质在离子交换剂上的分配系数m I-离离子子强强度度；A和和B为为常常数数,均均为为pH的的函函数数，在在物物理理意意义义(yy)上上，B为为溶溶质质的的静静电电荷荷数数与与交交换换剂剂的的离离子子价价数数之之比比(对对于于pro,一一般般大大于于10)。m-离离子子强强度度无无限限大大时时的的溶溶质质分分配配系系数数,为为静静电电作作用用外外的非特异性吸附引起的溶质在交换剂上分配。的非特异性吸附引起的溶质在交换剂上分配。2nd 意义意义(yy)：对于：对于pro.和和aa调节调节I value调节调节|pH pI|value第33页/共94页第三十四页，共94页。常用的离子交换常用的离子交换(l z jio hun)树脂树脂n n葡聚糖凝胶型 n n DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25n n纤维素系列(xli)离子交换剂n n DEAE-Sephacel Cellex系列(xli)n n琼脂糖系列(xli)离子交换剂n n Sepharose系列(xli)Sepharose CL-6B,Sepharose Fast Flown n Bio-Gel A 系列(xli)交联琼脂糖离子交换剂第34页/共94页第三十五页，共94页。n nSource 系列(xli)离子交换剂n n特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低n n阳离子交换树脂 S系列(xli)n n阴离子交换树脂 Q系列(xli)n nMonoBeads 系列(xli)离子交换剂（Pharmacia）n n特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列(xli)相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。n n同样分为Q系列(xli)和P系列(xli)第35页/共94页第三十六页，共94页。Mini Q PC 3.2/3:Glutathione synthetaseSDS-PAGEStarting materialPeak 2第36页/共94页第三十七页，共94页。操作操作1st 恒定洗脱恒定洗脱(Sephadex常用常用)缺点缺点(qudin)：洗脱体积大：洗脱体积大,溶质洗脱不尽溶质洗脱不尽第37页/共94页第三十八页，共94页。2nd 线性梯度洗脱线性梯度洗脱(linear gradient elution)线性梯度洗脱的优缺点线性梯度洗脱的优缺点优优点点：流流动动相相I/pH 连连续续变变化化，不不易易出出现现干干扰扰峰峰，操作范围广；操作范围广；缺缺点点：需需要要(xyo)特特殊殊的的浓浓度度梯梯度度设设备备，如如梯梯度混合器。度混合器。第38页/共94页第三十九页，共94页。3 rd 阶梯阶梯(jit)洗脱法洗脱法(stepwise elution)优点：无须特殊优点：无须特殊(tsh)设备，操作简单；设备，操作简单；缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。分洗脱峰重叠的现象。第39页/共94页第四十页，共94页。线性洗脱时间定义(dngy)：GHdI/dV-离子强度梯度(mol/l)，F-流动相流量(l/s).利用GH和Ip关系图及上述方程，可算tr第40页/共94页第四十一页，共94页。分离度和柱效分离度和柱效1st 分离度分离度意义意义(yy)：4因因素可控制素可控制2nd 柱效柱效意义意义(yy)：I+dIImi富集效应富集效应(xioyng)第41页/共94页第四十二页，共94页。应用应用应用应用(yngyng)(yngyng)：第42页/共94页第四十三页，共94页。疏水性疏水性疏水性疏水性(shu(shu xng)xng)吸附色谱吸附色谱吸附色谱吸附色谱(hydrophobic interaction(hydrophobic interaction chromatography,HIC)chromatography,HIC)原理原理1)吸附吸附1st pro疏水性疏水性2nd pro稀疏水性差异稀疏水性差异3rd 原原 有有 吸吸 附附 介介 质质(jizh)的亲水性的亲水性4th 亲亲 水水 性性 介介 质质(jizh)的改造的改造第43页/共94页第四十四页，共94页。第44页/共94页第四十五页，共94页。第45页/共94页第四十六页，共94页。2)2)影响影响影响影响propro水化层因素水化层因素水化层因素水化层因素1st 1st 水化层水化层水化层水化层(hydration shell)(hydration shell)tight tight hydration hydration shell(0.35g shell(0.35g water/1g pro)water/1g pro)loose loose hydration hydration shell(2g shell(2g water water/1g/1g pro)pro)2nd ionic strength2nd ionic strength3rd|pH3rd|pH水水水水 pI|Value pI|Value|pH|pH水水水水 pI|pI|ValueValue zetazeta电电电电势势势势 水化层水化层