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3复旦大学青年科学基金资助项目通讯作者E2mail:qwjiang ;电话:021-54237216浙江省某农村地区猪粪便与胆汁中戊型肝炎病毒的检测和部分序列分析3张潇郑英杰王法弟高眉扬朱建福姜庆五(复旦大学公共卫生学院流行病学教研室-公共卫生安全教育部重点实验室 上海 200032;浙江省德清县疾病预防控制中心313200)【摘要】目的 调查浙江省某农村地区猪群中戊型肝炎病毒的感染状况,探讨猪戊型肝炎病毒与人戊型肝炎病毒的关系。方法 应用逆转录-巢式聚合酶链法(RT2nPCR)对当地某养猪场的猪粪便标本和生猪屠宰中心的猪胆汁标本进行HEV RNA的检测,并对部分阳性标本进行克隆测序和序列分析。结果 132份猪粪便标本中13份为HEV RNA阳性,阳性率为9.85%;160份猪胆汁标本中有11份为阳性,阳性率为6.88%。序列分析发现猪HEV相互之间在ORF2部分区域(nt63176466)的核苷酸序列的同源性为90.0%100.0%,与当地人株核苷酸序列的同源性为88.7%100.0%,与、和 型的同源性分别为78.7%84.0%,80.0%85.3%,76.0%83.3%和84.7%95.3%。结论 该地区猪HEV与当地人HEV同属HEV 型。【关键词】戊型肝炎病毒;基因型;人兽共患性疾病【中国图书馆分类法分类号】R 512.6Detection and Analysis of Partial Sequences Isolated from Swinein Rural Area of Zhejiang ProvinceZHANG Xiao,ZHENG Ying2jie,WANG Fa2di,GAO Mei2yang,ZHU Jian2fu,Jiang Qing2wu(Department of Epidemiology,School of Public Health,Fudan University2Key Laboratory of Public Health Safety,Ministry of Education,Shanghai20003;Center of Disease Control,Deqing County,Zhejiang313200,China)【Abstract】PurposeTo investigate the HEV infection in swine and the genotype relationship betweenswine HEV and human HEV.MethodsHEV RNA was detected using RT2nPCR with ORF2 primers.The positive PCR products were cloned and sequenced.ResultsTotally 13 of 132(9.85%)pigsstoolsamples,11 of 160 pigsbile samples were positive for HEV RNA.The sequence analysis showed that the i2dentity at nucleotide level was 90.0%100.0%among them.They had 88.7%100.0%homology atthe nucleotide level with the HEV isolated from local people.They shared 78.7%84.0%,80.0%85.3%,76.0%83.3%and 84.7%95.3%nucleotide sequence identity with HEV genotype I,and,respectively,in the region(nt63176466).ConclusionsThe hepatitis E virus circulated in humanand swine in the area belonged to genotype.【Key words】hepatitis E virus;genotype;zoonosis 戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)发现于20世纪70年代末期,以往被称作肠道传播的非甲非乙型肝炎病毒,最近,国际病毒分类委员会(ICTV)第8次报告建议将HEV暂归入一个独立的科:戊型肝炎病毒样病毒科1。HEV是一种单股正链无包膜的RNA病毒,HEV RNA全长为7.27.6 kb,包含3个互相重叠的开放阅读框架(ORF1、ORF2和ORF3)。HEV主要通过粪2口途径传播,685复旦学报(医学版)Fudan Univ JMed Sci2005 Sep.,32(5)常因污染水和食物引起戊型肝炎(Hepatitis E,简称戊肝)的爆发和流行。戊肝是一种急性传染性疾病,临床症状类似于甲肝,但表现为重症肝炎的比例较高,而且孕妇易感,病死率可高达21%2,严重危害人类健康。近年来,大量研究表明戊肝是一种人畜共患性疾病,HEV在自然环境中广泛存在,多种动物可能是HEV的储存宿主,其中猪是研究较多的一种。我国是戊型肝炎流行区,调查20个省、市、自治区发现,各地猪群均存在HEV感染的现象,抗2HEV抗体阳性率为68%100%3。本次研究所调查的浙江某农村地区的生猪屠宰销售人员的戊肝感染率为77.25%,高于当地一般人群4。为了解该地区猪中戊型肝炎病毒的感染情况、猪HEV的基因型和当地猪株与当地人株及其他HEV分离株之间的关系,收集该地区某养猪场的猪粪便标本和某生猪屠宰中心的猪胆汁标本,检测其中的HEVRNA,并对部分阳性PCR产物进行克隆测序及序列分析。材 料 和 方 法样本来源及处理 采集浙江某农村地区某养猪场的猪粪便标本,共132份。粪便标本用PBS稀释,制成10%的悬液(W/V),4、12 000 r/min离心15 min,取上清,以0.22m滤膜过滤,将滤液储存于-70 备用。收集当地某生猪屠宰中心新鲜屠宰的猪胆囊,共160个。抽取胆汁,4、12 000 r/min离心15 min,取上清,储存于-70 备用。简并引物的合成 根据文献,参考戊型肝炎病毒缅甸株(GeneBank录入号:D10330),针对HEV的ORF2合成一套简并引物,由上海博亚公司合成。该引物扩增的目的片段长度为150 bp。外正向引物E1:5 2CTGTTTAAYCTTGCTGACAC23(nt62606279);外 反 向 引 物E5:5 2WGARAGC2CAAAGCACATC23(nt65686551);内正向引物E2:5 2GACAGAATTGATTTCGTCG23(nt62986316);内 反 向 引 物E421:5 2TGTTGGTTRT2CATAATCCTG23(nt64866467),E424:5 2TGCTGGTTATCGTAATCCTG23(nt64866467)。其中,Y代表T或C,W代表A或T,R代表A或G。使用时,将E421和E424等量混合后作为内反向引物。HEV RNA的提取及RT2nPCR检测 采用逆转录2巢式聚合酶链反应(RT2nPCR)的方法,猪粪便标本和猪胆汁标本进行HEV RNA的检测。取250L粪便滤液/胆汁,用上海华舜生物工程有限公司生产的小量柱离心式病毒RNA/DNA抽提试剂盒提取HEV RNA,得到30L纯化的HEV RNA水溶液。用大连宝生物工程有限公司的RT2PCR试剂盒(Ver3.0)检测HEV RNA。RT反应液的组成为:纯化的HEV RNA 4.75L,10RT buffer 1L,MgCl2(25 mM)2L,dNTP Mixture(10mMeach)1L,E5(20 pmol/L)0.5L,AMV反转录酶(5 U/L)0.5L,RNA酶抑制剂(40 U/L)0.25L,总体积为10L,42 反转录1 h,995 min灭活反转录酶。第一轮PCR反应液组成为:反转录模板5L,5PCR buffer 5L,E1(20 pmol/L)0.25L,Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.125L,最后用超纯水调整总体积至25L;94 预变性5 min,94变性30 s,53 复性30 s,72 延伸40 s,35个循环,72 延伸5 min。第二轮PCR反应液组成为:第一轮PCR产物2L,5PCR buffer 5L,MgCl21L,dNTP 0.5L,E2、E4(均为20 pmol/L)各1L,Taq DNA聚合酶0.125L,最后用超纯水调整总体积至25L;循环同第一轮PCR。反应结束后,取5L以2%琼脂糖凝胶电泳检测。克隆及测序 对阳性的反应产物用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收纯化,连接入pMD182T载体(大连宝生物工程有限公司),由上海博亚公司进行序列测定。序列分析 采用ClustalX对所获得的核苷酸序列进行对齐分析,由Treeview生成基因进化树,并用DNAstar计算序列的同源性。同源性分析参比的序列如下(括号中为Genebank录入号):HEV型代 表 序 列 为 缅 甸 株Bur1(M73218)和Bur2(D10330),巴基斯坦株SAR255(M80581),中国株Uigh179(D11093)、Chi1(L25547)、Chi2(M94177)和Lan(AF141652),印度株Ind1(X98292)和Ind2(X99441),摩洛哥株Morocco(AY230202),乍得株Chad(AY204877);型代表序列为Mex(M74506);型代表序列为美国人株US1(AF060668)和US2(AF060669),美国猪株US2sw(AF082843),加拿大猪株Canada2sw(AY115488),日 本 鹿 株JDEER(AB189071),日本野猪株JBOAR1(AB189070),日本人株J TH2Hyo03L(AB189074);型代表序列为中国 A亚型人株T1(AJ272108),中国 B亚型人株T11(AF151962)和T21(AF151963),中国长春 人 株CCC220(AB108537),中 国 新 疆 猪 株swCH25(AY594199),日 本 型 人 株JA1(AB097812)和猪株swJ13(AB097811)。785 张潇,等.浙江省某农村地区猪粪便与胆汁中戊型肝炎病毒的检测和部分序列分析结 果HEV RNA检测 检测132份猪粪便标本和160份猪胆汁标本中的HEV RNA,结果猪粪便标本中有13份为阳性,阳性率为9.85%,猪胆汁标本中有11份为阳性,阳性率为6.88%。序列分析 对部分阳性PCR产物进行克隆和测序,共获得7株猪HEV,其中S7、S19、S23、S45、S65和P55等6株来自猪粪便标本,CZB4来自猪胆汁标本。对所扩增的ORF2的部分序列进行分析,这7株猪HEV相互之间的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为90.0%100.0%和100.0%。同年我室从当地一般人群中分离到4株HEV,分别为A7、A12、B8和C87,并从急性戊肝患者中分离到1株HEV,为ZZG。将该地区的HEV猪株与人株进行分析比较,其核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为88.7%100.0%和100.0%。其中S19、S23、P55和B8的核苷酸序列(nt63176466)完全相同,S7、S65、C87和ZZG的核苷酸序列(nt63176466)完全相同,S19、S23、S45、P55、B8、S45和CZB4的核苷酸序列同源性 96%,S7、S65、C87、ZZG、A7和A12的核苷酸序列同源性 96%,而这两组间的核苷酸序列同源性为88.7%92.7%。将本研究获得的猪HEV分离株与HEV I 型的代表株进行比较,与、和 型的ORF2的部分核苷酸序列(nt63176466)的同源性分别为78.7%84.0%,80.0%85.3%,76.0%83.3%和84.7%95.3%,与 型HEV的同源性较高。这7株猪HEV分离株与HEV 型各代表株的同源性见表1,其中S19、S23、S45、P55和CZB4与各代表株在核苷酸水平上的同源性为87.3%92.0%,S7和S65与 B亚型人株T11和T21的同源性较高,为95.3%,与 型HEV的其他代表株的同源性为84.7%92.0%。在基因进化树中,、和 型的代表株各自构成一个主要的分枝,本次研究所获得的猪HEV分离株均在 型HEV的分枝上,其中,S7、S65,当地一般人群分离株A7、A12、C87及当地急性戊肝患者分离株ZZG,B亚型代表株T11、T21在同一分枝上,S19、S23、P55、S45和B8共同构成另一小分枝,而新疆猪株swCH25与 A亚型代表株T1、中国长春急性戊肝患者HEV分离株CCC220与日本 型人株JA1和猪株swJ13各自构成一个小分枝,见图1。表1 浙江某农村地区猪HEV分离株ORF2部分序列与HEV 型代表株的同源性比较Tab 1Comparison of the nucleotide and deduced amino acid sequences of theswine HEV with human HEV strains(%)StrainCZB4P55/S19S23S7/S65S45T1swCH25T11T21CCC220JA1swJ13CZB497.390.096.787.389.388.790.789.3P55/S19/S23100.092.799.388.792.091.390.789.3S7/S65100.0100.092.084.792.095.390.090.7S45100.0100.0100.088.091.392.090.088.7T1100.0100.0100.0100.092.086.085.388.7swCH25100.0100.0100.0100.0100.088.087.389.3T11/T21100.0100.0100.0100.0100.0100.088.788.0CCC220100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.091.3JA1/swJ13100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0Note:The values represent the percent identities of the nucleotide(above the diagonal)and amino acid(below the diagonal)sequences for ORF2讨 论戊型肝炎是新发现的一种传染病,近年来,人畜共患性一直是戊型肝炎研究的热点。1997年,美国首次分离到猪HEV,它与美国人HEV属于同一基因型,并且两者有较高的同源性5。2003年,研究人员使用原位杂交法从自然感染的猪的多种器官中检测到HEV,包括肝脏、胆管、大肠、小肠、扁桃腺、淋巴结、脾脏和肾脏6。同年日本报道一起因食用感染HEV的鹿肉引起的戊肝爆发,这为戊型肝炎可从动物传播给人提供了直接证据7。我国是戊型肝炎的流行区,主要存在HEV 型和 型两种基因型8,目前国内分离的猪HEV主要为HEV型9。本次研究从浙江某农村地区的养猪场的猪粪便885复旦学报(医学版)2005年9月,32(5)图1HEVORF2部分核苷酸序列的基因进化树(nt63176466)Fig 1Phylogenetic tree based on the partial nucleotide sequences(nt63176466)of ORF2 of swine HEVand human HEV strains和生猪屠宰中心的猪胆汁中检测到HEV RNA,并且同属于HEV 型。这7株猪HEV与1株当地急性该病患者的HEV分离株及4株当地一般人群的HEV分离株共同构成 型HEV的两个亚型,其中之一属于 B亚型,由于 C亚型和 D亚型未在nt63176466区域扩增和测序,因此无法确定另一亚型属于已知的亚型还是新的亚型,同一亚型内的各株HEV间均有较高的同源性。研究结果表明该地区的猪群中存在戊型肝炎病毒感染,并且猪HEV与当地人HEV有较近的亲缘关系,提示猪群可能是HEV的动物宿主之一,感染HEV的猪有可能作为传染源通过粪便排毒污染环境或通过含有HEV的肉制品引起戊型肝炎的爆发与流行。因此采取相应的措施切断戊型肝炎从猪到人的传播,可能会有利于控制该病的流行。戊型肝炎的分布有一定的区域性,同一地区的人与动物的基因型大多相同。我国存在 型HEV人株,但目前国内外均无 型HEV猪株的报道,该地区也尚未分离到 型HEV人株,猪是否存在 型HEV的感染以及该地区是否存在 型HEV人株,有待于深入研究。参 考 文 献1Berke T,Matson DO.Reclassification of the Caliciviridae into distinctgenera and exclusion of he2patitis E virus from the family on the ba2sis of comparative phylogenetic analysis.Arch Virol,2000,145:14212Zhuang H.Hepatitis E in China.J Gastroenterol Hepatol,2000,15:723 葛胜祥,田克恭,多海刚,等.中国不同地区猪群中戊型肝炎病毒感染情况调查.中国人兽共患病杂志,2003,19(2):1084 曹海俊,王法弟,高眉扬,等.生猪屠宰销售职业人群戊型肝炎病毒感染的危险因素研究.中国人兽共患病杂志,2004,20(7):6075Meng XJ,Purcell RH,Halbur PG,et al.A novel virus in swine isclosely related to the human hepatitis E virus.Proc Natl Acad SciUSA,1997,94:98606Choi C,Chae C.Localization of swine hepatitis E virus in liver andextrahepatic tissues from naturally infected pigs by in situ hybridiza2tion.J Hepatol,2003,38:8277Tei S,Kitajima N,Takahashi K,et al.Zoonotic transmission of he2patitis E virus from deer to human beings.Lancet,2003,362:3718Wang YC,Ling R,Erker JC,et al.A divergent genotype of hepatitisE virus in Chinese patients with acute hepatitis.J Gen Virol,1999,80:1699 马勋,陆承平.新疆猪粪便戊型肝炎病毒RNA的检测及序列分析.中国病毒学,2004(8):360(收稿日期:2005-02-28;编辑:张秀峰)985 张潇,等.浙江省某农村地区猪粪便与胆汁中戊型肝炎病毒的检测和部分序列分析