共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理.pptx
共聚焦激光扫描荧光显微镜 什么是什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？共聚焦激光扫描荧光显微镜？共聚焦激光扫描荧光显微镜共聚焦激光扫描荧光显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM）以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统显微镜系统共聚焦系统 细胞CT 荧光和荧光显微镜一、荧光的基础术语荧光物质：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线 荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素激发光(EXCITATION)：能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长)488nm 520nm异硫氰酸荧光素(FITC)发射光(EMISSION):发射光谱；发射波峰(最大发射波长)荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料（PI,Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光自发荧光。漂白(BLEACH)：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 漂白。二、荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜激发滤镜：激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。从光源中分滤出一定波长范围的激发光。带通滤色镜带通滤色镜(BP)BP)：有宽、窄带之分。如：有宽、窄带之分。如：BP450-490BP450-490 长、短通滤色镜组合长、短通滤色镜组合（LP LP+KPKP）：）：LP450+KP490LP450+KP490 双色镜：双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：阻断滤镜：多为长通滤色镜；多为长通滤色镜；LP490LP490紫外蓝绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光488nm 520nmFITC450nm 490nm荧光显微镜的不足:1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的同时采集及共定位。2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度荧光强度不够。6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠7.只能在二维环境下观察。8.样品不能太厚。9.荧光的串绕无法回避。10.放大倍率小。共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置Laserand electronicControl Unit激光光源及控制装置Computer计算机Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置Microscope荧光显微镜Anti-vibration table防震台Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System1.1.典型产品典型产品Nikon的 Eclipse C1 PlusNikonNikon的的 Eclipse C1 PlusEclipse C1 Plus1.性能卓越的平场复消色差TIRF物镜（60 x，100 x），NA=1.49.。这是当前数值孔径最高的油浸物镜2.四孔位针孔转盘：用电脑控制针孔的大小，可在分辨率和光切厚度之间取得最佳平衡。3.时间间隔可变的Time Lapse:可以在拍摄过程中不同的时间段采用不同的时间间隔。2.2.基本组成基本组成一、基本组成（一）激光器激光器:多线氩离子(458 nm,488 nm,514 nm)、氦氖绿(543nm)、氦氖红(633 nm)（二）扫描器扫描器(内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单色器及检测器)（三）光学装置：光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、大小及分布，调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT）的检测范围、物镜和电子放大倍数（zoom），以利于采集各种荧光信号。（四）计算机图像存储与处理及控制系统：计算机图像存储与处理及控制系统：实现了图像的优化、三维重建，实现了全自动程序化控制采集（检测）样品荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中多重荧光信号的分解及合成图像，对其进行定量测定。3.3.优点优点一一.分辨率分辨率（0.1 8m）二二.可可重构样品的重构样品的三维结构三维结构三三.无无损伤、连续光学损伤、连续光学切片切片四四.光谱扫描光谱扫描（分辨由光源波长，物镜参数和针孔直径等决定，如60X，NA1.4的物镜水平分辨率约为0.2 m，垂直分辨率约为0.5m。）（细菌细胞1-2 m，原核生物细胞1-10 m）优点优点4.4.共聚焦原理共聚焦原理利用照明针孔和探测针孔实现点照明和探测，并且被探测点位于焦平面。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点。共聚焦原理共聚焦原理共聚焦原理共聚焦原理1.点照明（为作图方便已将光线发散角放大）共聚焦原理共聚焦原理 假设是场照明（非共聚焦），会导致：一.发生衍射，使像模糊；二.散射光干扰（即除了成像点外，其余 点处有散射光进入探测针孔）；而点照明则不会有这些问题。共聚焦原理共聚焦原理消除衍射影响消除衍射影响消除背景杂光消除背景杂光共聚焦原理共聚焦原理2.焦平面点成像共聚焦原理共聚焦原理焦平面上的像是最清晰的，从上面的图可以看出，非焦平面点所成 的像的光像被探测针孔挡住，不会进入光探头，所以焦平面点成像使像更清晰。共聚焦原理共聚焦原理所以共聚焦成像方式可以很大的所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像质量。提高分辨率和成像质量。5.5.扫描模式扫描模式一.XY轴扫描二.Z轴扫描XYXY轴扫描轴扫描（1）单光束扫描模式其中最常见的扫描安排结合了两个独立的扫描镜，具有中继光学系统。移动的垂直轴的反射镜即在试样上产生XY平面的扫描。但中间需要增加高级别的像差校正光学系统，导致发光效率降低。XYXY轴扫描轴扫描（1）单光束扫描模式XYXY轴扫描轴扫描（2）多光束扫描（尼普可夫圆盘扫描）多光束扫描技术提供了一个替代的单光束扫描配置照明效率低，而且扫描速度更快。其中旋转盘扫描仪有数百个孔，其功能作为照明和探测的针孔。由于磁盘扫描显微镜形成的实像，可以直接位于CCD照相机的图像平面中。尽管这方面的优势，它允许实时聚焦和成像的动态过程，有几个缺点限制了磁盘扫描共聚焦系统的实际效用。其中最严重的是典型的依赖于传统的广谱光源，和在磁盘发生极端的光损失。XYXY轴扫描轴扫描（2）多光束扫描XY XY 轴扫描轴扫描奥林巴斯Fluo View300 激光共聚焦扫描系统光电倍增器双色镜激发和发射滤波滑动器强度调整密度塔激发发射和射柱准直仪电源X-Y检流计镜扫描控制器出入口透镜系统同样可以实现XZ轴，YZ轴扫描Z Z轴扫描轴扫描通常的方法是通过计算机控制的马达以预先设定的步距移动显微镜的镜台然后采集图像。（当然也有通过改变焦平面位置的方法）光学切片光学切片 通过精细平面光切，形成生物样品不同平通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象面的精细图象，将一个连续的光切图象Z Z轴轴重叠就可形成一个完整的三维重叠就可形成一个完整的三维图象图象光学切片光学切片切片的厚度受物镜的数值孔径和针孔直径影响，比如60X，NA1.4的镜头当针孔设定为1mm时，光学切片厚度为0.4微米。6.6.整体结构整体结构光电倍增管扫瞄装置空气冷却氩激光器激发光滤器共焦针孔屏障滤光片(检流计物镜谢谢！谢谢！
