生产中常用菌种分离选育和保藏学习教案.pptx

会计学1生产中常用菌种分离生产中常用菌种分离(fnl)选育和保藏选育和保藏第一页，共66页。带图象分析系统的带图象分析系统的带图象分析系统的带图象分析系统的微生物菌种显微微生物菌种显微微生物菌种显微微生物菌种显微(xi(xi n wi)n wi)观观观观察装置察装置察装置察装置 第1页/共66页第二页，共66页。2.1 菌种的分离菌种的分离(fnl)一、发酵工业常用微生物的要求二、菌种的来源三、新种分离(fnl)与筛选的步骤四、自然界中细菌的分离(fnl)第2页/共66页第三页，共66页。1.1.生产菌不是病原菌及其产物无毒性生产菌不是病原菌及其产物无毒性2.2.原料来源广、廉价，菌种大量高效地合成产物原料来源广、廉价，菌种大量高效地合成产物3.3.菌种纯，遗传性能稳定，不易菌种纯，遗传性能稳定，不易(b y)(b y)感染噬菌体感染噬菌体4.4.生长繁殖能力强，发酵周期短生长繁殖能力强，发酵周期短5.5.发酵中少产与产品相近的副产品发酵中少产与产品相近的副产品6.6.一、发酵工业(gngy)常用微生物的要求第3页/共66页第四页，共66页。二、菌种的来源二、菌种的来源二、菌种的来源二、菌种的来源根据资料根据资料根据资料根据资料(zlio)(zlio)直接向有科研单位、直接向有科研单位、直接向有科研单位、直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索高等院校、工厂或菌种保藏部门索高等院校、工厂或菌种保藏部门索高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；取或购买；取或购买；取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。第4页/共66页第五页，共66页。n n定定定定方方方方案案案案：首首首首先先先先要要要要查查查查阅阅阅阅资资资资料料料料，了了了了解解解解所所所所需需需需菌菌菌菌种种种种的的的的生生生生长长长长培培培培养养养养特性。特性。特性。特性。n n采样采样采样采样(c(c i yni yn)：有针对性地采集样品。：有针对性地采集样品。：有针对性地采集样品。：有针对性地采集样品。n n增增增增殖殖殖殖：人人人人为为为为地地地地通通通通过过过过控控控控制制制制养养养养分分分分或或或或培培培培条条条条件件件件，使使使使所所所所需需需需菌菌菌菌种种种种增增增增殖培养后，在数量上占优势。殖培养后，在数量上占优势。殖培养后，在数量上占优势。殖培养后，在数量上占优势。n n分离：利用分离技术得到纯种。分离：利用分离技术得到纯种。分离：利用分离技术得到纯种。分离：利用分离技术得到纯种。n n发发发发酵酵酵酵性性性性能能能能测测测测定定定定：进进进进行行行行生生生生产产产产性性性性能能能能测测测测定定定定。这这这这些些些些特特特特性性性性包包包包括括括括形形形形态态态态、培培培培养养养养特特特特征征征征、营营营营养养养养要要要要求求求求、生生生生理理理理生生生生化化化化特特特特性性性性、发发发发酵酵酵酵周周周周期期期期、产产产产品品品品品品品品种种种种和和和和产产产产量量量量、耐耐耐耐受受受受最最最最高高高高温温温温度度度度、生生生生长长长长和和和和发发发发酵酵酵酵最最最最适适适适温温温温度、最适度、最适度、最适度、最适pHpH值、提取工艺等。值、提取工艺等。值、提取工艺等。值、提取工艺等。三、新种分离与筛选三、新种分离与筛选(shixun)的步骤的步骤第5页/共66页第六页，共66页。（一）采样（一）采样(ci yn)1.1.采样对象：以采集土壤为主，也可以是植物，采样对象：以采集土壤为主，也可以是植物，腐败物品，某些水域等。腐败物品，某些水域等。2.2.采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3.3.采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去 表土，取离地面表土，取离地面5-15cm5-15cm处的土约处的土约 10g 10g，盛入清洁，盛入清洁(qngji)(qngji)的牛皮纸袋或的牛皮纸袋或塑料袋塑料袋 中，扎好，标记，记录采样时间、中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。地点、环境条件等，以备查考。第6页/共66页第七页，共66页。从自然界筛选从自然界筛选(shixun)第7页/共66页第八页，共66页。（二）增殖（二）增殖(zngzh)培养培养n n为为了了容容易易分分离离到到所所需需的的菌菌种种，让让无无关关(wgun)(wgun)的的微微生生物物在在数数量量上上不不要要增增加加，可可以以通通过过配配制制选选择择性性培养基，选择一定的培养条件来控制。培养基，选择一定的培养条件来控制。n n例例如如碳碳源源利利用用的的控控制制，可可选选糖糖，淀淀粉粉、纤纤维维素素，或或者者石石油油等等，以以其其中中的的一一种种为为唯唯一一碳碳源源，那那么么只只有有利利用用这这一一碳碳源源的的微微生生物物才才能能大大量量正正常常生生长长，而而其其它它微微生生物物就就可可能能死死亡亡或或淘淘汰汰。这这样样对对下下阶阶段段的的纯种分离就会顺利得多。纯种分离就会顺利得多。第8页/共66页第九页，共66页。（三）分离（三）分离(fnl)筛选筛选n n尽尽管管通通过过增增殖殖培培养养效效果果显显著著，但但还还是是处处于于微微生生物物的的混混杂杂生生长长状状态态。因因此此还还必必须须分分离离，纯纯化化。在在这这步步，增增殖殖培培养养的的选选择择性性控控制制条条件件还还应应进进一一步步应应用用，而而且且控控制制得得细细一一点点(y(y di di n)n)。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。n n这这一一步步是是采采用用与与生生产产相相近近的的培培养养基基和和培培养养条条件件，通通过过三三角角瓶瓶的的容容量量进进行行小小型型发发酵酵试试验验，以求得适合于工业生产用菌种。以求得适合于工业生产用菌种。第9页/共66页第十页，共66页。（四）发酵（四）发酵(f jio)性能测定性能测定n n生产性能：发酵周期、产品品种和产量等生产性能：发酵周期、产品品种和产量等n n安安全全性性能能：自自然然界界的的一一些些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产产毒毒的的，将将其其作作为为生生产产菌菌种种应应当当十十分分当当心心，尤尤其其与与食食品品工工业有关业有关(y(y ugun)ugun)的菌种，更应慎重。的菌种，更应慎重。n n 据据有有的的国国家家规规定定，微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯枯草草杆杆菌菌作作为为食食用用无无须须作作毒毒性性试试验验外外，其其他他微微生生物物作作为为食食用用，均均需需通通过过两两年年以以上上的毒性试验。的毒性试验。第10页/共66页第十一页，共66页。四、自然界中细菌四、自然界中细菌(xjn)的分离的分离第11页/共66页第十二页，共66页。采样采样(ci yn)的注意的注意事项事项1.1.采样时应尽可能保持相对无菌；采样时应尽可能保持相对无菌；2.2.所采集的样本必须具有某种代表性；所采集的样本必须具有某种代表性；3.3.采采好好的的样样必必须须完完整整地地标标上上样样本本的的种种类类及及采采集集日期、地点以及采集地点的地理等；日期、地点以及采集地点的地理等；4.4.应应充充分分考考虑虑采采样样的的季季节节性性和和时时间间因因素素，因因为为真真正正(zhnzhng)(zhnzhng)的的原原地地菌菌群群的的出出现现可可能能是是短暂的；短暂的；5.5.采采好好的的样样应应及及时时处处理理，暂暂不不能能处处理理的的也也应应贮贮存于存于44下，但贮存时间不宜过长。下，但贮存时间不宜过长。第12页/共66页第十三页，共66页。采样和采集采样和采集采样和采集采样和采集(c(c ij)ij)方法方法方法方法n n为为了了从从一一特特定定生生态态系系统统中中分分离离出出具具有有代代表表性性的的细细菌菌菌菌群群，特特别别是是分分离离那那些些(nxi)(nxi)在在唯唯一一微微环环境境区区域域中中出出现现的的菌菌群群时时，必必须须十十分分重重视视样本的采集。样本的采集。n n样样本本采采集集时时所所需需的的工工具具通通常常有有无无菌菌刮刮铲铲、土土样样采采集集器器、镊镊子子、解解剖剖刀刀、手手套套、无无菌菌小小塑塑料袋和塑料瓶等。料袋和塑料瓶等。第13页/共66页第十四页，共66页。1土样采集土样采集(cij)方法方法n n森森林林、旱旱地地，草草地地可可先先掘掘洞洞，由由土土壤壤下下层层向向上上层层顺顺序采集；序采集；n n水水田田等等浸浸水水土土壤壤在在不不损损土土层层结结构构的的情情况况下下插插入入圆圆筒筒采采集集，可可取取(kq(kq)离离地地面面5 515cm15cm处处的的土土。将将采采集集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。n n在在采采集集植植物物根根际际土土样样时时，一一般般方方法法是是自自土土壤壤中中慢慢慢慢拔拔出出植植物物根根，在在大大量量无无菌菌水水中中浸浸渍渍约约20min20min，洗洗去去粘粘附附在在根根上上的的土土壤壤，然然后后再再用用无无菌菌水水漂漂洗洗下下根根部部残残留留的土，这部分上却为根际土样。的土，这部分上却为根际土样。第14页/共66页第十五页，共66页。2 2 2 2水样采集水样采集水样采集水样采集(cij)(cij)(cij)(cij)方法方法方法方法n n用用于于细细菌菌检检测测的的水水样样应应收收集集于于100m1100m1干干净净、灭灭菌菌的的广口塑料瓶中。广口塑料瓶中。n n由由于于表表层层水水中中含含有有泥泥沙沙，故故在在采采样样时时应应在在较较深深的的静静水层水层(shu(shu cn cn)中采集水样。中采集水样。n n方方法法是是：握握住住采采样样瓶瓶底底浸浸入入水水中中30-50cm30-50cm处处，然然后后瓶瓶口口朝朝下下打打开开瓶瓶盖盖，让让水水样样进进入入。如如果果有有急急流流存存在在的的话话，应应直直接接将将瓶瓶口口反反向向于于急急流流。采采集集瓶瓶从从水水中中取取出出时时应应迅迅速速并并带带有有较较大大的的弧弧度度。水水样样不不应应装装满满采采样样瓶瓶。所所有有水水样样都都应应在在24h24h之之内内迅迅速速进进行行检检测测，或或者者4 4下贮存。下贮存。第15页/共66页第十六页，共66页。.菌种选育菌种选育(xun y)菌种的选育：菌种的选育：是是运运用用(ynyng)(ynyng)生生物物遗遗传传和和变变异异原原理理，用用人人工工方方法法造造成成变变异异，经经过过筛筛选选，得得到到使使现现存存的的优优良良性性状状强强化化，或或去去除除不不良良性性质质或或增增加加新新的的性性状状的工业菌种的过程。的工业菌种的过程。1.自然选育2.诱变育种(y zhng)3.其他育种(y zhng)菌种的选育方法：第16页/共66页第十七页，共66页。1.自然(zrn)选育定义：在生产过程(guchng)中，不经过人工处理，利用 菌种的自然突变进行菌种筛选的过程(guchng)。突变因素(yn s)：1.多因素(yn s)低剂量的诱变效应 2.碱基配错效应 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-610-10左右。第17页/共66页第十八页，共66页。2 2 2 2 诱变诱变诱变诱变(yu bin)(yu bin)(yu bin)(yu bin)育种育种育种育种 诱诱变变育育种种：以以诱诱发发突突变变为为基基础础(jch(jch)的的育育种种，是是迄迄今今为为止止国国内内外外提提高高菌菌种产量、性能的主要手段。种产量、性能的主要手段。一、诱变剂二、诱变育种(y zhng)流程第18页/共66页第十九页，共66页。一、诱变剂一、诱变剂 物理诱变剂：如紫外线、X射线、射线，物理因素中目前使用得最方便(fngbin)而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。第19页/共66页第二十页，共66页。化学诱变剂化学诱变剂化学因子化学因子(ynz)(ynz)如碱基类似物、如碱基类似物、55氟尿嘧啶、烷氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。化剂。大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。接接触就会过敏，这就更要当心。第20页/共66页第二十一页，共66页。二、诱变育种流程 出发菌株 取高产斜面（菌种保藏）单孢子(boz)悬液 转接斜面 诱变处理 摇瓶复筛稀释涂布平皿 高产菌株单菌落转接斜面 中试考查 摇瓶初筛 生产第21页/共66页第二十二页，共66页。一、转一、转一、转一、转 化化化化n n指以细菌质粒为载体，将外源基因(jyn)导入受体细胞的过程。二、转导二、转导(zhun do)(zhun do)利用噬菌体DNA作为(zuwi)载体将外源基因导入受体细胞的过程。第22页/共66页第二十三页，共66页。基因重组示意图第23页/共66页第二十四页，共66页。杂交育种杂交育种杂交育种杂交育种(z jio y zhn)(z jio y zhn)(z jio y zhn)(z jio y zhn)两个不同基因型的菌株通过结合,遗传物质重新组合，在从中分离和筛选初具有新性状菌株的育种(y zhng)方法.第24页/共66页第二十五页，共66页。原生质体融合原生质体融合(rngh)(rngh)原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解(fnji)酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。用脱壁酶除去细胞壁，制成原生质体，再用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，从而获得异核体活重组子的技术。第25页/共66页第二十六页，共66页。突变型菌株的筛选突变型菌株的筛选(shixun)(shixun)第26页/共66页第二十七页，共66页。.菌种保藏菌种保藏(bocng)及防止衰退及防止衰退的措施的措施 在在在在发发发发酵酵酵酵生生生生产产产产中中中中，需需需需对对对对具具具具有有有有高高高高产产产产有有有有重重重重要要要要经经经经济济济济价价价价值值值值的的的的微微微微生物菌种的进行保存生物菌种的进行保存生物菌种的进行保存生物菌种的进行保存(bocn)(bocn)(bocn)(bocn)和长期保藏。和长期保藏。和长期保藏。和长期保藏。一、菌种保藏一、菌种保藏(bocng)技术技术二、微生物活力和稳定性测定二、微生物活力和稳定性测定 三、防止菌种衰退的措施三、防止菌种衰退的措施第27页/共66页第二十八页，共66页。保藏原理：根据菌株生理生化特性，人工创造条件（低温、干燥、真空）使菌体的代谢活动休眠期状态。目的要求：经长期保藏后菌种存活健在，保证菌种不改变表型和基因型，特别(tbi)是不改变菌种代谢产物生产能力。一、菌种保藏一、菌种保藏(bocng)技术技术(1)冷冻(lngdng)保藏；(2)干燥保藏；(3)传代保藏；(4)矿物油中浸没保藏 (5)载体吸附于燥保藏。第28页/共66页第二十九页，共66页。冷冻冷冻(lngdng)保藏保藏 n n冷冷冻冻保保藏藏（-20-20以以下下）：是是保保藏藏微微生生物物菌菌种种的的最最简简单单而而有有效效的的方方法法，将将菌菌种种加加入入菌菌种种保保护护剂剂（甘甘油油或或）通通过过冷冷冻冻，使使微微生生物物代代谢谢活活动动停停止止。冷冷冻冻温温度度愈愈低低，效效果果愈愈好好。冷冷冻冻深深藏藏的的缺缺点点(qudin)(qudin)运运输输较困难。较困难。n n主要冷冻保藏方法主要冷冻保藏方法n n普通冷冻保藏技术普通冷冻保藏技术(-20)(-20)n n超低温冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术(-60(-60-80)-80)n n液氮冷冻保藏技术液氮冷冻保藏技术 （-130-130-150-150）第29页/共66页第三十页，共66页。n n 普通冷冻保藏技术普通冷冻保藏技术(-20)(-20)n n保保藏藏方方法法：将将菌菌悬悬液液或或斜斜面面培培养养物物细细胞胞将将菌菌种种加加入入菌菌种种保保护护剂剂，密密封封于于试试管管内内，贮贮藏藏于于冰冰箱箱的的冷冷藏室或普通冰箱藏室或普通冰箱(-20)(-20)中。中。n n保藏期限：保藏期限：1212年年n n注注意意事事项项：经经次次解解冻冻的的菌菌株株不不宜宜二二次次保保藏藏；保保藏藏过过程程中中应应注注意意控控制制(kngzh)(kngzh)保保藏藏温温度度，培培养养瓶瓶或或试试管管应应严严格格密密封封；不不适适宜宜多多数数微生物的长期保藏。微生物的长期保藏。第30页/共66页第三十一页，共66页。n n 超低温冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术(-60(-60(-60(-60-80)-80)-80)-80)n n保保保保藏藏藏藏方方方方法法法法(fngf)(fngf)(fngf)(fngf)：取取取取对对对对数数数数生生生生长长长长中中中中期期期期至至至至后后后后期期期期的的的的微微微微生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞；用用用用新新新新鲜鲜鲜鲜培培培培养养养养基基基基重重重重新新新新悬悬悬悬浮浮浮浮所所所所收收收收获获获获的的的的细细细细胞胞胞胞；加加加加入入入入等等等等体体体体积积积积的的的的20202020甘甘甘甘油油油油或或或或10101010二二二二甲甲甲甲亚亚亚亚砜砜砜砜；混混混混匀匀匀匀后后后后分分分分装装装装入冷冻管中，于入冷冻管中，于入冷冻管中，于入冷冻管中，于-60-60-60-60超低温冰箱中保藏。超低温冰箱中保藏。超低温冰箱中保藏。超低温冰箱中保藏。n n保藏期限：保藏期限：保藏期限：保藏期限：5 5 5 5年年年年n n注意事项：冷冻速度控制在注意事项：冷冻速度控制在注意事项：冷冻速度控制在注意事项：冷冻速度控制在1-21-21-21-2minminminmin第31页/共66页第三十二页，共66页。n n 液氮冷冻保藏技术液氮冷冻保藏技术n n保保藏藏方方法法：斜斜面面用用1010甘甘油油制制备备悬悬液液或或培培养养液液体体物物用用20%20%甘甘油油制制备备悬悬液液，混混匀匀，取取0.50.5lmllml分分装装玻玻璃璃安安瓿瓿或或液液氮氮冷冷藏藏专专用用塑塑料料瓶瓶，酒酒精精喷喷灯灯封封口口；先先于于55冰冰箱箱中中3min3min，后后置置于于金金属属容容器器，以以1-2/min1-2/min控控速速冷冷 冻冻 至至 细细 胞胞 冻冻 结结 点点(通通 常常(tngchng)(tngchng)为为-30)-30)，再再 以以1/min1/min控控速速冷冷冻冻至至-50-50；迅迅速速 移移 入入 液液 氮氮 罐罐 中中 于于 液液 相相(-(-196)196)或或 气气相相(-156)(-156)中中保保存。存。第32页/共66页第三十三页，共66页。n n复复苏苏方方法法：从从液液氮氮罐罐中中取取出出所所需需的的安安瓿瓿，立立即即冰冰浴浴10min10min；再再迅迅速速(xn(xn s)s)将将安安瓿瓿置置于于37-4037-40水水浴浴中中，轻轻摇摇融融解解；取取0.1-0.1-0.2ml 0.2ml 转接入琼脂斜面上。转接入琼脂斜面上。n n保藏期限：保藏期限：1010年以上年以上n n注注意意事事项项：保保护护剂剂最最终终浓浓度度为为1010无无菌菌甘甘油油或或5 5无无菌菌二二甲甲亚亚砜砜。甘油为高压蒸汽灭菌，二甲亚砜最好为过滤灭菌。甘油为高压蒸汽灭菌，二甲亚砜最好为过滤灭菌。第33页/共66页第三十四页，共66页。冻干冻干(dn n)保保藏藏 n n保保保保藏藏藏藏方方方方法法法法(fngf)(fngf)(fngf)(fngf)：将将将将混混混混有有有有保保保保护护护护剂剂剂剂冰冰冰冰冻冻冻冻至至至至-60-60-60-60菌菌菌菌种种种种迅迅迅迅速速速速转转转转移移移移至至至至-40-40-40-40时时时时启启启启动动动动真真真真空空空空泵泵泵泵，使使使使真真真真空空空空度度度度减减减减压压压压到到到到2.672.672.672.674.00Pa4.00Pa4.00Pa4.00Pa条条条条件件件件下下下下使使使使冻冻冻冻结结结结的的的的细细细细胞胞胞胞悬悬悬悬液液液液中中中中的的的的水水水水分分分分升升升升华华华华，使使使使菌菌菌菌种种种种干干干干燥燥燥燥成成成成粉粉粉粉，分分分分装装装装密密密密封封封封安安安安瓿瓿瓿瓿，低低低低于于于于5555下下下下保保保保藏藏藏藏。是是是是微微微微生生生生物物物物菌种长期保藏的最为有效的方法菌种长期保藏的最为有效的方法菌种长期保藏的最为有效的方法菌种长期保藏的最为有效的方法(fngf)(fngf)(fngf)(fngf)之一。之一。之一。之一。n n保藏期限：保藏期限：保藏期限：保藏期限：10 10 10 10年以上年以上年以上年以上n n注注注注意意意意事事事事项项项项：冷冷冷冷冻冻冻冻干干干干燥燥燥燥过过过过程程程程中中中中必必必必须须须须使使使使用用用用冷冷冷冷冻冻冻冻保保保保护护护护剂剂剂剂，如如如如脱脱脱脱脂脂脂脂乳乳乳乳和和和和蔗蔗蔗蔗糖糖糖糖，冻冻冻冻干干干干后后后后的的的的菌菌菌菌株株株株无无无无需需需需进进进进行行行行冷冷冷冷冻冻冻冻保保保保藏藏藏藏，便便便便于于于于运运运运输。输。输。输。第34页/共66页第三十五页，共66页。(3)(3)传代保藏传代保藏保藏方法：将菌种定期在新鲜琼脂保藏方法：将菌种定期在新鲜琼脂斜面基本培养基上传代，斜面基本培养基上传代，5 5以以下保藏下保藏保藏期限：保藏期限：1-3 1-3月月注意事项：此法简单和经济，可用注意事项：此法简单和经济，可用于实验室中若干菌种的保藏；但于实验室中若干菌种的保藏；但易发生培养基干枯、菌体自溶、易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变，应加以防治。不适宜基因突变，应加以防治。不适宜(shy)(shy)作工业生产菌种的长期保作工业生产菌种的长期保藏方法。藏方法。第35页/共66页第三十六页，共66页。（4 4）矿物油中浸没保藏）矿物油中浸没保藏保保藏藏方方法法(fngf)(fngf)：将将琼琼脂脂斜斜面面或或液液体体培培养养菌菌种种物物浸浸入入无无菌菌矿矿物物油油中中 于于 室室 温温 下下 保保 藏藏，此此 方方 法法(fngf)(fngf)简简便便有有效效，可可用用于于丝丝状状真真菌菌、酵酵母母、细细菌菌和和放放线线菌菌的的保保藏藏保藏期限：保藏期限：1-3 1-3年年注注意意事事项项：以以液液体体石石蜡蜡保保藏藏时时，应应对对菌菌株株预预先先作作石石蜡蜡培培养养试试验验，保保藏株藏株2 23 3年也应做一次存活试验。年也应做一次存活试验。第36页/共66页第三十七页，共66页。(5)载体吸附(xf)于燥保藏常用(chn yn)载体：沙土、麸皮、硅胶、滤纸等第37页/共66页第三十八页，共66页。二、二、二、二、微生物活力微生物活力微生物活力微生物活力(hul)(hul)(hul)(hul)和稳定性测定和稳定性测定和稳定性测定和稳定性测定 n n所所有有保保藏藏菌菌种种的的方方法法都都必必须须是是长长期期可可靠靠地地保保持持菌菌种种的的优良性状不变。优良性状不变。n n在在保保藏藏时时定定期期检检测测菌菌种种活活力力，以以确确定定保保藏藏培培养养物物的的保保藏藏期期限限和和保保藏藏方方法法的的可可靠靠性性，以以及及确确定定在在实实际际保保藏藏过过程中出现的细胞死亡程度和遗传程中出现的细胞死亡程度和遗传(ychun)(ychun)稳定性。稳定性。n n对对工工业业微微生生物物生生产产菌菌种种来来说说，建建议议保保藏藏菌菌种种的的形形态态学学和和生生化化特特征征(如如代代谢谢产产物物的的产产生生、酶酶活活力力、遗遗传传(ychun)(ychun)特特征征及及生生化化指指标标)应应在在保保藏藏后后加加以以检检测测和和确确定。定。第38页/共66页第三十九页，共66页。三、防止菌种衰退三、防止菌种衰退三、防止菌种衰退三、防止菌种衰退(shuitu)(shuitu)的措施的措施的措施的措施原因：保藏不妥(b tu)、条件不能满足菌种衰退：经过保藏，由于自发菌种衰退：经过保藏，由于自发(zf)突变引起突变引起的某的某 些优良特征的变偌或消失的现象些优良特征的变偌或消失的现象防止菌种衰退的措施：防止菌种衰退的措施：1.减少传代次数减少传代次数2.选择合适的培养条件选择合适的培养条件3.利用不同类型的细胞进行传代利用不同类型的细胞进行传代3.选择合适的保藏方法选择合适的保藏方法第39页/共66页第四十页，共66页。.培养基的配制培养基的配制(pizh)1 1 概述概述(i sh)(i sh)2 2 培养基的成分培养基的成分3 3 培养基的种类与选择培养基的种类与选择4 4 培养基的设计培养基的设计第40页/共66页第四十一页，共66页。1 1 概述概述(i sh)(i sh)培培 养养 基基：供供 微微 生生 物物 生生 长长(shngzhng)(shngzhng)繁繁殖殖和和生生物物合合成成各各种种代代谢谢产产物物所所需需要要的的按按一一定定比比例例配配制制的的多多种种营营养养物物质质混混合合物。物。满足菌体的生长满足菌体的生长 促进产物促进产物(chnw)的形成的形成发酵培养基的作用：发酵培养基的作用：第41页/共66页第四十二页，共66页。2 2 培养基的成分培养基的成分(chng fn)(chng fn)n n碳源碳源n n氮源氮源n n无机盐和微量元素无机盐和微量元素n n水水n n生长因子生长因子n n前体和抑制剂、促进剂前体和抑制剂、促进剂第42页/共66页第四十三页，共66页。n n1.碳源 n n构成(guchng)微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质，是发酵的主要原料之一n n一般占干物质50%，为生命活动提供能源n n包括糖类，脂肪，有机酸，醇，碳氢化合物第43页/共66页第四十四页，共66页。n n糖糖 类类 n n单糖单糖 葡萄糖葡萄糖 n n双糖双糖 蔗糖，乳糖，麦芽糖蔗糖，乳糖，麦芽糖n n多糖多糖 糊精，淀粉及其水解液，玉米淀粉，糊精，淀粉及其水解液，玉米淀粉，n n 马铃薯淀粉，小麦马铃薯淀粉，小麦(xiomi)(xiomi)淀粉，木淀粉，木薯淀粉，薯淀粉，n n脂脂 肪肪:可作碳源，还有消泡作用可作碳源，还有消泡作用n n有机酸有机酸:可作碳源，还有调节可作碳源，还有调节pHpH值的作用值的作用n n醇醇:乙醇，乙醇，甘油，山梨醇甘油，山梨醇 n n碳氢化合物碳氢化合物 n n石油产物，甲烷，乙烷，丁烷，十六烷烃石油产物，甲烷，乙烷，丁烷，十六烷烃第44页/共66页第四十五页，共66页。n n2.氮源n n构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质，可补充碳源，是发酵的主要(zhyo)原料之一n n有机氮源 n n黄豆饼粉，玉米浆，棉籽饼粉，蛋白胨，酵母粉，鱼粉，菌丝体，酒糟n n无机氮源 氨水，硫酸铵，氯化铵，硝酸盐，具有调节pH值的作用第45页/共66页第四十六页，共66页。n n3.3.3.3.无机盐和微量元素无机盐和微量元素无机盐和微量元素无机盐和微量元素n n磷，硫，铁，镁，钙，锌，钴，钾，磷，硫，铁，镁，钙，锌，钴，钾，磷，硫，铁，镁，钙，锌，钴，钾，磷，硫，铁，镁，钙，锌，钴，钾，钠，锰钠，锰钠，锰钠，锰,铜铜铜铜,氯等，氯等，氯等，氯等，n n 其中许多金属离子对微生物生理活其中许多金属离子对微生物生理活其中许多金属离子对微生物生理活其中许多金属离子对微生物生理活性的作用与其浓度有关性的作用与其浓度有关性的作用与其浓度有关性的作用与其浓度有关(yugun)(yugun)(yugun)(yugun)，低浓度往往具有刺激作用，高浓度具低浓度往往具有刺激作用，高浓度具低浓度往往具有刺激作用，高浓度具低浓度往往具有刺激作用，高浓度具有抑制作用有抑制作用有抑制作用有抑制作用n n磷磷磷磷 是构成核酸，蛋白质等细胞物质是构成核酸，蛋白质等细胞物质是构成核酸，蛋白质等细胞物质是构成核酸，蛋白质等细胞物质的组成成分，是许多辅酶和高能磷酸的组成成分，是许多辅酶和高能磷酸的组成成分，是许多辅酶和高能磷酸的组成成分，是许多辅酶和高能磷酸键的成分，氧化磷酸化的必需元素键的成分，氧化磷酸化的必需元素键的成分，氧化磷酸化的必需元素键的成分，氧化磷酸化的必需元素n n铁铁铁铁 是菌体的细胞色素，细胞色素氧是菌体的细胞色素，细胞色素氧是菌体的细胞色素，细胞色素氧是菌体的细胞色素，细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成元素，是菌化酶和过氧化物酶的组成元素，是菌化酶和过氧化物酶的组成元素，是菌化酶和过氧化物酶的组成元素，是菌体生命活动的必需元素之一体生命活动的必需元素之一体生命活动的必需元素之一体生命活动的必需元素之一n n镁，锌，钴镁，锌，钴镁，锌，钴镁，锌，钴 是某些酶的辅酶，是某些酶的辅酶，是某些酶的辅酶，是某些酶的辅酶，n n钾钾钾钾 影响细胞膜的通透性影响细胞膜的通透性影响细胞膜的通透性影响细胞膜的通透性n n钠钠钠钠 具有维持细胞的渗透压的具有维持细胞的渗透压的具有维持细胞的渗透压的具有维持细胞的渗透压的n n钙钙钙钙 调节细胞的透性的作用，调节培调节细胞的透性的作用，调节培调节细胞的透性的作用，调节培调节细胞的透性的作用，调节培养液中磷酸盐的含量养液中磷酸盐的含量养液中磷酸盐的含量养液中磷酸盐的含量第46页/共66页第四十七页，共66页。n n4.4.水水 n n是培养基的主要组成成分，既是构成菌体细胞的主是培养基的主要组成成分，既是构成菌体细胞的主要成分，又是一切营养物质的传递介质。要成分，又是一切营养物质的传递介质。n n生长因子生长因子n n维生素，生物素，维生素，生物素，n n5.5.前体，促进剂，抑制剂前体，促进剂，抑制剂n n产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合成产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身而自身(zshn)(zshn)结构无显著变化的物质结构无显著变化的物质n n青霉素发酵培养基的苯乙酸和苯乙酰胺青霉素发酵培养基的苯乙酸和苯乙酰胺第47页/共66页第四十八页，共66页。3 培养基的种类培养基的种类(zhngli)与选择与选择n n按培养基物理性质分n n液体培养基，固体培养基，半固体培养基n n 按筛选菌种的作用分n n选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等n n按化学组成(z chn)作用分n n天然培养基，合成培养基，复合培养基n n按发酵生产用途分n n孢子培养基，种子培养基，发酵培养基第48页/共66页第四十九页，共66页。组成培养基天然培养基 化学成分不明或不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质制成的(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)合成培养基 已知组成成分的各种营养物质组合的培养基，用于科学研究复合培养基 由组成成分不完全(wnqun)明确的天然产物与无机盐组合的培养基（半合成培养基），用于工业生产第49页/共66页第五十页，共66页。生产用途孢子培养基 利于孢子的发芽和迅速生长，形成大量优质孢子，稍低的基质浓度种子培养基 用于孢子发芽和菌体生长繁殖，形成发酵种子的培养基发酵培养基 供菌体生长繁殖和合成(hchng)大量产物的培养基第50页/共66页第五十一页，共66页。n n第51页/共66页第五十二页，共66页。n n培养基的组成必需满足培养基的组成必需满足培养基的组成必需满足培养基的组成必需满足(mnz)(mnz)(mnz)(mnz)菌体细胞的生菌体细胞的生菌体细胞的生菌体细胞的生长发繁殖和合成代谢产物的元素需求，还要提长发繁殖和合成代谢产物的元素需求，还要提长发繁殖和合成代谢产物的元素需求，还要提长发繁殖和合成代谢产物的元素需求，还要提供维持细胞生命活动和合成代谢所需要的能量供维持细胞生命活动和合成代谢所需要的能量供维持细胞生命活动和合成代谢所需要的能量供维持细胞生命活动和合成代谢所需要的能量n n设计要求设计要求设计要求设计要求n n1.1.1.1.培养基各组分浓度适合，配比恰当培养基各组分浓度适合，配比恰当培养基各组分浓度适合，配比恰当培养基各组分浓度适合，配比恰当n n2.2.2.2.有利于提高产物合成速度，缩短发酵周期，有利于提高产物合成速度，缩短发酵周期，有利于提高产物合成速度，缩短发酵周期，有利于提高产物合成速度，缩短发酵周期，n n3.3.3.3.避免副产物的形成，便于产物分离纯化避免副产物的形成，便于产物分离纯化避免副产物的形成，便于产物分离纯化避免副产物的形成，便于产物分离纯化n n4.4.4.4.原料价廉易得，质量稳定，成本低原料价廉易得，质量稳定，成本低原料价廉易得，质量稳定，成本低原料价廉易得，质量稳定，成本低4.培养基的设计培养基的设计(shj)第52页/共66页第五十三页，共66页。n n定义：菌种的扩大定义：菌种的扩大(kud)(kud)培养就是把保藏的菌培养就是把保藏的菌种，即处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面种，即处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过摇瓶和种子罐，逐级扩大活化，再经过摇瓶和种子罐，逐级扩大(kud)(kud)培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。n n这些纯种的培养物称为种子。这些纯种的培养物称为种子。.菌种的扩大菌种的扩大(kud)培养培养1.种子必须具备的条件2.种子制备过程(guchng)3.接种龄和接种量4.种子罐级数的确定第53页/共66页第五十四页，共66页。1.1.种子必须具备种子必须具备(jbi)(jbi)的条件的条件 菌种细胞的生长活力强，接种后在 发酵罐中能迅速(xn s)生长 菌体总量和浓度能满足大容量发酵 罐的要求 无杂菌污染 生产能力稳定 第54页/共66页第五十五页，共66页。2.2.种子制备种子制备(zhbi)(zhbi)过程过程n n实验室种子制备阶段：在砂土管或冷冻干燥管实验室种子制备阶段：在砂土管或冷冻干燥管内保藏的菌种以无菌的方式接至适合的斜面培内保藏的菌种以无菌的方式接至适合的斜面培养基上，培养成熟后挑选正常的菌落再接一次养基上，培养成熟后挑选正常的菌落再接一次试管斜面并至摇瓶。试管斜面并至摇瓶。n n生产车间种子制备阶段：实验室制备的摇瓶种生产车间种子制备阶段：实验室制备的摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养子移接到种子罐进行扩大培养n n种子罐培养一方面使菌种获得足够的数量，另种子罐培养一方面使菌种获得足够的数量，另一方面种子罐中的培养基更接近发酵罐培养的一方面种子罐中的培养基更接近发酵罐培养的醪液成分醪液成分(chng fn)(chng fn)和培养条件，譬如通无菌和培养条件，譬如通无菌空气，搅拌形式等等，以使菌体适应发酵环境空气，搅拌形式等等，以使菌体适应发酵环境 第55页/共66页第五十六页，共66页。3.3.接种接种(jizhng)(jizhng)龄和龄和接种接种(jizhng)(jizhng)量量n n接种龄接种龄 n n 从一个从一个(y)(y)级的种子罐中培养的菌体到移入级的种子罐中培养的菌体到移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。n n接种量接种量 n n 接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后培接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后培养液体的体积的比例养液体的体积的比例 n n 移入种子移入种子(zhng zi)(zhng zi)的体积的体积接种量接种量 接种后培养液的体积接种后培养液的体积第56页/共66页第五十七页，共66页。4.4.种子罐级数种子罐