分子生物学课件第17讲.ppt

NanjingUniversity第四节 分解代谢产物抑制涉及的启动子正调控一、分解代谢产物抑制1，某些启动子转录的起始需要辅助蛋白质2，分解代谢产物抑制含义原因NanjingUniversity二、CAP对启动子的正调控1，cAMP在分解代谢产物抑制中的作用2，CAP的作用（1）CAP的结构特征（2）CAP结合的DNA位点（3）CAP的激活NanjingUniversity（4）CAP对转录的激活作用A，CAP激活转录的途径B，CAP与DNA和RNA聚合酶的作用C，CAP对RNA聚合酶的作用取决于两者的相对位置：NanjingUniversity第四节 操纵元的其他调控形式一、具有双启动子的半乳糖操纵元（一）半乳糖代谢1，半乳糖代谢相关的酶（1）半乳糖激酶（2）半乳糖转移酶（3）半乳糖表异构酶NanjingUniversity2，代谢步骤（二）gal操纵元1，gal操纵元组成（1）结构基因（galK，galT，galE）（2）调节基因（galR）（3）P/O位点NanjingUniversity2 2，gal gal操纵元的启动子操纵元的启动子（图（图8 89 9）（1 1）gal P1gal P1（2 2）gal P2gal P2NanjingUniversity（三三）cAMP-CAPcAMP-CAP对对 galP1galP1和和gal P2gal P2的控制的控制1 1，galgal启启动动子子的的cAMP-CAPcAMP-CAP结结合合位点位点（1 1）位置：）位置：-76-47-76-47（2 2）序列特点（图）序列特点（图8 81010）NanjingUniversity2 2，cAMP-CAPcAMP-CAP对对S1S1转转录录的的激激活活及及对对S2S2转转录录的的阻遏阻遏对对galP1galP1对对galP2galP2NanjingUniversity（四）Gal阻遏蛋白的作用机制1，gal阻遏蛋白的作用位点2，gal阻遏蛋白可能的作用机制（1）gal阻遏蛋白与galOE结合，可能通过以下途径发挥作用NanjingUniversity（）gal阻 遏 蛋 白 与galOI结合可能导致两个操作子之间的DNA形成环状结构，两个阻遏蛋白通过相互作用而强化了阻遏效应NanjingUniversity（五）gal操纵元双启动子的意义1，半乳糖的双重作用（1）作为细菌的碳源（2）UDPGal是细菌细胞壁的重要前体2，双启动子的作用（1）galP1保证细菌可以利用半乳糖作为碳源（2）galP2保证有葡萄糖存在时，细菌可以合成UDPGalNanjingUniversity二、阿拉伯糖操纵元：具有双重功能（正调控和负调控）的调节蛋白(一)阿拉伯糖代谢酶基因的操纵元1，阿拉伯糖调控元（1）三个参与阿拉伯糖代谢的酶的基因的操纵元（2）调控元：由一个调节基因控制几个操纵元的系统NanjingUniversity2，araBAD操纵元的组成（1）结构基因（2）操纵元结构（图8-11）（二）araBAD操纵元的调控NanjingUniversity1，araC基因产物及其结合位点（1）araC基因对araBAD正调控的遗传学证据（2）AraC蛋白的2种形式（3）AraC结合位点NanjingUniversity2，对araBAD操纵元起调控作用的因素（1）Crep 对araBAD 及araC的作用A，Crep 与araO1结合B，Crep 与araO2结合（2）Cind对araBAD 及araC的作用（3）cAMP-CAP是araBAD和araC表达的正调控因子NanjingUniversity3，araBAD操纵元的调控（图812）（1）无AraC及cAMP-CAP时，araC转录，但很快会被Crep所阻遏（自身调控）（2）有 AraC，无 cAMP-CAP时，araBAD和araC均不转录（3）有AraC，阿拉伯糖及cAMP-CAP时，araBAD转录（4）Cind 和cAMP-CAP促进araBAD转录的机制促进RNA聚合酶与araBAD的结合并形成开放性启动子复合物NanjingUniversity三、色氨酸操纵元：可阻遏系统（一）trp操纵元的结构1，结构基因及其编码的酶2，前导序列3，终止子4，调节基因NanjingUniversity（二）Trp操纵元的阻遏调控1，Trp的作用Trp有两方面的作用（1）对 已 有 的 酶 起 反 馈 抑 制（feedback inhibition）（2）作为trp无活性的阻遏蛋白的辅阻遏物NanjingUniversity2，TrpR的作用（1）TrpR的活性形式（2）TrpR的作用机制NanjingUniversity第五节 基因表达的时序调控时序调控：按照一定的时时序调控：按照一定的时间顺序实现的基因表达调间顺序实现的基因表达调控机制控机制NanjingUniversity基因转录时序调控的必要性：使生基因转录时序调控的必要性：使生物能够有效地利用资源，避免某些物能够有效地利用资源，避免某些基因不适当表达可能带来的危害基因不适当表达可能带来的危害基因转录时序调控的方式：大多数基因转录时序调控的方式：大多数是通过一种或几种蛋白质因子与是通过一种或几种蛋白质因子与RNARNA聚合酶相互作用而实现的聚合酶相互作用而实现的NanjingUniversity一、噬菌体基因表达特点概述（一）噬菌体基因组构成1，基因构成（1）转录和翻译所必需的基因感染初期噬菌体均利用宿主的转录系统，随后噬菌体合成一些自身编码的蛋白质，对宿主的RNA聚合酶进行替代或修饰，其结果是使转录系统优先转录噬菌体的mRNA。噬菌体倾向于使用宿主的蛋白质合成系统NanjingUniversity（2）DNA复制相关基因噬菌体常利用宿主的复制体系成分，这些基因与复制的起始有关，有的噬菌体基因组编码DNA聚合酶和某些复制相关的蛋白质NanjingUniversity（3）噬菌体颗粒结构和装配相关基因通常，噬菌体的头部和尾部需要许多种蛋白质，因此，噬菌体晚期功能区构成了基因组的最大部分NanjingUniversity2，遗传图谱的特点噬菌体的遗传图谱的组织常常反映其基因表达的顺序。在噬菌体中，操纵元的作用被发挥到极致。编码功能相关的蛋白质的基因聚集成簇，使得少数几个调节蛋白质就可以控制整个基因组的表达，实现最经济的调控NanjingUniversity（二）溶菌周期的分期1，早期感染（early infection）：指噬菌体DNA进入宿主到噬菌体DNA复制开始的一段时间。这一时期主要是产生DNA复制所需的酶NanjingUniversity2，晚期感染（late infection）：指噬菌体DNA复制开始到细菌裂解，释放后代噬菌体颗粒的一段时间。在这段时期，噬菌体完成DNA的复制、噬菌体颗粒的蛋白组分的合成。除此还需要合成组装蛋白和溶菌蛋白，帮助组装噬菌体颗粒和最终释放子代噬菌体NanjingUniversity（三）噬菌体基因表达的级联式控制q噬菌体的基因表达是在调节蛋白质的级联式控制进行的。前一个阶段的基因表达是后一个阶段基因表达所必需的。在每个阶段有一个或多个基因产物作为后续阶段的调节物。调节蛋白质可以是新的RNA聚合酶、新的亚基和抗终止因子等NanjingUniversity1，第一阶段的基因表达噬菌体感染第一个阶段的基因表达要依赖宿主的转录体系。这些基因常被成为早期基因（early genes），在噬菌体中称为极早期基因（immediate early genes）。这些基因的启动子和宿主基因的启动子是没有区别的。通常这个阶段只表达少数几个基因，其中总有一个基因编码下一批基因表达所必需的调节蛋白质NanjingUniversity2，第二阶段的基因表达这个阶段表达的基因被称为迟早期基因或中期基因。这批基因通常在早期基因编码的调节蛋白质一出现就开始表达。此时宿主的基因表达常常被抑制NanjingUniversity3，晚期基因表达当噬菌体DNA复制开始，晚期基因开始表达。其转录是在第二阶段合成的调节蛋白质的控制下进行的NanjingUniversity二、枯草杆菌中亚基的更迭（一）枯草杆菌噬菌体SPO1早、中晚期基因表达的转换1，SPO1生活史（1）早期：侵染侵染后45min（2）中期：侵染45min至812min（3）晚期：侵染812nin后NanjingUniversity2 2，SPO1SPO1早、中、晚期基因表达过程中早、中、晚期基因表达过程中亚基亚基的替换的替换（图816）（1）含55的RNA聚合酶全酶负责早期基因的转录早期基因产物gp28：分子量28KDa的亚基gp28取代55与核心酶结合，使RNA聚合酶识别中期基因的启动子不同亚基的替换取决与核心酶结合的亲和力NanjingUniversity（2）含gp28的RNA聚合酶全酶负责中期基因的转录gp33、gp34表达，并取代gp28（以及55）与核心酶结合，使RNA聚合酶识别晚期基因的启动子NanjingUniversity（3）以gp33-gp34为亚基的RNA聚合酶全酶负责晚期基因的转录NanjingUniversity（二）枯草杆菌子孢子生成过程中亚基的替换NanjingUniversity1 1，枯枯草草杆杆菌菌不不同同生生长长时时期期亚亚基基的的替换替换（1 1）营养生长时期）营养生长时期含含5555的的全全酶酶：识识别别营营养养生生长长有有关关基基因因的的转转录录和和孢孢子子形形成成最最初初所所需需要要的基因的基因2828含量很少含量很少3232含量不到总量的含量不到总量的1 1NanjingUniversity（2 2）营营养养耗耗竭竭及及孢孢子子形形成成反反应应时期时期含含2828的的全全酶酶：负负责责转转录录孢孢子子生生成成的的信信号号探探测测基基因因，以以及及起起始孢子形成反应的基因始孢子形成反应的基因NanjingUniversity（3 3）孢子形成早期）孢子形成早期3737代代替替5555，含含3737的的全全酶酶能能识识别早期孢子形成基因的启动子别早期孢子形成基因的启动子 3232负负责责识识别别某某些些基基因因的的启启动动子子NanjingUniversity（4 4）孢子形成中、晚期）孢子形成中、晚期2929代代替替3737，含含2929的的聚聚合合酶酶负负责责中中、晚晚期期孢孢子子形形成基因的转录成基因的转录NanjingUniversity2 2，不同，不同亚基识别不同的启动子亚基识别不同的启动子每每种种亚亚基基识识别别的的启启动动子子都都有有各各自的结构特征自的结构特征4 4，不同，不同亚基的作用机制亚基的作用机制亚亚基基可可能能直直接接识识别别启启动动子子的的特特性性NanjingUniversity二二、T T7 7噬噬菌菌体体生生长长过过程程中中用用噬噬菌菌体体RNARNA聚合酶代替寄主的聚合酶代替寄主的RNARNA聚合酶聚合酶（一）（一）T T7 7 噬菌体概况噬菌体概况1 1，T T7 7噬菌体的特点噬菌体的特点是感染大肠杆菌的烈性噬菌体是感染大肠杆菌的烈性噬菌体由由二二十十面面体体的的头头部部和和非非常常小小的的尾尾部部构构成成基基因因组组由由3993639936bpbp的的线线状状双双链链DNADNA组组成成，编码编码5050个基因个基因NanjingUniversity2 2，T T7 7 噬菌体生长周期噬菌体生长周期生生长长周周期期：可可分分为为早早期期阶阶段段和和晚期阶段，晚期阶段，3030 C C时为时为2525分钟分钟生生长长周周期期的的特特点点：DNADNA注注射射非非常常缓慢，是基因调控的手段之一缓慢，是基因调控的手段之一生生长长周周期期可可分分为为早早期期阶阶段段和和晚晚期阶段期阶段NanjingUniversity（二）（二）T T7 7 噬菌体的基因噬菌体的基因1 1，T T7 7 噬菌体基因及其产物噬菌体基因及其产物（1 1）早期及晚期基因（图）早期及晚期基因（图8 81919）早早期期基基因因及及其其转转录录产产物物I I：第第一一组组（早早期期）基基因因属属于于极极早早期期基基因因，在在噬噬菌菌体体进进入入细细菌菌后后由由宿宿主主的的RNARNA聚聚合合酶酶表表达达。其其产产物物中中有有干干扰扰宿宿主主基基因因表表达达的的酶酶和和噬噬菌菌体体RNARNA聚聚合合酶酶。后后者者负负责责部分早期和整个晚期基因的表达部分早期和整个晚期基因的表达NanjingUniversity晚晚期期基基因因及及其其转转录录产产物物IIII：编编码码与与DNADNA复复制制有有关关的的蛋蛋白白质质晚晚期期基基因因及及其其转转录录产产物物IIIIII：编编码码与与噬噬菌菌体体颗颗粒粒的的结结构构和组装有关的蛋白质和组装有关的蛋白质NanjingUniversity（2 2）T T7 7 噬噬菌菌体体基基因因的的启启动动子子位位置置和终止位点（图和终止位点（图8 81919）早早期期启启动动子子：A1A1、A2A2和和A3A3，由由大大肠肠杆菌杆菌RNARNA聚合酶识别聚合酶识别第二组启动子：第二组启动子：1010个个第三组启动子：第三组启动子：5 5个个复制启动子：复制启动子：OL OL，OR OR终止位点：终止位点：T TE E，T T，T7 T7末端末端NanjingUniversity（3 3）T T7 7噬噬菌菌体体基基因因mRNAmRNA的的合合成成及转录后处理（图及转录后处理（图8 82020）T T7 7噬噬菌菌体体mRNAmRNA有有宿宿主主RNARNA酶酶IIIIII能能够够识识别别的的发发夹夹结结构构，可可以以被被RNARNA酶酶IIIIII切切割割释释放放出出各各个个基基因因的的mRNAmRNANanjingUniversity2 2，T T7 7噬噬菌菌体体RNARNA聚聚合合酶酶识识别别的的启启动动子子（表表8 86 6）（1 1）T T7 7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶识别的序列聚合酶识别的序列2323bpbp（-17+6-17+6）的高度保守序列的高度保守序列（2 2）T T7 7噬菌体的弱启动子噬菌体的弱启动子 OL OL，第二组启动子第二组启动子结构特点：有结构特点：有2727个碱基不同于一致序列个碱基不同于一致序列NanjingUniversity（3 3）T T7 7噬菌体的强启动子噬菌体的强启动子第三组启动子，第三组启动子，OR OR结构特点：与一致序列相同结构特点：与一致序列相同NanjingUniversity（三）（三）T T7 7 噬菌体基因表达的调控噬菌体基因表达的调控1 1，早期转录产物，早期转录产物I I的形成的形成（1 1）寄主）寄主RNARNA合成体系负责转录早期基因合成体系负责转录早期基因（2 2）重要的早期基因）重要的早期基因基因基因0.30.3：产物能抑制寄主的限制酶：产物能抑制寄主的限制酶基基因因0.70.7：产产物物为为蛋蛋白白激激酶酶，能能使使宿宿主主RNARNA聚合酶因磷酸化而失活聚合酶因磷酸化而失活基因基因1 1：产物为：产物为T T7 7 RNARNA聚合酶聚合酶NanjingUniversity2 2，第，第组基因的表达组基因的表达（1 1）基因）基因2 2产物为宿主产物为宿主RNARNA聚合酶抑制剂聚合酶抑制剂（2 2）3.5 3.5基因产物基因产物参与参与DNADNA复制和转录的抑制复制和转录的抑制同同时时也也负负责责细细胞胞的的裂裂解解（又又称称T T7 7溶溶菌菌酶）酶）NanjingUniversity（3 3）T7 T7 噬噬菌菌体体对对寄寄主主RNARNA合合成体系的接管成体系的接管0.70.7，1 1，2 2基基因因产产物物作作用用的的结结果果使使宿宿主主的的转转录录体体系系关关闭闭，噬菌体建立自己的转录体系噬菌体建立自己的转录体系NanjingUniversity3 3，第，第类启动子的转录类启动子的转录（1 1）可可能能由由于于基基因因3.53.5产产物物的的作作用，这个阶段转录水平下降用，这个阶段转录水平下降（2 2）只只有有第第IIIIII类类强强启启动动子子才才能能起始转录起始转录NanjingUniversity三三、噬噬菌菌体体早早、晚晚期期基基因因转转录录以以及及裂裂解解生生长长和和溶原生长的调控溶原生长的调控（一）（一）噬菌体基因表达的特点噬菌体基因表达的特点1 1，对寄主，对寄主RNARNA聚合酶的依赖性聚合酶的依赖性2 2，有多种调控因子，有多种调控因子3 3，功能相关的基因聚集形成，功能相关的基因聚集形成4 4个操纵元个操纵元NanjingUniversity（1 1）早早期期左左向向操操纵纵子子：编编码码与与噬噬菌菌体体DNADNA与细菌与细菌DNADNA重组、整合和切除有关的基因重组、整合和切除有关的基因（2 2）早早期期右右向向操操纵纵子子：编编码码与与噬噬菌菌体体DNADNA复制有关的基因复制有关的基因（3 3）晚晚期期操操纵纵子子：编编码码与与噬噬菌菌体体结结构构蛋蛋白及溶菌有关的基因白及溶菌有关的基因（4 4）阻阻遏遏蛋蛋白白操操纵纵子子：编编码码起起调调控控作作用用的基因的基因NanjingUniversity（二二）噬噬菌菌体体的的早早、晚晚期期基基因因的的表表达达（图（图6-176-17）1 1，极早期基因，极早期基因（1 1）启动子）启动子P PL L：转录产物转录产物L L1 1，编码抗终止蛋白编码抗终止蛋白N NP PR R：转录产物转录产物R R1 1，编码调节蛋白质编码调节蛋白质CroCro（2 2）终止子终止子t tL L1 1，t tR R1 1：均依赖于均依赖于 因子因子NanjingUniversity2 2，迟早期基因，迟早期基因（1 1）启动子）启动子P PL L：转转录录产产物物L L2 2，翻翻译译产产物物CIIICIII蛋白蛋白P PR R：转转录录产产物物R R2 2，R R3 3，翻翻译译产产物物CIICII，O O，P P，Q Q蛋白蛋白NanjingUniversity（2 2）终止子）终止子t tR R2 2：依赖于依赖于 因子因子 t tR R3 3：对抗终止因子不敏感对抗终止因子不敏感NanjingUniversity3 3，晚期基因，晚期基因（1 1）启动子）启动子P PRR：转转录录产产物物R R4 4，R R5 5，编编码码噬噬菌菌体体的的结结构构蛋蛋白白和和溶溶菌菌酶酶等等 （2 2）终止子）终止子t tRR，t tR4R4NanjingUniversity（三三）噬噬菌菌体体的的阻阻遏遏蛋蛋白白及及其其作用作用1 1，CroCro蛋白蛋白与与操操作作子子结结合合的的亲亲和和力力：O OL3L3 O OL2 L2 OOL1L1，O OR3 R3 O OR2 R2 O OR1R1