分离科学-第八章高效毛细管电泳.ppt

高效毛细管电泳(High performance capillary electrophoresis,HPCE)高效毛细管电泳是离子或者荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按照其淌度和/或分配系数不同，实现高效、快速分离分析的一种电泳新技术。第八章 高效毛细管电泳电泳技术发展历程：1.1937年瑞典科学家Tiselius首次采用电泳技术，分离人血清中5种蛋白。2.1981年Jorgenson用75m内径毛细管，利用区带电泳实现了正负离子的分离分析，成为毛细管电泳技术的里程碑。3.1983年，Hjerten发展了毛细管凝胶电泳。4.1984年，Terabe等发展了胶束电动色谱，使中性化合物的CE分离成为可能。5.1987年，Hjerten提出了毛细管等电聚焦电泳。6.1989年出现商品CE仪器，为推广应用起到了促进作用。第八章 高效毛细管电泳人类基因组研究计划中发挥了巨大的作用毛细管电泳特点分离模式多，转换容易，适用范围广。分离效率高。理论塔板数40万块/m。速度快。多数30min，最快几秒钟。试剂和样品消耗少。分离溶剂仅为几l，进样量nL（10-9L）级。成本低，操作简便，环境污染小。应用领域十分广泛。在生命科学、药学、医学、中药分析、食品化学、环境化学和法医学等领域都得到广泛的应用。第八章 高效毛细管电泳毛细管电泳基本原理预备知识：双电层和Zeta电势双电层 由界面化学可知，固体与液体接触时，固体表面分子离解或者（和）表面吸附溶液中的离子，在表面形成双电层。第八章 高效毛细管电泳吸附层（紧密层）双电层模型和相应的电势分布扩散层 0为表面电势，紧密层中电势线性下降至d。剪切面上的电位称为Zeta电势（），略低于d，一般认为与d相等。表面吸附了非离子表面活性剂或大分子后，剪切面外移，与d差别变大，甚至会改变符号。第八章 高效毛细管电泳 当d衰减到原来的1/e时，离紧密层的距离定义为扩散层的厚度（）。Zeta电势正比于扩散层厚度。毛细管壁上的Zeta电势为：e为溶液中每单位面积总的过剩电荷，为介质的介电常数。第八章 高效毛细管电泳 带电粒子在其有效半径所组成的面存在Zeta电势：扩散层的厚度与电解质的浓度有关，确切地说与离子强度有关。对于二元电解质，近似有：第八章 高效毛细管电泳电泳（Electrophoresis）在半导电流体中，带电粒子在外加电场作用下的泳动现象叫电泳。带电粒子的移动速度可以表示为：球形粒子：棒状粒子：第八章 高效毛细管电泳影响电泳速度的因素：u 电场强度Eu 介质特性（介电常数和粘度）u 粒子的有效电荷u 粒子大小和形状因此，荷质比差异是电泳分离的基础。第八章 高效毛细管电泳淌度（Mobility,）因为电泳速度与外加电场强度有关，所以，在电泳中常用淌度而不用速度来表示带电粒子的电泳行为和特性。绝对淌度（absolute mobility,mab）无限稀释条件下单位电场强度下离子的平均迁移速度。它是该离子在一定溶液中的一个特征物理常数。在手册中可以查到一些离子的绝对淌度。第八章 高效毛细管电泳有效淌度（effective mobility,ef）有效淌度是实验测出的离子淌度，它是所有产物的离解度（i）和分子的第i离子形式的绝对淌度乘积之总和：ef取决于许多因素，包括离子半径，溶剂化作用，介电常数，溶剂粘度，离子形状、电荷、pH、离解度和温度等。第八章 高效毛细管电泳电渗流（Electroosmotic flow,EOF）在毛细管中，电渗流指的是体相溶液在外加电场下整体朝一个方向运动的现象。（A）EOF不存在流速场，无展宽；（B）HPLC存在流速场，展宽大。第八章 高效毛细管电泳电渗流在CE中的意义p 将正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移p 通过EOF的大小和方向的控制，还可以影响CE 的分离效率，选择性和分离度p EOF的细微变化会影响CE分离的重现性（迁移时间和峰面积）。第八章 高效毛细管电泳EOF速度的大小与毛细管管壁的Zeta电势有关：式中为0真空介电常数。类似于电泳，常用电渗流系数或电渗淌度来表示EOF大小：第八章 高效毛细管电泳影响电渗流的因素主要有：l 电场强度El 毛细管材料l 溶液的pHl 电解质溶液的成分和浓度l 添加剂l 温度 第八章 高效毛细管电泳eo E关系曲线电场的影响第八章 高效毛细管电泳EOF和pH的关系曲线 毛细管材料以及pH的影响 第八章 高效毛细管电泳电解质溶液的成分和浓度B4O72-Cit3-Ac-PO43-HCO3-电流（电流（m mA）137.4246.574.5162.069.0（10-5cm2V-1s-1）41.247.749.049.751.8 相同浓度的不同的电解质，溶液的介电常数、离子强度以及粘度不同；同一缓冲液，浓度增大、离子强度增加，双电层变薄，Zeta电势下降，因此EOF变小。50mmol/L钠盐缓冲液中测得的电流和电渗淌度（pH8.0）第八章 高效毛细管电泳添加剂对EOF的影响n 中性盐（K2SO4），双电层变薄，EOF降低；n 两性离子（四甲基氯化铵）增加溶液粘度，降低pH，EOF降低；n 有机溶剂甲醇、乙腈等降低离子强度（有利于提高Zeta电势）、粘度。但通过氢键或偶极作用于管壁，改变表面电荷，这些共同作用的结果一般使EOF变小。n 表面活性剂，显著改变毛细管内壁的电荷特性。当表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度以后，将形成胶束，这个时候CE的分离机理会发生变化。第八章 高效毛细管电泳阳离子表面活性剂浓度对eo的影响（pH9.1）第八章 高效毛细管电泳温度对EOF的影响 温度对EOF的影响是线性的。EOF随温度的变化主要是温度影响粘度变化的结果。温度升高时，溶液粘度下降，因此EOF变大。由于焦耳热的存在，毛细管内溶液的温度会发生变化引起柱效下降，以及分离时间重现性较差，因此，良好的散热是非常必要的。一般有空气冷却和液体冷却两种方式。第八章 高效毛细管电泳调控EOF的方法：p 改变缓冲液成分和浓度p 改变pHp 加入添加剂p 毛细管内壁改性（物理或化学方法涂层及动态去活）p 改变温度p 外加径向电场（改变管壁的Zeta电势）第八章 高效毛细管电泳溶质有效迁移速度和表观淌度 在CE中由实验决定的实际的离子迁移速度，称为有效迁移速度（vef）：ap称为表观淌度（apparent mobility），或者净淌度（net mobility）。第八章 高效毛细管电泳分离效率和分离度理论塔板数 Giddings方程定义为：纵向扩散是区带展宽的最主要因素n 使用高电场n EOF速度快n 扩散系数小的溶质第八章 高效毛细管电泳分离度 外加电压（V）；有效长度和总长度之比（l/L）；电泳有效淌度差（ef）；EOF淌度（eo）。第八章 高效毛细管电泳区带增宽的因素（1）扩散 径向扩散影响小，纵向扩散影响大（2）进样（3）温度效应 焦耳热散时形成径向温度梯度为当量电导第八章 高效毛细管电泳由焦耳热引起的分散系数可表示为：一般情况下，如果满足下述方程，那么焦耳热热就不会引起太严重的谱带展宽Ed(c)1/39但是极端pH下蛋白质结构会变化甚至水解。l 加入中性盐，抑制静电吸附作用，但焦耳热大l 加入两性离子化合物如(CH3)3N+CH2CH2CH2SO3-抑制蛋白质吸附l 毛细管内壁涂层 动态或者静态地对毛细管内壁进行涂层处理 抑制吸附的方法在一定程度上会影响EOF，实际样品分析中，应该根据具体情况综合考虑。第八章 高效毛细管电泳（5）电分散 电分散来源于样品塞与缓冲溶液之间电场强度的差异。s样品b背景电解质样品和背景电解质的ef相近电分散小，峰对称。ef比背景电解质小很多的溶质峰拖尾，ef比背景电解质大很多的溶质峰向前倾斜。第八章 高效毛细管电泳（6）检测器 峰的宽度或区带宽度为时间宽度（Wt），实际长度相等的区带产生时间宽度不等的峰，需校正，否则会给计算柱效和定量分析带来误差。检测器的空间宽度（Wd）不同，紫外检测器几百微米，电导检测器小于50微米，需校正第八章 高效毛细管电泳（7）其它增宽因素层流a.两端缓冲溶液不在一个水平面上，高度差诱导产生层流。对于扩散系数小的溶质，以及内径大的毛细管，这种层流的影响非常显著。b.场放大CE中的层流效应。在场放大CE中，由于电场强度（由缓冲溶液浓度不同引起）的非均匀分布，导致局部EOF速度差异，在浓度界面两侧产生电渗压，此压力差使得在高、低浓度区域产生层流。第八章 高效毛细管电泳影响CE分析因素 电泳：pH，缓冲液种类和离子强度，电场强度，温度，添加剂，有机溶剂等。电渗流：pH，缓冲液种类和离子强度，电场强度，温度，添加剂，有机溶剂和毛细管壁的改性等。第八章 高效毛细管电泳毛细管区带电泳（CZE）（capillary zone electrophoresis）原理：在充满电解质溶液的毛细管中，荷质比大小不同的组分在电场的作用下，按照迁移速度的不同而进行分离的。毛细管电泳中使用最为广泛的一种技术。第八章 高效毛细管电泳以球形粒子为例荷质比不同是CZE分离的基础。a.样品分子本身荷质比不同（pH调控）b.与其他试剂作用后产生荷质比差异（配位、形成主客体化合物等）硼酸根-糖；磺化环糊精-样品第八章 高效毛细管电泳CZE分离的调控因素（1）操作电压欧姆定律曲线（最佳电压的选择）第八章 高效毛细管电泳I.恒压-最常用，tm与电压的倒数成正比。如果考虑到焦耳热效应，这种函数关系不成立。II.恒电流-理论证明，tm与电流I成正比，在缓冲溶液浓度较大或者散热差的情况下，使用恒电流操作会得到较好的结果。III.恒功率-严格地讲，毛细管内焦耳热的多少与毛细管内产生的功率成正比，恒功率模式操作可获得好的重现性。IV.程序改变电压、电流或功率，从而提高分离度，改善峰形，优化分析时间。第八章 高效毛细管电泳（2）缓 冲 液I.缓冲溶液类型-影响溶质的流体力学半径II.浓度-离子强度不同，粘度不同III.pH-离解程度不同，电荷不同 pH7.0条 件下分离丹酰化氨基酸时，相同浓度 的 NaH2PO4比 KH2PO4的 分离度高，分析时间短。分离glycoformsA：乙 酸 盐0.1mmol/L，Ph4.0；B：乙酸盐-磷酸盐，0.1mmol/L，Ph4.0；第八章 高效毛细管电泳缓冲液选择方法：a.有好的缓冲容量b.尽可能选择浓度大而产生电流小缓冲溶液，即分子大而荷电小的缓冲介质c.表观淌度接近样品的表观淌度d.不影响检测e.常用的缓冲溶液有磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷（Tris）以及一些两性有机离子化合物如2-N-环己基乙磺酸等。第八章 高效毛细管电泳（3）添加剂a.控制EOF大小和方向b.抑制吸附c.稳定溶质的结构如蛋白质的三级结构d.增加疏水溶质的溶解度e.扩大分离对象，如添加手性物质进行手性分离，添加络和剂分离中性分子等。第八章 高效毛细管电泳i.表面活性剂-浓度低于其临界胶束浓度，用作助溶剂和离子对试剂，或壁表面改性剂ii.中性盐-减弱静电作用，抑制管壁对生物大分子的吸附作用，某些盐如LiCl可稳定蛋白质的三级结构的作用iii.两性离子添加剂-抑制管壁对生物大分子的吸附作用iv.有机溶剂-EOF降低、粘度降低、离子强度降低，电导率降低、脂溶性样品溶解度增加。例如在30%有机溶剂存在下，SO42-/NO3-的迁移顺序会发生反转。v.手性添加剂-环糊精衍生物、冠醚衍生物进行手性物质分离vi.尿素等起到助溶和改变分离选择性的作用。第八章 高效毛细管电泳（4）温度i.温度增加，粘度减小，淌度增加，分析速度加快，但扩散增加ii.温度高时进样体积大。压力进样，溶液粘度小了，因此进样体积大。电迁移进样，离子淌度大了，毛细管电流大，进样体积同样增大iii.引起生物大分子结构和生物特性发生变化iv.影响溶质化学平衡第八章 高效毛细管电泳温度对肌红蛋白分离的影响原因是血红素中的Fe由Fe（III）还原成Fe（II），温度升高加速还原的发生和进行（氨基酸残基作为还原剂）。第八章 高效毛细管电泳50mmol/LNa2B4O7（pH9.3）1、甘露糖；2、半乳糖；3、葡萄糖；4、木糖 20C时，峰显著宽而且葡萄糖与木糖分不开。温度升高，分离效率明显增大。原因是络和反应平衡速度加快，产生更加窄的峰。温度对单糖CZE分离的影响第八章 高效毛细管电泳CZE动态分离 前面讲的CZE，是样品在均匀电场下进行分离的。类似于液相色谱中的梯度淋洗，动态调节背景电解质的组成（浓度、pH），可以在CE分离中形成梯度变化，或者局部基质动态变化，即在非稳态介质中和非均匀电场下进行CZE分离。第八章 高效毛细管电泳非均匀电场下的CZE分离：外加电压前，毛细管充满电解质1，称为初始电解质。其电阻率为r1，R=Lr1为毛细管内电阻。因为填充的是均匀电解质，因此纵向的电场是均匀的。在外加电压下，电解质2将从阳极连续流入毛细管，2称为置换电解质，电阻率为r2。当r1与 r2不相等时，毛细管内电场就随着时间变化，形成非均匀电场。第八章 高效毛细管电泳非均匀电场的特性a.置换电解质前沿到达毛细管出口之前的任何时刻，毛细管内存在两个不同电场；b.电场强度随置换电解质进入毛细管的速度而变化。当置换电解质充满毛细管后，毛细管内又重新建立起均匀电场分布。设时间t时置换电解质进入毛细管的长度为L，则有：第八章 高效毛细管电泳在置换电解质中的电势差和电场强度分别为：第八章 高效毛细管电泳同样可以得到充有初始电解质的部分的电场强度为:由上述式子可知：（1），置换电解质与初始电解质相同，是均匀电场的情况；（2），纵向电场强度不均匀，而且随时间变化。多数情况下，CZE中离子强度较小，可以用浓度比代替电阻率来计算。第八章 高效毛细管电泳不同时电场强度随置换长度的变化情况第八章 高效毛细管电泳非均匀电场下不同溶质的迁移速度 下面考虑 ，即 情况下离子的迁移速度。由于非均匀场强下，电渗流EOF不能保持恒定，为了简化，采用平均EOF表示。对于阳离子，其表观速度大，在置换电解质前面迁移。因为 比均匀电场低，而且越来越小，因此它的迁移速度越来越慢；对于阴离子，其迁移方向和EOF方向相反，表观速度慢，总是在置换电解质区域迁移，而且在置换电解质充满毛细管后才流出。负电荷少的先流出，多的后流出。非均匀电场强度的使用可以改善选择性，更有价值的是利用非均匀电场进行样品堆积，提高检测灵敏度。第八章 高效毛细管电泳CZE中pH梯度动态分离 在CZE装置中，控制由电极池进入毛细管中的H+离子的流动速率，或者是通过温度诱导pH变化，能够在毛细管内形成pH梯度。三极式pH梯度CZE分离装置 毛细管安装在两个电极部件之间，上端有两个电极槽，其中一个与下端缓冲溶液相同，另一个不同（pH不同，如HCl）。通过电流比率控制器C改变两个电极槽的电流比，从而控制H+离子流入毛细管的速率，实现pH梯度。第八章 高效毛细管电泳pH梯度CZE分离示意图 第八章 高效毛细管电泳瞬间离子基体效应CZE动态分离 离子的有效淌度受到周围离子的影响，由其周围离子所形成的包围圈，称为离子基体。常规CZE中离子基体都是恒定不变化的，因此在恒电场下迁移速度恒定。如果在某一个时间间隔上遇到一个不同组成的离子基体区带，这个离子基体区带就会对样品组分产生影响，使它们的淌度以及淌度差发生瞬时变化，从而选择性地影响溶质的迁移和分离。第八章 高效毛细管电泳 瞬时离子基体（transient ionic matrix，TIM）不是固定在某一位置，而是从柱子的一端移动到另一端，是一个动态过程。每一次分离都要产生一个TIM。TIM在分离柱外添加，然后电迁移进入柱子并在柱子中移动。其方向可以和样品方向相同也可以相反。相同的话要求它的淌度比样品大。离子基体由任何溶剂化离子和络和离子形成。第八章 高效毛细管电泳利用TIM效应进行CZE分离的示意图，这里TIM方向和样品迁移方向相反 第八章 高效毛细管电泳。DNB和 DNS的 淌 度 几 乎 相 同，在 0.01mol/L的NaNO3溶液中不能分离。加入0.01mol/LCu(NO3)2作为络和离子后得到分离。Cu2+和DNS络和，使DNS淌度减小，迁移速度降下来。由于Cu2+比Na+淌度大，因此先到达检测点，对检测无影响。3，5-二硝基苯甲酸（DNB）和3，5-二硝基水杨酸（DNS）的分离第八章 高效毛细管电泳毛细管区带电泳操作小结a.毛细管恒温，确保迁移时间重复性b.样品均能溶于缓冲液，防止沉淀堵塞柱子c.分析蛋白质等，常采用涂渍柱或添加剂抑制吸附d.选择最佳操作电压e.用缓冲液组成(或pH及添加剂浓度等)对淌度作图以选择最佳的缓冲液体系f.缓冲液宜经常更换g.样品和缓冲液贮器均要加盖，注意蒸发问题h.样品溶液的电导率宜等于或小于本底电解质i.为克服样品蒸发及CE定量重现性，应采用一个内标j.对未涂渍的毛细管，宜用0.1N的NaOH定期清洗k.连续多次进样确定平衡建立与否，实验是否有效第八章 高效毛细管电泳胶束电动毛细管色谱MEKC（micellar electrokinetic chromatography）以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的巧妙结合。MEKC是基于溶质在胶束中的不同分配进行分离的，其突出的优点是除了能够分离带电荷的离子化合物外，还可以分离不带电荷的中性分子。但是，MEKC对样品分子量大小局限在小于5000，而CZE则没有这个限制。第八章 高效毛细管电泳基本原理溶质和胶束的相互作用涉及到静电力、范德华力（定向力、诱导力、色散力）和氢键作用力等。第八章 高效毛细管电泳迁移时间窗口及其扩展（1）迁移时间窗口 中性溶质的迁移时间（t0）与完全溶于胶束的溶质迁移时间（tmc）之间的时间间隔（t0-tmc）；在胶束中有一定溶解力的溶质的迁移时间落在时间窗口内，即t0tRtmc。迁移时间窗口常用迁移时间比t0/tmc来表示，t0/tmc越小，时间窗口越宽。第八章 高效毛细管电泳（2）迁移时间窗口的测定 测定t0的标记物必须是中性的，而且完全不溶于胶束。甲醇在胶束中的作用几乎可以忽略，所以常用作测定t0的标记物。用作胶束的标记物要求100%溶于胶束，因此，凡不溶于水，能完全溶于胶束的化合物都可以。苏丹III或苏丹IV是常用的胶束标记物。对于阴离子SDS胶束，盐酸喹啉也是很好的标记物。第八章 高效毛细管电泳（3）迁移时间窗口的扩宽 MEKC 的一个主要问题是迁移时间窗口的范围有限。因为MEKC中的峰容量（定义为给定的保留时间范围内能够被分辨的峰的最大数目n）与ln(t0/tmc)直接相关。因此，扩大迁移时间窗口，对于复杂样品的分离有重要的意义。第八章 高效毛细管电泳从上式可以看出，扩展时间窗口的途径有两个：q 改变胶束迁移速度q 改变电渗流速度一般情况下，胶束电泳方向和电渗流方向相反，但速度小于电渗流。第八章 高效毛细管电泳 改变胶束速度：a)短链的表面活性剂，胶束小、电泳速度高、时间窗口宽；但保留时间重现性差，CMC高，分离电流大，焦耳热严重，柱效低。b)加入高浓度尿素，可以减小t0/tmc。c)辛基葡糖苷硼酸盐络和作用形成带负电的胶束，改变硼酸盐浓度，pH等可以方便地改变胶束表面的电荷密度，从而影响其Zeta电势，改变淌度，达到扩大迁移时间窗口的目的。第八章 高效毛细管电泳 扩大迁移时间窗口的更为有效的办法是调节EOF大小。CZE中影响EOF大小的因素在MEKC中同样适用。缓冲溶液的组分、浓度，pH、有机添加剂、温度、毛细管内壁涂层，以及加径向电场梯度直接控制Zeta电势等方法都可以用来改变EOF大小从而扩宽迁移时间窗口。第八章 高效毛细管电泳容量因子和分离因子 MEKC中容量因子定义为样品进入胶束和在水相中的量之比。即：其中Kd为溶质在胶束和水相之间的分配系数，Vmc、Vaq分别为胶束和水相的体积、Vmol为胶束的摩尔体积，S为胶束的浓度，CMC为临界胶束浓度。容量因子反映了溶质和胶束的作用程度。(37)第八章 高效毛细管电泳 对于中性分子，容量因子与S成线性关系。对于离子化合物，由于存在多种形式，因此其容量因子是各中形式的贡献的加权平均。分离因子又称为选择性因子，定义为：表示了两组分之间分配系数大小的相对差异。第八章 高效毛细管电泳 分配系数是给定体系的特征参数，通过改变胶束类型或者水相，可以改变分配系数，从而控制分离选择性。影响MEKC的选择性的因素有：（1）温度；（2）表面活性剂类型；（3）胶束的修饰，如采用混合胶束；（4）水相修饰，如改变缓冲溶液pH等；（5）加入不同的添加剂。第八章 高效毛细管电泳淌度和迁移时间 在电解质-胶束体系中，中性溶质的有效淌度为：所以中性溶质的表观淌度为：第八章 高效毛细管电泳通过控制外加电压、电渗淌度和胶束有效淌度等参数来改变迁移时间。第八章 高效毛细管电泳分离效率和分离度 柱内效应主要有:a)纵向扩散b)胶束增溶作用中的吸附-解吸动力学c)水相中胶束间的质量传输d)径向温度梯度效应e)胶束的电泳分散第八章 高效毛细管电泳纵向扩散项：吸附-解吸：传质：温度：电分散：第八章 高效毛细管电泳基于色谱原理导出MEKC分离度方程为：假设两组分相当靠近，用函数f(k)表示后两项，得到：第八章 高效毛细管电泳以不同迁移时间窗口t0/tmc值作f(k)k曲线图，得：f(k)k关 系曲线，t0/tmc从上到下分别为0，0.1，0.2，0.25，0.3图中t0/tmc等于0的曲线，相当于常规色谱的情况。k越大，分离度越高。然而，从MEKC的分离角度表明，k不是越大越好。第八章 高效毛细管电泳最佳的k依赖于t0/tmc，理论研究表明，最优化分离度对应的k为：第八章 高效毛细管电泳MEKC中的胶束假相q 对溶质的作用力不同，从而影响分离选择性。q 影响电渗，甚至转向等。q 改变迁移窗口，因而可改变系统的峰容量。q 混合胶束的使用可增加分离的选择性。第八章 高效毛细管电泳表面活性剂可以分为以下几类：阴离子表面活性剂;阳离子表面活性剂；两性离子表面活性剂；非离子表面活性剂非离子型常和离子型一起使用形成混合胶束 胆汁盐，是肝中合成的一种天然生物活性剂，具有甾体结构。胆汁盐与SDS相比：极性高，对多数溶质可得到较小的k值；手性，能用于某些光学异构体化合物的分离。第八章 高效毛细管电泳胶束假固定相的选择与改良：形成稳定的胶束，而且与溶质的缔合速度尽可能快；CMC低，CMC太高，导致离子强度增大，电泳电流大，焦耳热影响大；形成的胶束必须是均匀、透明的溶液，不影响检测；胶束粘度小，以保持大的EOF速度。第八章 高效毛细管电泳 选择方法：a)对大多数中性溶质，SDS具有广泛的适用性；b)对于极性溶质，含有不同极性基团的表面活性剂表现出不同的选择性，甚至改变出峰顺序；c)对易被管壁吸附的大分子的分离，可以选择阳离子胶束体系，这个时候要注意EOF方向；d)对于离子溶质的分离，疏水性和电荷都影响分配系数，电荷极性不同的胶束体系产生不同的选择性，所以要选择与溶质带电荷相反的胶束，才能产生强的相互作用进入胶束。第八章 高效毛细管电泳e)对于强疏水性溶质，可以选用极性强的胶束体系，如胆汁盐等。f)对于手性物质的分离，需要手性胶束如胆汁盐、十二烷基脯氨酸等。g)某些胶束具有特殊的选择性，如全氟化的烷烃链表面活性剂对氟化物表现出强的选择性，有些场合用非离子性或者两性离子表面活性剂能够得到很好的分离。第八章 高效毛细管电泳胶束改良技术：胶束的类型、浓度及其组成，影响胶束的大小，聚集数及几何形状，因而影响其与溶质的相互作用或增溶作用。为了获得更理想的胶束假相，发展了胶束改良技术。常用的有采用混合胶束和改变表面活性剂的对离子。第八章 高效毛细管电泳1)将非离子型表面活性剂加到离子性表面活性剂中形成混合胶束，体积增大但是表面电荷减小，因此胶束的电泳淌度降低，迁移时间窗口变窄，选择性明显改变。例如用非离子性手性表面活性剂如甘草酸、b-七叶酸等与SDS混合后用于拆分手性异构体。2)用有机离子对试剂可以改善分离度。例如在SDS中加入四烷基铵，作为一个对离子与负离子SDS胶束结合，因而显著改变胶束的特性。对于复杂样品的分离有用。第八章 高效毛细管电泳影响MEKC分离的因素 胶束浓度 实验表明，容量因子与表面活性剂的浓度成线性关系。胶束含量增加，溶质迁移时间增加，分离选择性增加。但溶液的电导率增高，产生有害的热效应，影响高电压的使用。实际操作中，浓度不低于CMC的1.1倍，上限根据体系的总离子强度大小、粘度及电流大小等因素，一般控制在200mmol/L之内。标准条件为：30-100 mmol/L。浓度太低，稳定性差，样品容量小，重现性差。第八章 高效毛细管电泳 pH值 除了影响电泳、电渗流外，pH在MEKC中影响迁移时间窗口，溶质和胶束的相互作用。如：-荼酚胺为例，在低pH时，氨基会质子化，因此，会加强和胶束的静电吸引作用，从而增加迁移时间。反之，酸性组分在pH较大时会失去H+，成为带负电的粒子。与SDS胶束带相同的电荷，产生一种排斥效应，溶解度减小，保留时间提前。离子强度：和CZE相似，影响电渗流、电泳和焦耳热。第八章 高效毛细管电泳添加剂 有机溶剂：（1）会降低Zeta电势，使电渗流降低，扩大迁移窗口，增加峰容量。例如，在0.05mmol/L胆酸钠中加入12%的甲醇，成功地分离了联萘酚BNOH，联萘酚磷酸脂BNPO4的对映体。第八章 高效毛细管电泳（2）影响溶质的分配系数，可以优化分离度。加入有机溶剂，分配平衡向水相移动。疏水性较弱的溶质相对于疏水性强的平衡移动大些，在胶束中分配系数减小得更多一些，从而可以优化分离。SDS不加甲醇，无法分离。加入20%甲醇时，由于氘代DNS-NHCD3的平衡分配系数更多地移向水相，容量因子减小更多而和DNS-NHCH3分离。第八章 高效毛细管电泳（3）使胶束的结构疏松而使溶质进出胶束的传质过程加快，可提高分离效率。（4）阻止溶质和胶束的强相互作用，有利于强疏水性溶质的分离（5）减小毛细管壁的吸附作用。（6）实现MEKC梯度淋洗。甲醇和乙腈用得最多，浓度控制在5-25之间为宜。第八章 高效毛细管电泳环糊精改良的MEKC（CD-MEKC）：环糊精是由6-8葡萄糖单元组成的圆筒状手性分子，分别称为-CD、-CD、-CD。其外部是亲水性羟基，内腔是疏水性的。当CD加入到胶束溶液中时，体系有三个相，水相、CD相和胶束相，溶质在三相之间分配，从而产生不同的溶质迁移和手性分离。第八章 高效毛细管电泳 尿素：q增溶，大多数溶质有效果q对SDS胶束，可以改变其迁移时间，随尿素浓度增大而增加，但是EOF速度不发生明显变化，因此迁移时间窗口增大，有利于改善分离度。q对于大多数溶质，假如高浓度尿素可降低保留因子。q有助于加快溶质从水相到胶束相的输送过程。q电流线性减小，粘度稍有增加。第八章 高效毛细管电泳金属离子和硼酸盐：金属离子可以静电吸附在胶束表面，与溶质产生选择性络和作用，因而可控制分离的选择性。硼酸盐可以和一些溶质形成带负电荷络和物，从而影响分离。第八章 高效毛细管电泳MEKC达到高效快速分离的原因：o 电渗流的扁平流型，大大减小了径向速度梯度；o 毛细管柱的细管径以其极高的散热效率减小了由高电场强度引起的热效应；o 胶束本身是动态结构，因而溶质进出方便迅速，使传质速度加快。第八章 高效毛细管电泳毛细管凝胶电泳（CGE）在自由溶液区带电泳中派生出一种用凝胶物质作为支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。凝胶作为一种固态胶体分散体系，具有多孔性，形成网状结构。因此它有一种类似于分子筛的作用，通过它的物质会按照分子的大小逐一被分离开。应用最多的是交联和非交联聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel,PAG）。第八章 高效毛细管电泳 CGE是蛋白质、多肽、寡核苷酸、DNA等生物大分子分离分析的有力工具。特别是和激光诱导荧光检测技术结合，成为DNA快速测序的优选方案。CGE中主要存在两个问题：（1）常用的丙烯酰胺单体在毛细管中聚合成凝胶时极易形成气泡；（2）电泳期间毛细管中也常常形成气泡。按照材料来源的不同，凝胶实际上又可分为无机凝胶和有机凝胶两大类，多孔硅胶和多孔玻璃属于前者，葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖等属于后者。第八章 高效毛细管电泳聚丙烯酰胺凝胶毛细管的制备（1）毛细管内壁处理：用碱溶液、酸溶液、甲醇清洗后，冲入双功能团试剂如-甲基丙烯酰氧基三甲氧基硅烷（MAPS），室温反应至少3小时，然后用甲醇和水冲洗。这样处理后得到键和有双键的表面，在丙烯酰胺聚合时双键参与聚合从而将凝胶固定增加稳定性。第八章 高效毛细管电泳（2）聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺（Acr）、交联剂甲撑双丙烯酰胺（Bis），在过硫酸胺（APS）-四甲基乙二胺（TEMED）化学聚合或者核黄素-TEMED光聚合系统催化下聚合完成。溶液需脱气（3）聚合溶液引入毛细管，进一步与管壁双键进行反应。第八章 高效毛细管电泳 气泡的消除：n加压条件下或者减压条件下聚合n采用逆向电泳法聚合：在充满聚合溶液的毛细管中，通过逆向电泳将催化剂和引发剂从毛细管一端引入进行交联，聚合时凝胶收缩产生的溶液空缺由从容器中引入的单体溶液得到实时补充。n加入消泡剂或变性剂，如乙二醇、甲酰胺等。第八章 高效毛细管电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳特点：1.凝胶粘度大，抗对流，能减少溶质的扩散，峰型尖锐，柱效极高，达到107塔板/米。2.分离度达到可以分辨DNA片段单碱基的能力。3.迁移时间重现性好。4.稳定性和寿命与凝胶本身有关，好的凝胶可以重复使用150200次。5.当被分离的分子的大小与凝胶的孔径相当时，其淌度与尺寸大小有关，淌度随蛋白质分子量的增加而递减。6.毛细管凝胶电泳比平板凝较电泳具有更好的自动化和定量分析性能。第八章 高效毛细管电泳影响CGE分离的因素：1.管壁预处理后（硅烷化），得到更加对称的峰形；2.凝胶浓度低，孔径大，溶质迁移速率增大，分离速度快；3.缓冲溶液pH：pH影响溶质的淌度。制备凝胶的溶液pH与操作缓冲溶液pH不相同时，需要平衡一段足够长的时间。平衡时间对分离度、峰序和流出时间有影响。这些现象的原因还不十分清楚，但提醒人们，除非特殊情况，否则聚合溶液pH与操作缓冲溶液pH尽可能相同。第八章 高效毛细管电泳4.温度升高，电阻降低，在恒压模式下电流增大。对于DNA限制片段，柱效降低。5.电场强度越高，迁移速率越快。对于较小分子，迁移速度与E成正比；但对于较大的分子，则偏离线性，迁移速度比预期的更快。第八章 高效毛细管电泳假设相邻峰峰宽相同，分离度可以近似表示为：显著依赖两组分的相对淌度差（）和峰的总方差。电场强度对相对淌度差的影响和分子大小有关。对于较小的分子，相对淌度差受E影响小，随着E增大，分离度增大。当E进一步增大时，由于焦耳热导致的温度效应而降低；对于大分子，相对淌度差随E增大显著减小，从而导致分离度降低，这就是分子量很大的分子需要在低电压下分离的原因。第八章 高效毛细管电泳凝胶柱的操作特点1.毛细管柱接到仪器上后，应立即使其通入缓冲液，以避免脱水，防止胶的干裂。2.先用标准化合物运行一遍以确保仪器和柱子性能正常。3.凝胶电泳通常采用电动进样，如果采用压力进样，胶可能被从毛细管中挤出。4.柱子可以在较高温度下运行。（扩散系数小）第八章 高效毛细管电泳4.使用的电场强度需低于400Vcm，否则易使柱内凝胶龟裂。5.样品溶液的离子强度要低，以尽可能增大进样量。离子强度对定量和分离效率特别重要，它的变化还会导致响应因子的变化。6.采用系列标准物以确保相对迁移时间的重复性。7.缓冲液宜经常更换。第八章 高效毛细管电泳其他筛分介质1.琼脂糖（AG），空隙大，机械强度高，生物惰性，有很好的抗对流性。分离DNA时，分离度稍差，但迁移速度快2.Hydrolink胶，与PAG相比，有较高的机械强度和样品负载，但柱子的重现性、稳定性和分离性能有待提高。3.高聚物溶液筛分介质：葡聚糖和聚乙二醇等。特点是装柱容易，不会出现气泡，电泳后能够方便地从毛细管中排出。此外是紫外透明的。选择性和柱效与线性PAG相当。(无胶筛分)第八章 高效毛细管电泳 无胶筛分电泳中，较为常用的是甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素。这些聚合物溶于水后，在浓度较高时，可形成类似于凝胶的多孔结构，从而进行筛分分离。纤维素衍生物种类较多，分子量大小及粘度各异，对不同大小的DNA片段分析。无胶筛分电泳操作简单，化学性质稳定，正受到愈来愈广泛的重视。第八章 高效毛细管电泳溶质在凝胶柱中的迁移模型Ogston模型 假设基质由互相连接的无规则网络所组成，其空隙平均孔径为x。迁移的溶质就象一个半径Rg的不变形粒子。因此，较小的分子有更多的孔隙可以利用而迁移速度快。根据这种假设，溶质在凝胶中的电泳淌度为：0是溶质在自由溶液中的淌度，r是股绳厚度。第八章 高效毛细管电泳 Ogston模型未考虑电场强度对粒子形状的影响，因此只适合低电场强（）的场合。当也不适用。Ogston模型 爬行模型第八章 高效毛细管电泳爬行模型 假设溶质向线性链条一样在网络中运行，用固定的障碍O1、O2等来描述网络。溶质要避开这些障碍前进，象蛇一样爬行（reptation）。在零电场情况下，有 ，n为高分子重复单元个数。表明在低电场下，淌度和溶质质量成反比。修正后的爬行模型可以推广到高电场。在电场作用下，溶质分子被拉伸，电场越强，拉伸越强，极限情况下成为棒状。此时，淌度不再依赖分子大小，于是有K常数，f是x、溶质电荷和稳定性的函数。第八章 高效毛细管电泳毛细管涂层技术涂层改性的目的q 改变EOFq 抑制样品吸附方法 动态方法：改变pH、离子强度、加入添加剂 涂层：物理吸附或化学键合方法第八章 高效毛细管电泳涂层要求o 容易制备o 批-批涂层处理的毛细管之间重现性好o 在宽的pH范围内有高的分离效率o在宽的pH范围内稳定性好o 有效抑制吸附，控制EOF第八章 高效毛细管电泳涂层种类（1）物理吸附：方法简单，稳定性和重现性较差。（2）化学键合：利用有机硅烷的亲水基团与硅羟基反应化学键合，然后再用不同的物质去活。稳定性好，应用最多。常用的涂层物质有：甲基纤维素，聚丙烯酰胺，聚乙二醇、聚乙烯基吡咯酮、聚甲基硅氧烷等。第八章 高效毛细管电泳涂层性质及对溶质保留的影响q 大多数降低管壁表面电荷，降低EOF；q 荷正电的聚乙烯亚胺（PEI）涂层使EOF反向；q 乳清蛋白涂层等呈两性，EOF随pH和操作参数改变而变化q 减小蛋白质的吸附，得到较高的分离度和好的峰形。如交联的聚丙烯酰胺涂层，在很长时间内EOF十分平稳，分离蛋白质的重现性也很好。操作600次后仍能得到很好的精度。第八章 高效毛细管电泳毛细管进样技术常规进样常规进样 流体力学进样：通过虹吸、在进样端加压、或者检测端抽空等方法。虹吸进样时优点：对样品没有歧视现象，即保持各组分在样品瓶中的浓度比不变化。第八章 高效毛细管电泳 电动（电迁移）进样：将进样端的缓冲溶液瓶换成样品瓶然后加电压实现进样。进样量为特点：产生进样歧视，但方法简单，当缓冲溶液粘度大的时候，特别是CGE情况下很适合。第八章 高效毛细管电泳预浓缩进样预浓缩进样q毛细管进样体积小，对检测器灵敏度要求高q低浓度样品检测的需要1)场放大进样 样品溶解在与操作缓冲溶液成分相同的稀缓冲溶液或纯水中，样品溶液的电阻率s将高于毛细管中背景电解质的电阻率b。第八章 高效毛细管电泳样品堆积：样品塞中的离子以快的速度迁移至区带前沿，直至进入到电场强度为Eb的高浓度缓冲溶液区域而变慢下来，于是导致样品塞中离子堆积（stacking）在高浓度的缓冲溶液界面上。通过浓度界面的离子流必须保持平衡：因为所以第八章 高效毛细管电泳样品离子数必须保持恒定，因此样品带宽必须相应地缩短倍：q正、负离子都适用，通常阳离子堆积在样品塞前沿，阴离子堆积在样品塞后沿。q忽略了电渗流的影响。由于局部电场不均匀，会引起层流，产生附加的峰增宽，抵消一部分堆积效果。第八章 高效毛细管电泳 几种场放大进样方式i.导入样品塞后切换极性，排出样品基体（阴离子）a.溶解在水中的样品导入毛细管；b.加反极性电压，EOF将水塞排出，阴离子以非常高的速度堆积到高浓度缓冲溶液区域；c.电流值达到初始值的95%，极