AP标记技术.pdf

碱性磷酸酶（AKP）标记抗体（戊二醛法）1 取 0.2ml AKP（含 2mg），与 0.1ml 纯化的 IgG（含 1mg）混合，加 PBS到 0.5ml。2在 0.5ml AKP/抗体混合液中加4l 25 戊二醛，室温放置2 小时。3向反应物中加 PBS到 2ml，4中对 PBS透析过夜。透析物用Tris 缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl pH7.4，1mmol/L MgCl2，0.04 NaN3，5 BSA）稀释到 5ml，4可保存 1 年以上。辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（过碘酸钠法）1取 5mg HRP 溶于 0.5ml 双蒸水中，加 0.5ml 新鲜配制的 60mmol/L NaIO4水溶液，4中避光搅拌 30 分钟，加 0.5ml 160mmol/L 乙二醇水溶液，室温中继续搅拌 30 分钟。2加 1ml 纯化的 IgG（5mg）水溶液，混匀后置透析袋中，对50mmol/L pH9.5的碳酸钠缓冲液透析6 小时或过夜。3向透析物中加 0.2ml 5mg/ml NaBH4水溶液，4搅拌 2 小时。继续 4搅拌，20 分钟内逐渐加入等体积饱和硫酸铵，再4搅拌 30 分钟。44000g 离心 30 分钟，去上清液。用1ml 20mmol/L pH7.4 磷酸缓冲液溶解沉淀物，对 20mmol/L pH7.4 磷酸缓冲液透析过夜。4000g 离心 20分钟，除去不溶物。加上述磷酸缓冲液到5ml。鉴定标记物。5分装后冻干保存或加甘油到40（v/v）分装后 4或 20保存。12 年活性不变。6测定标记物的 OD403和 OD280。标记率 OD403/OD280标记率应是 0.3 0.6，即每个 IgG 结合 12 个 HRP 分子。酶含量（mg/ml）OD4030.4 IgG 含量（mg/ml）（OD280OD4030.42）0.94 0.62 标记物的克分子比值酶含量4/IgG 含量比值应在 12 之间。用半乳糖苷酶标记抗体1取 1mg纯化的抗体蛋白，溶于1ml 含 50mmol/L NaCl的 0.1mol/L pH7.5 磷酸缓冲液中。立即加入10l 含 0.25mg MBS的四氢呋喃，30水浴 1 小时。2反应液经 BioGel P-30 层析柱过滤除去未结合的MBS，层析柱用含 50mmol/L NaCl的 10mmol/L pH7.0 磷酸缓冲液平衡和洗脱。3立即向洗脱物中加1mg新鲜配制的半乳糖苷酶水溶液，30标记 1 小时。加入 2mol/L 2-巯基乙醇到终浓度2mmol/L，终止反应。4加入 BSA和 NaN3分别到终浓度 0.1 和 0.05，4中可保存 1 年以上，不要冻存！。生物素抗体的方法1将 40mg羟基琥珀亚胺生物素脂溶于1ml 二甲基甲酰胺中，20保存。2用 0.1mol/L pH8.0 碳酸钠缓冲液透析抗体制剂，去除小分子物质。用透析液将抗体配制到 10mg/ml。抗体浓度低时，生物素化率也低。3在 1ml 抗体溶液中加 50l 羟基琥珀亚胺生物素脂保存液，混合后室温反应2 小时。4对 PBS透析，除去未结合的羟基琥珀亚胺生物素脂，加等量甘油，20保存。标记步骤（1）取抗体（2 5mg/mL）1mL，加入 AP 5mg 溶解。（2）装入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4 透析 18h，换液 3 次。（3）加入 2.5%戊二醛 20uL，室温（20）放置 2h。40.01mol/L、pH7.2PBS透析过夜，换液 3 次。（4）移入 0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液中，4透析过夜，换液3 次。（5）取出标记抗体，用含%BSA 和 0.02%NaN3的 Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原液。（6）加入 1/3 量纯甘油，测定工作效价后，小量（0.1mL）分装，4保存（使用前以pH7.4PBS-吐温溶液将结合物适当稀释）。