液相色谱分析精选课件.ppt

关于液相色谱分析2023/3/12023/3/1第一页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1 一一 、HPLC HPLC发展历史发展历史3 3-1-1 高效液相色谱法简介高效液相色谱法简介 二二 、特点特点高压、高压、高速、高效、高灵敏度高速、高效、高灵敏度经典经典LCHPLCHPLC第二页，本课件共有59页2023/3/12023/3/13 3-1-1 高效液相色谱法简介高效液相色谱法简介 三三 、种类、种类 四四 、应用、应用液液-固色谱固色谱固色谱固色谱 液液液液-液色谱液色谱 离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱 凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱生化分析、食品分析、环境分析、生化分析、食品分析、环境分析、医药分析医药分析第三页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1五五 高效液相色谱仪组成高效液相色谱仪组成高效液相色谱仪组成高效液相色谱仪组成第四页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1第五页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1高效液相色谱仪的结构流程图高效液相色谱仪的结构流程图第六页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1HPLCHPLC仪包括：高压输液装置仪包括：高压输液装置仪包括：高压输液装置仪包括：高压输液装置;进样系统进样系统进样系统进样系统;分离系统分离系统分离系统分离系统;检测系检测系检测系检测系统统统统;和数据处理装置。此外还配有梯度淋洗、馏分收集器。和数据处理装置。此外还配有梯度淋洗、馏分收集器。和数据处理装置。此外还配有梯度淋洗、馏分收集器。和数据处理装置。此外还配有梯度淋洗、馏分收集器。第七页，本课件共有59页2023/3/12023/3/11.1.高压输液系统高压输液系统高压输液系统高压输液系统1 1）贮液器：）贮液器：）贮液器：）贮液器：1-21-2L L的玻璃瓶，配有溶剂的玻璃瓶，配有溶剂的玻璃瓶，配有溶剂的玻璃瓶，配有溶剂过滤过滤过滤过滤器器器器(NiNi合金合金合金合金)，其孔约，其孔约，其孔约，其孔约2 2 mm，可防止颗粒物进入泵内。可防止颗粒物进入泵内。可防止颗粒物进入泵内。可防止颗粒物进入泵内。脱脱脱脱 气气气气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。第八页，本课件共有59页2023/3/12023/3/12 2）高压泵：）高压泵：）高压泵：）高压泵：要求：要求：要求：要求：密封性好、密封性好、密封性好、密封性好、压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀 种类：恒压泵和恒流泵。种类：恒压泵和恒流泵。种类：恒压泵和恒流泵。种类：恒压泵和恒流泵。恒恒恒恒压压压压泵泵泵泵（气气气气动动动动放放放放大大大大泵泵泵泵）：利利利利用用用用大大大大面面面面积积积积的的的的其其其其他他他他活活活活塞塞塞塞驱驱驱驱动动动动小小小小面面面面积积积积液液液液体体体体活活活活塞塞塞塞面面面面，按按按按照照照照活活活活塞塞塞塞面面面面积积积积比比比比，以以以以很很很很小小小小的的的的气气气气体体体体压压压压力力力力可可可可达达达达到到到到相相相相当当当当高高高高的的的的液液液液压压压压把把把把流流流流动动动动相相相相送送送送入入入入色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱。体体体体积积积积和和和和重重重重量量量量都都都都很很很很大大大大，现现现现仅仅仅仅作作作作为为为为液相色谱柱的填装泵使用液相色谱柱的填装泵使用液相色谱柱的填装泵使用液相色谱柱的填装泵使用 第九页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1恒恒恒恒流流流流泵泵泵泵（往往往往复复复复泵泵泵泵）：是是是是目目目目前前前前液液液液相相相相色色色色谱谱谱谱使使使使用用用用最最最最普普普普遍遍遍遍的的的的一一一一种种种种高高高高压压压压泵泵泵泵，优优优优点点点点是是是是泵泵泵泵头头头头内内内内腔腔腔腔体积小，容易清洗，便于换溶剂。体积小，容易清洗，便于换溶剂。体积小，容易清洗，便于换溶剂。体积小，容易清洗，便于换溶剂。单单单单头头头头往往往往复复复复泵泵泵泵：单单单单头头头头往往往往复复复复泵泵泵泵依依依依靠靠靠靠变变变变速速速速同同同同步步步步电电电电机机机机驱驱驱驱动动动动曲曲曲曲轴轴轴轴，然然然然后后后后带带带带动动动动宝宝宝宝石石石石柱柱柱柱前前前前后后后后往往往往复复复复运运运运动动动动，流流流流动动动动相相相相则则则则从从从从下下下下面面面面通通通通过过过过单单单单向向向向阀阀阀阀吸吸吸吸入入入入泵泵泵泵体体体体，并并并并由由由由上上上上部部部部通通通通过过过过单单单单向向向向阀送出。改变冲程频率可以控制流速阀送出。改变冲程频率可以控制流速阀送出。改变冲程频率可以控制流速阀送出。改变冲程频率可以控制流速双双双双头头头头往往往往复复复复泵泵泵泵：由由由由电电电电机机机机带带带带动动动动凸凸凸凸轮轮轮轮转转转转动动动动，两两两两个个个个宝宝宝宝石石石石柱柱柱柱塞塞塞塞杆杆杆杆随随随随之之之之往往往往复复复复运运运运动动动动、吸吸吸吸入入入入和和和和送送送送出出出出流流流流动动动动相相相相。因因因因为为为为两两两两个个个个柱柱柱柱塞塞塞塞杆杆杆杆来来来来回回回回移移移移动动动动有有有有一一一一个个个个时时时时间间间间差差差差，正正正正好好好好补补补补偿偿偿偿流流流流动动动动相相相相输输输输出出出出的脉冲，使得流速相当平稳的脉冲，使得流速相当平稳的脉冲，使得流速相当平稳的脉冲，使得流速相当平稳第十页，本课件共有59页2023/3/12023/3/12.2.梯度洗提装置：梯度洗提装置：梯度洗提装置：梯度洗提装置：梯度洗提：就是载液中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一梯度洗提：就是载液中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一梯度洗提：就是载液中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一梯度洗提：就是载液中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的容量因子和选择因子，以提高分离效果。分的容量因子和选择因子，以提高分离效果。分的容量因子和选择因子，以提高分离效果。分的容量因子和选择因子，以提高分离效果。应用梯度洗提可以提高分离效果，缩短分析时间，提高分辨能力和应用梯度洗提可以提高分离效果，缩短分析时间，提高分辨能力和应用梯度洗提可以提高分离效果，缩短分析时间，提高分辨能力和应用梯度洗提可以提高分离效果，缩短分析时间，提高分辨能力和定量分析的精度。定量分析的精度。定量分析的精度。定量分析的精度。注意注意注意注意：（1 1）溶剂纯度高，以保证良好的重现性溶剂纯度高，以保证良好的重现性溶剂纯度高，以保证良好的重现性溶剂纯度高，以保证良好的重现性（2 2）溶剂需互溶，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相）溶剂需互溶，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相）溶剂需互溶，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相）溶剂需互溶，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相（3 3）每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态）每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态）每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态）每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态第十一页，本课件共有59页2023/3/12023/3/13.3.进样系统进样系统进样系统进样系统进样装置包括两种：进样装置包括两种：进样装置包括两种：进样装置包括两种：1 1）微量注射器进样）微量注射器进样）微量注射器进样）微量注射器进样：第十二页，本课件共有59页2023/3/12023/3/12 2）高高高高 压压压压 定定定定 量量量量 进进进进 样样样样 阀阀阀阀：常常常常 用用用用 的的的的 为为为为 六六六六 通通通通 阀阀阀阀。进进进进 样样样样 量量量量 由由由由 样样样样 品品品品 管管管管 控控控控 制，进样准确，重复性好。制，进样准确，重复性好。制，进样准确，重复性好。制，进样准确，重复性好。第十三页，本课件共有59页2023/3/12023/3/14.4.色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱1 1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，不锈钢柱，不锈钢柱，不锈钢柱，柱接头的死体积尽可柱接头的死体积尽可柱接头的死体积尽可柱接头的死体积尽可 能小。柱长多为能小。柱长多为能小。柱长多为能小。柱长多为15301530cmcm，内径为内径为内径为内径为4 4.6.6或或或或3.9mm3.9mm标准柱标准柱标准柱标准柱。2 2）柱的填充：）柱的填充：）柱的填充：）柱的填充：主要采用匀浆法。主要采用匀浆法。主要采用匀浆法。主要采用匀浆法。常常常常用用用用的的的的匀匀匀匀浆浆浆浆试试试试剂剂剂剂有有有有四四四四氯氯氯氯乙乙乙乙烯烯烯烯、四四四四溴溴溴溴乙乙乙乙烷烷烷烷和和和和二二二二碘碘碘碘甲甲甲甲烷烷烷烷等等等等；常常常常用用用用的的的的填填填填料料料料是新型健合相填料，粒度是新型健合相填料，粒度是新型健合相填料，粒度是新型健合相填料，粒度3-103-10微米。微米。微米。微米。填充方法：填充方法：填充方法：填充方法：填填填填充充充充时时时时，先先先先制制制制作作作作匀匀匀匀浆浆浆浆液液液液，用用用用流流流流动动动动相相相相充充充充满满满满色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱及及及及其其其其延延延延长长长长管管管管中中中中，然然然然后后后后将将将将匀匀匀匀浆浆浆浆液液液液倒倒倒倒入入入入匀匀匀匀浆浆浆浆填填填填充充充充器器器器，在在在在较较较较高高高高压压压压力力力力下下下下迅迅迅迅速速速速将将将将其其其其注注注注入入入入色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱内内内内。要要要要求求求求填填填填充速度快充速度快充速度快充速度快(防凝聚、沉降或结块防凝聚、沉降或结块防凝聚、沉降或结块防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入。、且无空气进入。、且无空气进入。、且无空气进入。第十四页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1（l）紫外检测器）紫外检测器（2）荧光检测器）荧光检测器（3）示差折光率检测器）示差折光率检测器 （4）电导检测器）电导检测器 5.检测器检测器作用？作用？作用？作用？将经色谱柱分离后的各组分按其特性及含量转换为将经色谱柱分离后的各组分按其特性及含量转换为将经色谱柱分离后的各组分按其特性及含量转换为将经色谱柱分离后的各组分按其特性及含量转换为相应的电信号。相应的电信号。相应的电信号。相应的电信号。HPLCHPLC检测器类型检测器类型检测器类型检测器类型第十五页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1 特点：灵敏度高，最小检测浓度达10-9 g/mL；流通池体积小（容积 8-10L）；对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱 应用最广，对大部分有机化合物有响应(1).紫外检测器紫外检测器（Ultrviolet photometric detector）第十六页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1第十七页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较普通检测器普通检测器普通检测器普通检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器第十八页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1波长波长波长波长可的松可的松可的松可的松氟美松氟美松氟美松氟美松皮质酮皮质酮皮质酮皮质酮由光电二极管阵列（由光电二极管阵列（PDAPDA）检测所获得的三维色谱检测所获得的三维色谱-光谱图。光谱图。利用色谱保留值及光谱特征吸收曲线综合进行定性分析。利用色谱保留值及光谱特征吸收曲线综合进行定性分析。第十九页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1(2).荧光检测器荧光检测器（fluorescence detector）特点：高灵敏度，最小检测浓度达特点：高灵敏度，最小检测浓度达1010-11-11 g/mL g/mL；高选择性，对具有共轭结构的有机芳环分子高选择性，对具有共轭结构的有机芳环分子 (刚性结构强刚性结构强)有响应。有响应。如多环芳烃，维生素如多环芳烃，维生素B B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、甾类化、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、甾类化 合物等有响应合物等有响应.第二十页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1(3).示差折光检测器示差折光检测器（differential refractive index detector）检测原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指检测原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指检测原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指检测原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指 数差值。差值与流动相中的组分浓度成正比；数差值。差值与流动相中的组分浓度成正比；数差值。差值与流动相中的组分浓度成正比；数差值。差值与流动相中的组分浓度成正比；第二十一页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1通用型检测器（不同的物质具有不同的折光指数）；通用型检测器（不同的物质具有不同的折光指数）；通用型检测器（不同的物质具有不同的折光指数）；通用型检测器（不同的物质具有不同的折光指数）；灵敏度低灵敏度低灵敏度低灵敏度低1010-7-7g/mLg/mL。对温度敏感对温度敏感对温度敏感对温度敏感(检测器温度应控制在检测器温度应控制在检测器温度应控制在检测器温度应控制在 1010-3-3)梯度洗脱会造成流动相折光指数不断变化，故不能用于梯度洗脱会造成流动相折光指数不断变化，故不能用于梯度洗脱会造成流动相折光指数不断变化，故不能用于梯度洗脱会造成流动相折光指数不断变化，故不能用于 梯度洗脱。梯度洗脱。梯度洗脱。梯度洗脱。特点：特点：第二十二页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1 电导检测器属于电化学检测器，主要用于离子色谱的检测。电导检测器属于电化学检测器，主要用于离子色谱的检测。电导检测器属于电化学检测器，主要用于离子色谱的检测。电导检测器属于电化学检测器，主要用于离子色谱的检测。检测原理：基于待测物在一些介质中解离后所产生的电导检测原理：基于待测物在一些介质中解离后所产生的电导检测原理：基于待测物在一些介质中解离后所产生的电导检测原理：基于待测物在一些介质中解离后所产生的电导 变化来测量解离物质的含量。变化来测量解离物质的含量。变化来测量解离物质的含量。变化来测量解离物质的含量。特点：特点：特点：特点：通用型检测器，检测灵敏度低。通用型检测器，检测灵敏度低。通用型检测器，检测灵敏度低。通用型检测器，检测灵敏度低。背景电导低时，采用背景电导低时，采用背景电导低时，采用背景电导低时，采用双电极电导检测器双电极电导检测器双电极电导检测器双电极电导检测器 (p90,p90,图图图图3-133-13）。）。）。）。当背景电导大时，应采用五电极式电导检测器当背景电导大时，应采用五电极式电导检测器当背景电导大时，应采用五电极式电导检测器当背景电导大时，应采用五电极式电导检测器 (p91,p91,图图图图3-15)3-15)响应受温度影响较大，需要将电导池置于恒温箱中。响应受温度影响较大，需要将电导池置于恒温箱中。响应受温度影响较大，需要将电导池置于恒温箱中。响应受温度影响较大，需要将电导池置于恒温箱中。当当当当pH7pH7时，该检测器不够灵敏。时，该检测器不够灵敏。时，该检测器不够灵敏。时，该检测器不够灵敏。(4).电导检测器电导检测器（electrical conductivity detector）第二十三页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1 在在高高效效液液相相色色谱谱中中,速速率率方方程程中中的的分分子子扩扩散散项项B/UB/U较较小小，可以忽略不计，而只有两项，即：可以忽略不计，而只有两项，即：H=A+C uH=A+C u 如如图图所所示示：H Hu u曲曲线线是是一一段段斜率不大的直线。斜率不大的直线。而在高的流动相流速下不致于使柱效损失太大，所以在实际而在高的流动相流速下不致于使柱效损失太大，所以在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要参数操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要参数。流速大于流速大于流速大于流速大于0.5 0.5 cm/scm/s时时时时,降低流降低流速，柱效提高不是很大速，柱效提高不是很大。3 3 3 3-3 -3 -3 -3 影响影响HPLCHPLCHPLCHPLC分离的因素分离的因素第二十四页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1A涡流扩散项涡流扩散项 A A=2dpdp dp dp：固定相的平均颗粒直径固定相的平均颗粒直径固定相的平均颗粒直径固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子固定相的填充不均匀因子固定相的填充不均匀因子固定相的填充不均匀因子Cu传质阻力项传质阻力项传质阻力包括固定相传质阻力传质阻力包括固定相传质阻力传质阻力包括固定相传质阻力传质阻力包括固定相传质阻力C Cs s和流动相传质阻力和流动相传质阻力和流动相传质阻力和流动相传质阻力C Cmm(包包包包 括在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质括在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质括在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质括在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质)：C C=（C Cs s+C Cmm+C+Csmsm）柱内色谱峰展宽引起柱内色谱峰展宽引起柱内色谱峰展宽引起柱内色谱峰展宽引起HH的变化：的变化：的变化：的变化：第二十五页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1提高液相色谱的柱效方法：提高液相色谱的柱效方法：柱填充颗粒小且均匀；柱填充颗粒小且均匀；柱填充颗粒小且均匀；柱填充颗粒小且均匀；流动相流速较低，粘度要小；流动相流速较低，粘度要小；流动相流速较低，粘度要小；流动相流速较低，粘度要小；柱温高柱温高流速选择原则：柱效损失不太大的前提下提高流动相流速以实现快速分离。第二十六页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1影响色谱峰扩展的因素的柱外因素影响色谱峰扩展的因素的柱外因素：柱前展宽柱前展宽：由进样引起。若将试样直接注入到色谱柱顶由进样引起。若将试样直接注入到色谱柱顶端填料中心点，或注入到填料中心之内端填料中心点，或注入到填料中心之内1-2mm处，可减处，可减小柱前展宽，提高柱效。小柱前展宽，提高柱效。柱后展宽柱后展宽：由接管，检测器流通池的死体积所引起由接管，检测器流通池的死体积所引起。第二十七页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1一、液一、液一、液一、液液分配色谱液分配色谱液分配色谱液分配色谱1.1.原理原理原理原理2.2.根根根根据据据据各各各各待待待待测测测测物物物物在在在在互互互互不不不不相相相相溶溶溶溶的的的的液液液液体体体体中中中中溶溶溶溶解解解解度度度度不不不不同同同同，具具具具有有有有不不不不同同同同的的的的分分分分配配配配系系系系数数数数。在在在在色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱中中中中，随随随随着着着着流流流流动动动动相相相相的的的的移移移移动动动动，这这这这种种种种分分分分配配配配平平平平衡衡衡衡需需需需进进进进行行行行多多多多次次次次，造造造造成成成成各各各各待待待待测测测测物物物物的的的的迁迁迁迁移移移移速速速速率率率率不不不不同同同同，从从从从而而而而实实实实现现现现分离的过程。分离的过程。分离的过程。分离的过程。3 3 3 3-4-4 高效液相色谱的主要类型及分离原理高效液相色谱的主要类型及分离原理高效液相色谱的主要类型及分离原理高效液相色谱的主要类型及分离原理按分离原理，按分离原理，HPLCHPLC分离的主要类型？分离的主要类型？用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。2.2.2.2.应用应用应用应用第二十八页，本课件共有59页2023/3/12023/3/13.3.固定相固定相固定相固定相 液液液液液液液液色色色色谱谱谱谱的的的的固固固固定定定定相相相相选选选选择择择择较较较较简简简简单单单单，常常常常用用用用的的的的只只只只有有有有几几几几种种种种，如如如如 ,-氧氧氧氧二二二二丙腈丙腈丙腈丙腈、聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇、十八烷十八烷十八烷十八烷(C C1818)、角鲨烷角鲨烷角鲨烷角鲨烷。固定相涂渍方法固定相涂渍方法固定相涂渍方法固定相涂渍方法:1 1）机械涂渍固定相：）机械涂渍固定相：）机械涂渍固定相：）机械涂渍固定相：将将将将固固固固定定定定液液液液通通通通过过过过机机机机械械械械混混混混合合合合的的的的方方方方法法法法涂涂涂涂渍渍渍渍到到到到表表表表面面面面多多多多孔孔孔孔型型型型(0.5-1.5%0.5-1.5%涂涂涂涂布量布量布量布量)或全多孔型载体上或全多孔型载体上或全多孔型载体上或全多孔型载体上(5-10%5-10%涂布量涂布量涂布量涂布量)。该该该该种种种种固固固固定定定定相相相相最最最最大大大大的的的的不不不不足足足足是是是是固固固固定定定定液液液液易易易易流流流流失失失失、分分分分离离离离稳稳稳稳定定定定性性性性及及及及重重重重现现现现性性性性差差差差，不适合梯度淋洗。不适合梯度淋洗。不适合梯度淋洗。不适合梯度淋洗。如何减少固定液的流失？如何减少固定液的流失？如何减少固定液的流失？如何减少固定液的流失？机械涂渍型和化学键合型。机械涂渍型和化学键合型。机械涂渍型和化学键合型。机械涂渍型和化学键合型。第二十九页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1 如何减少固定液的流失？如何减少固定液的流失？如何减少固定液的流失？如何减少固定液的流失？方方方方法法法法一一一一、固固固固定定定定相相相相和和和和流流流流动动动动相相相相之之之之间间间间溶溶溶溶解解解解度度度度越越越越小小小小越越越越好好好好（两两两两者者者者极极极极性性性性差别越大越好）差别越大越好）差别越大越好）差别越大越好）方方方方法法法法二二二二、在在在在柱柱柱柱前前前前加加加加一一一一根根根根很很很很短短短短的的的的前前前前置置置置柱柱柱柱(该该该该柱柱柱柱涂涂涂涂有有有有与与与与分分分分析析析析柱柱柱柱相相相相同同同同但但但但有有有有更更更更高高高高含含含含量量量量的的的的固固固固定定定定液液液液，使使使使流流流流动动动动相相相相进进进进入入入入分分分分析析析析柱柱柱柱之之之之前前前前，预预预预先先先先被被被被固固固固定定定定液液液液饱饱饱饱和和和和)或或或或将将将将固固固固定定定定液液液液健健健健合合合合到到到到载载载载体上体上体上体上。方法三、使固定液在担体上结合更牢固方法三、使固定液在担体上结合更牢固方法三、使固定液在担体上结合更牢固方法三、使固定液在担体上结合更牢固第三十页，本课件共有59页2023/3/12023/3/12 2）化学键合固定相）化学键合固定相）化学键合固定相）化学键合固定相 通通通通过过过过化化化化学学学学反反反反应应应应将将将将各各各各种种种种不不不不同同同同的的的的有有有有机机机机基基基基团团团团键键键键合合合合到到到到载载载载体体体体(硅硅硅硅胶胶胶胶)表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理：液液分配？这种固定相分离机理：液液分配？这种固定相分离机理：液液分配？这种固定相分离机理：液液分配？双重分离机制，即液液分配双重分离机制，即液液分配双重分离机制，即液液分配双重分离机制，即液液分配+吸附吸附吸附吸附 取决于化学键合的表面覆盖率。取决于化学键合的表面覆盖率。取决于化学键合的表面覆盖率。取决于化学键合的表面覆盖率。高覆盖率：液液分配为主；低覆盖率：吸附为主。高覆盖率：液液分配为主；低覆盖率：吸附为主。高覆盖率：液液分配为主；低覆盖率：吸附为主。高覆盖率：液液分配为主；低覆盖率：吸附为主。化学键合固定相的类型：化学键合固定相的类型：化学键合固定相的类型：化学键合固定相的类型：第三十一页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1化学键合固定相类型化学键合固定相类型 a.a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiSiOCOC SiSi0H0HROHSiROHSiORORH H2 20 0 b.b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiSiOOSi Si C C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.c.硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型：SiSiCC d.d.硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型：SiSiNN第三十二页，本课件共有59页2023/3/12023/3/14.4.流动相流动相流动相流动相:在液液色谱中，为防止固定相的流失，流动相液体与固在液液色谱中，为防止固定相的流失，流动相液体与固在液液色谱中，为防止固定相的流失，流动相液体与固在液液色谱中，为防止固定相的流失，流动相液体与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相正相正相正相分配色谱分配色谱分配色谱分配色谱（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和性组分分离）和性组分分离）和性组分分离）和反相分配色谱反相分配色谱反相分配色谱反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极（流动相极性大于固定相极性，极（流动相极性大于固定相极性，极（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。性大的先流出，适于非极性组分分离）。性大的先流出，适于非极性组分分离）。性大的先流出，适于非极性组分分离）。反相健合相色谱法反相健合相色谱法反相健合相色谱法反相健合相色谱法固定相固定相固定相固定相:硅胶一硅胶一硅胶一硅胶一C C1818HH3737、硅胶一苯基等、硅胶一苯基等、硅胶一苯基等、硅胶一苯基等流动相流动相流动相流动相:甲醇甲醇甲醇甲醇 乙睛一水、水乙睛一水、水乙睛一水、水乙睛一水、水+无机盐无机盐无机盐无机盐bufbuf溶液等溶液等溶液等溶液等正相健合相色谱法正相健合相色谱法正相健合相色谱法正相健合相色谱法固定相固定相固定相固定相:硅胶一硅胶一硅胶一硅胶一OHOH、硅胶一、硅胶一、硅胶一、硅胶一CNCN等等等等流动相流动相流动相流动相:正已烷中加入适量极性溶剂正已烷中加入适量极性溶剂正已烷中加入适量极性溶剂正已烷中加入适量极性溶剂,如氯仿如氯仿如氯仿如氯仿 醇等醇等醇等醇等第三十三页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1ABCABC正相色谱正相色谱正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱反相色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间时间时间时间时间时间时间时间时间正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系?待测物极性：待测物极性：待测物极性：待测物极性：第三十四页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1二、液固吸附色谱二、液固吸附色谱固定相固定相固定相固定相:固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，粒度固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，粒度固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，粒度固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，粒度5 510 10 mm。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。作用机理作用机理作用机理作用机理：根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。：根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。：根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。：根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。当当当当流流流流动动动动相相相相进进进进入入入入色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱后后后后，它它它它以以以以单单单单分分分分子子子子层层层层S S形形形形式式式式占占占占据据据据吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂上上上上的的的的活活活活性性性性中中中中心心心心点点点点，当当当当试试试试样样样样分分分分子子子子X X进进进进入入入入色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱后后后后，在在在在迁迁迁迁移移移移过过过过程程程程中中中中，与与与与流流流流动动动动相相相相分分分分子子子子在在在在固固固固定定定定相相相相表表表表面面面面发发发发生生生生竞竞竞竞争争争争吸附反应：吸附反应：吸附反应：吸附反应：这种竞争吸附达平衡时，吸附的分配系数这种竞争吸附达平衡时，吸附的分配系数这种竞争吸附达平衡时，吸附的分配系数这种竞争吸附达平衡时，吸附的分配系数K K为：为：为：为：K K越大，溶质分子的吸附性强，保留值大。越大，溶质分子的吸附性强，保留值大。越大，溶质分子的吸附性强，保留值大。越大，溶质分子的吸附性强，保留值大。应用：相对分子质量中等的油溶性样品，不同官能团化合物、异构体。应用：相对分子质量中等的油溶性样品，不同官能团化合物、异构体。应用：相对分子质量中等的油溶性样品，不同官能团化合物、异构体。应用：相对分子质量中等的油溶性样品，不同官能团化合物、异构体。第三十五页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1三、离子对色谱法（三、离子对色谱法（IPCIPC）1.1.原理原理原理原理 主要是基于主要是基于主要是基于主要是基于待测组分在分析柱上的吸附作用不同待测组分在分析柱上的吸附作用不同待测组分在分析柱上的吸附作用不同待测组分在分析柱上的吸附作用不同而进行而进行而进行而进行分离的。将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子加到流分离的。将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子加到流分离的。将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子加到流分离的。将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对化合物，利动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对化合物，利动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对化合物，利动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对化合物，利用它在流动相和固定相之间的分配系数不同而进行分离。用它在流动相和固定相之间的分配系数不同而进行分离。用它在流动相和固定相之间的分配系数不同而进行分离。用它在流动相和固定相之间的分配系数不同而进行分离。固定相固定相固定相固定相 疏水性的苯乙烯、二乙烯苯树脂或键合的硅胶疏水性的苯乙烯、二乙烯苯树脂或键合的硅胶疏水性的苯乙烯、二乙烯苯树脂或键合的硅胶疏水性的苯乙烯、二乙烯苯树脂或键合的硅胶 流动相流动相流动相流动相 水水水水+离子对试剂离子对试剂离子对试剂离子对试剂+有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂 离子对试剂离子对试剂离子对试剂离子对试剂 所带电荷与待测离子相反的离子所带电荷与待测离子相反的离子所带电荷与待测离子相反的离子所带电荷与待测离子相反的离子第三十六页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1 可以通过改变对离子的浓度和种类，流动相的类型、浓度及可以通过改变对离子的浓度和种类，流动相的类型、浓度及可以通过改变对离子的浓度和种类，流动相的类型、浓度及可以通过改变对离子的浓度和种类，流动相的类型、浓度及pHpH值从而改变分离的选择性，解决难分离混合物的分离问题。值从而改变分离的选择性，解决难分离混合物的分离问题。值从而改变分离的选择性，解决难分离混合物的分离问题。值从而改变分离的选择性，解决难分离混合物的分离问题。平衡常数平衡常数平衡常数平衡常数 KKXYXY为为为为:根据分配系数的定义，溶质的分配系数根据分配系数的定义，溶质的分配系数根据分配系数的定义，溶质的分配系数根据分配系数的定义，溶质的分配系数 D D为：为：为：为：例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流 动相中加入与待测离子动相中加入与待测离子动相中加入与待测离子动相中加入与待测离子X X+有相反电荷的离子有相反电荷的离子有相反电荷的离子有相反电荷的离子Y Y-：第三十七页，本课件共有59页2023/3/12023/3/12 2 离子对试剂的选择离子对试剂的选择离子对试剂的选择离子对试剂的选择（1 1）分离亲水性离子）分离亲水性离子）分离亲水性离子）分离亲水性离子选用疏水性离子对试剂选用疏水性离子对试剂选用疏水性离子对试剂选用疏水性离子对试剂 分离疏水性离子分离疏水性离子分离疏水性离子分离疏水性离子选用亲水性选用亲水性选用亲水性选用亲水性 离子对试剂离子对试剂离子对试剂离子对试剂（2 2）相对分子量较小的离子对试剂比分子量的分离效果更）相对分子量较小的离子对试剂比分子量的分离效果更）相对分子量较小的离子对试剂比分子量的分离效果更）相对分子量较小的离子对试剂比分子量的分离效果更好好好好第三十八页，本课件共有59页2023/3/12023/3/1思考题：思考题：思考题：思考题：有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动相中应加入阴离子还是阳离子来形成离子对？相中应加入阴离子还是阳离子来形成离子对？相中应加入阴离子还是阳离子来形成离子对？相中应加入阴离子还是阳离子来形成离子对？3 3离子对色谱法的应用离子对色谱法的应用离子对色谱法的应用离子对色谱法的应用4 分离大分子量的阴、阳离子，特别是带分离大分子量的阴、阳离子，特别是带局部电荷的大分子及疏水性阴、阳离子。包局部电荷的大分子及疏水性阴、阳离子。包括阴阳离子表面活性剂，大分子脂肪羧酸、括阴阳离子表面活性剂，大分子脂