种子的扩大培养精选课件.ppt
关于种子的扩大培养第一页，本课件共有48页指指将将保保存存在在砂砂土土管管、冷冷冻冻干干燥燥管管中中处处休休眠眠状状态态的的菌菌种种接接入入试试管管斜斜面面活活化化后后，再再经经过过扁扁瓶瓶或或摇摇瓶瓶及及种种子子罐罐逐逐级级扩扩大大培培养养,最最终终获获得得一一定定发发酵酵产产量量高高、数数量量充充足足、无污染的生产菌种的过程。无污染的生产菌种的过程。第一节第一节 种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养种子扩大培养第二页，本课件共有48页种子扩培的目的种子扩培的目的q 接种量的需要接种量的需要q 菌种的驯化菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平第三页，本课件共有48页作为种子的准则 细胞生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；生理性状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力。第四页，本课件共有48页4.1 种子的制备工艺第五页，本课件共有48页第六页，本课件共有48页实验室阶段实验室阶段：所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂中培养过程一般都在菌种室完成。设备，在工厂中培养过程一般都在菌种室完成。生产车间阶段生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理。工程归为发酵车间管理。第七页，本课件共有48页第八页，本课件共有48页一、实验室种子的制备一般采用两种方式：对于产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法，获得菌丝体，作为种子。第九页，本课件共有48页、斜面、斜面 (AS1.299)(AS1.299)培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%1%，牛肉膏，牛肉膏1%1%，氯化钠，氯化钠 0.50.5 琼脂琼脂 2%2%，pH 7.0-7.2pH 7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：3232，生长，生长18-2418-24小时小时q 对于不产孢子和孢子发芽慢的微生物对于不产孢子和孢子发芽慢的微生物获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。子培养。第十页，本课件共有48页.一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）培养条件：于培养条件：于1000ml1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32200-250ml,32培培养养1212小时。小时。培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%2%，尿素，尿素0.5%0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%2.5%，K K2 2HPOHPO4 4 0.1%0.1%培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基接近于发酵培养基q 对于不产孢子和孢子发芽慢的微生物对于不产孢子和孢子发芽慢的微生物第十一页，本课件共有48页.二级种子二级种子(种子罐种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)1%(10%)），），3232培养培养7-107-10个小时个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为浓度为2.5%2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基第十二页，本课件共有48页种子的质量要求：种子的质量要求：10108 8-10-109 9个个/ml/ml大小均匀，呈单个或八字排列大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.0-7.2PH 7.0-7.2时结束，时结束，6.887.0-7.26.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛第十三页，本课件共有48页 获得一定数量和质量的孢子获得一定数量和质量的孢子 与菌丝体培养相比步骤少，因而更容易获得量和质与菌丝体培养相比步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。稳定的种子，但操作繁琐。q 对于产孢子的微生物对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的菌丝体获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。便于操作，但需要更仔细的控制。第十四页，本课件共有48页2 2、培养基选择的原则、培养基选择的原则 有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。般都比较精细。第十五页，本课件共有48页二、生产车间种子制备 种子罐的培养基成分原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。第十六页，本课件共有48页1 1、培养物的选择原则、培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。q 缩短发酵时间缩短发酵时间q 有利于获得好的发酵结果有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：菌丝体比孢子要有利：第十七页，本课件共有48页2 2、培养基选择的原则、培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，培养基首先考目的：获得一定数量和质量的菌体，培养基首先考虑有利于孢子的发育和菌体的生长，营养要比虑有利于孢子的发育和菌体的生长，营养要比发酵培养基丰富。发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，基本接近于在原料方面：不如实验室阶段那么精细，基本接近于发酵培养基发酵培养基:一是成本一是成本 二是驯化二是驯化第十八页，本课件共有48页例：柠檬酸发酵例：柠檬酸发酵q 以蔗糖为原料以蔗糖为原料成分成分 斜面斜面 种子罐种子罐 发酵发酵麦芽汁麦芽汁 麦汁麦汁 蔗糖蔗糖 2.5-5%20%2.5-5%20%NHNH4 4NONO3 3 0.225%0.11%0.225%0.11%K K2 2HPOHPO4 4 0.03%0.03%MgSOMgSO4 4.H.H2 2O 0.025%0.025%O 0.025%0.025%KCl 0.015%KCl 0.015%琼脂琼脂 2%2%第十九页，本课件共有48页3、种子罐的作用：使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。第二十页，本课件共有48页种子罐级数：指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积 4、种子罐级数的确定、种子罐级数的确定 第二十一页，本课件共有48页谷氨酸：三级发酵谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）二级种子二级种子 （小罐）（小罐）发酵发酵青霉素：三级发酵青霉素：三级发酵一级种子一级种子 （小罐）（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时工厂一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数从第一级种子罐开始计算发酵级数第二十二页，本课件共有48页发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据q 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响q 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-42-4级。级。q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面一个方面第二十三页，本课件共有48页细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27C,40小时孢子发芽，产生菌丝）二级种子罐（27C,1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 第二十四页，本课件共有48页种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。n确定种子罐级数需注意的问题确定种子罐级数需注意的问题第二十五页，本课件共有48页5 5、接种量的确定、接种量的确定 移入种子的体积移入种子的体积接种量接种量 接种后培养液的体积接种后培养液的体积接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等，发酵后劲不足加等，发酵后劲不足种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌。菌。以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据接种量的大小直接影响发酵周期。接种量的大小直接影响发酵周期。第二十六页，本课件共有48页双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。酵罐。过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为素为7-15%7-15%。但是一般认为大一点好。但是一般认为大一点好。第二十七页，本课件共有48页采用被孢霉进行采用被孢霉进行亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体接种量对菌体形态和产接种量对菌体形态和产亚麻酸的影响亚麻酸的影响 杨博，杨博，中国油脂，中国油脂，20022002第二十八页，本课件共有48页研究发现，采用被孢霉进行研究发现，采用被孢霉进行亚麻酸发酵时接种量可以明显亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体的形态，从而影响菌体干重和影响菌丝体的形态，从而影响菌体干重和亚麻酸产量。亚麻酸产量。第二十九页，本课件共有48页 不同接种量影响菌体的生长和发酵不同接种量影响菌体的生长和发酵第三十页，本课件共有48页发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率第三十一页，本课件共有48页20%20%种子罐种子罐10%10%发酵罐前期发酵液效果最好发酵罐前期发酵液效果最好第三十二页，本课件共有48页6 6、种龄、种龄指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。大，但是最终由实验结果定。第三十三页，本课件共有48页v大量地接入培养成熟的菌种的优点：缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率节约发酵培养的动力消耗有利于减少染菌机会第三十四页，本课件共有48页舒琴，舒琴，林产化学与工业，林产化学与工业，20042004镜检：镜检：2424小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期 3030小时开始出现芽孢小时开始出现芽孢第三十五页，本课件共有48页4.2 4.2 影响种子影响种子质质量的因素量的因素v原材料质量v培养温度v湿度v通气与搅拌v斜面冷藏时间斜面冷藏时间v培养基培养基vpHpH第三十六页，本课件共有48页原材料质量v原材料质量波动引起种子质量不稳定v原材料质量波动的主要原因：无机离子含量不同（微量元素MgMg2+2+、CuCu2+2+、BaBa2+2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）。第三十七页，本课件共有48页 培养温度培养温度 v温度过低，菌种生长发育缓慢v温度过高会使菌丝过早自溶在制备土霉素生产种子过程中，高于在制备土霉素生产种子过程中，高于3737培养时，培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。第三十八页，本课件共有48页湿度v湿度低，孢子生长快；v湿度大，孢子生长慢 制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状，孢子稀少蒸发呈干瘪状，孢子稀少第三十九页，本课件共有48页 通气与搅拌 v足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量 v搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗。v丝状微生物不宜剧烈搅拌。第四十页，本课件共有48页斜面冷藏时间 v对孢子的生产能力有较大影响 v冷藏时间越长，生产能力下降越多 链霉素生产中，斜面孢子在链霉素生产中，斜面孢子在66冷藏两冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低1818，比冷藏比冷藏3 3个月的降低个月的降低3535。第四十一页，本课件共有48页培养基v培养种子的目的：扩大培养，增加细胞数量；同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。第四十二页，本课件共有48页v有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足氮源和生长因子，无机氮源比例大；各种营养物质的浓度不必太高；供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源；应考虑与发酵培养基的主要成分相近。种子培养基特点种子培养基特点第四十三页，本课件共有48页 pH pH v选择最适种子培养pHpH的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量v培养最后一级种子的培养基的pHpH应接近于发酵培养基的pHpH，以便种子能尽快适应新的环境 第四十四页，本课件共有48页种子种子质质量的控制措施量的控制措施 v菌种稳定性的检查 测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并及时对退化菌种进行复壮 v提供适宜的生长环境v种子无杂菌检查，保证纯种发酵。种子液生化分析项目主要有：营养基质的消种子液生化分析项目主要有：营养基质的消耗速度、耗速度、pHpH变化、溶氧变化、色泽和气味等变化、溶氧变化、色泽和气味等第四十五页，本课件共有48页三、种子质量标准1、细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。第四十六页，本课件共有48页在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。3 3、产物生成量、产物生成量2 2、生化指标、生化指标n种子液的糖、氮、磷的含量和种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。变化。4 4、酶活力、酶活力种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。关联。第四十七页，本课件共有48页01.03.2023感感谢谢大大家家观观看看第四十八页，本课件共有48页
