色谱法导论 (2)精选课件.ppt

关于色谱法导论关于色谱法导论(2)第一页，本课件共有79页第一节第一节 概论概论v色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。取液）的石油醚倒入管中。v此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。此而得名。第二页，本课件共有79页v玻璃管为色谱柱，玻璃管为色谱柱，管内的碳酸钙填料管内的碳酸钙填料为固定相，石油醚为固定相，石油醚淋洗液为流动相。淋洗液为流动相。第三页，本课件共有79页v现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。原理仍然是一样的。v色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，能够分离性质相近的多组分复杂分离技术，能够分离性质相近的多组分复杂混合物。混合物。v将色谱法用于分析化学并配合适当的检测手将色谱法用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。段，就成为色谱分析法。第四页，本课件共有79页v色谱法分类色谱法分类v1.按固定相形态分类按固定相形态分类v柱色谱：固定相装在色谱柱内。包括填充柱、柱色谱：固定相装在色谱柱内。包括填充柱、整体柱、毛细管柱或开管柱。整体柱、毛细管柱或开管柱。v平面色谱：固定相呈平面状。包括薄层色谱平面色谱：固定相呈平面状。包括薄层色谱和纸色谱。和纸色谱。第五页，本课件共有79页色色谱谱法法液相色谱法液相色谱法气相色谱法气相色谱法气气-液色谱法液色谱法气气-固色谱法固色谱法液液-固色谱法固色谱法液液-液色谱法液色谱法v2.按两相的物理形态、分离机理分类按两相的物理形态、分离机理分类第六页，本课件共有79页第二节第二节 基本概念基本概念v色谱分离体系由两部分组成：色谱分离体系由两部分组成：一相是固定不动的，我们把一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。流动相。v当流动相以一定速率流经色谱柱，试样中各个组分当流动相以一定速率流经色谱柱，试样中各个组分在流动相和固定相之间进行连续多次分配。在流动相和固定相之间进行连续多次分配。v组分与固定相和流动相之间的作用力有差别，因而组分组分与固定相和流动相之间的作用力有差别，因而组分在两相中分布常数不同。在两相中分布常数不同。第七页，本课件共有79页v在固定相上吸附力大的，在固定相上吸附力大的，即分布常数大的，迁移即分布常数大的，迁移数率慢，保留时间长；数率慢，保留时间长；在固定相上吸附力小，在固定相上吸附力小，即分布常数小的，迁移即分布常数小的，迁移数率快。数率快。v试样中各组分同时进入试样中各组分同时进入色谱柱，但是在不同时色谱柱，但是在不同时间从色谱柱中洗出，实间从色谱柱中洗出，实现分离。现分离。第八页，本课件共有79页混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应第九页，本课件共有79页v试样组分在色谱体系中运行的特点：试样组分在色谱体系中运行的特点：v1.差速迁移：混合物中不同组分的迁移速率不同差速迁移：混合物中不同组分的迁移速率不同v差速迁移差速迁移(保留值的大小保留值的大小)取决于组分与固定相、流动相取决于组分与固定相、流动相作用力的差异作用力的差异v2.分子分布离散：同种组分分子在迁移过程中分布空分子分布离散：同种组分分子在迁移过程中分布空间扩展间扩展v分子分布离散取决于同种分子运动速率的差异分子分布离散取决于同种分子运动速率的差异v色谱分离要求：差异速率色谱分离要求：差异速率(保留值大保留值大)，分子分布离散，分子分布离散(色谱区带色谱区带)窄。窄。第十页，本课件共有79页v2.分布平衡分布平衡v色谱涉及溶质在两相中的分布平衡，平衡常数色谱涉及溶质在两相中的分布平衡，平衡常数K称为分称为分布系数或分配系数布系数或分配系数vK=cs/cmvcs是溶质在固定相的浓度，是溶质在固定相的浓度，cm是溶质在流动相中的浓是溶质在流动相中的浓度，度，K是溶质在两相中分布平衡性质的度量，反映溶是溶质在两相中分布平衡性质的度量，反映溶质与固定相、流动相作用力差别。质与固定相、流动相作用力差别。vK只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。仪器无关。第十一页，本课件共有79页v温度、溶质一定时，温度、溶质一定时，K 主要取决于固定相性质。主要取决于固定相性质。v每个组份在各种固定相上的分配系数每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；组分的分配不同；组分的分配系数系数 K 越小，出峰越快；组分的分配系数越小，出峰越快；组分的分配系数 K 越大，出越大，出峰越慢；某组分的峰越慢；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先时，即不被固定相保留，最先流出。流出。v选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的分具有不同的K值是分离的基础；值是分离的基础；第十二页，本课件共有79页v3.色谱流动相流速色谱流动相流速v稳定的流动相流速是色谱系统正常运行的基本条件。稳定的流动相流速是色谱系统正常运行的基本条件。v流动相的流速通常有两种表达方式流动相的流速通常有两种表达方式v体积流量体积流量Fc mL/min，单位时间流过色谱柱的平均体，单位时间流过色谱柱的平均体积。积。vFc采用容器收集柱后一定时间内流出流动相的体积进采用容器收集柱后一定时间内流出流动相的体积进行测定。行测定。v线速度线速度 cm/min，mm/min，单位时间内流动相流经，单位时间内流动相流经色谱柱的长度色谱柱的长度v 由柱长由柱长L和死时间和死时间tM求出，求出，=L/tM第十三页，本课件共有79页v4.色谱图色谱图v分离试样各组分依次进入分离试样各组分依次进入柱后，由检测器产生检测柱后，由检测器产生检测信号，响应信号大小对时信号，响应信号大小对时间或流动相流出体积的关间或流动相流出体积的关系曲线为色谱图。系曲线为色谱图。v色谱图的横坐标是时间或色谱图的横坐标是时间或流动相体积，纵坐标是组流动相体积，纵坐标是组分在流动相中浓度或检测分在流动相中浓度或检测器响应信号大小，器响应信号大小，第十四页，本课件共有79页v色谱图是色谱分析的主要技术资料，色谱包含的色谱信色谱图是色谱分析的主要技术资料，色谱包含的色谱信息息v1.说明试样是否是单一纯化和物。正常色谱条件下，说明试样是否是单一纯化和物。正常色谱条件下，如果色谱图有一个以上色谱峰，说明试样中有一个如果色谱图有一个以上色谱峰，说明试样中有一个以上组分。色谱图能够提供试样中的最低组分数。以上组分。色谱图能够提供试样中的最低组分数。v2.说明色谱柱效和分离情况，可定量计算出表征色说明色谱柱效和分离情况，可定量计算出表征色谱柱效的理论塔板数、评价相邻物质对分离优劣的谱柱效的理论塔板数、评价相邻物质对分离优劣的分离度。分离度。v3.提供各组分保留时间等色谱定性数据。提供各组分保留时间等色谱定性数据。v4.给出个组分色谱峰高、峰面积等定量数据。给出个组分色谱峰高、峰面积等定量数据。第十五页，本课件共有79页 色色 谱谱 图图 第十六页，本课件共有79页v基线基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。基线相进入检测器时的流出曲线称为基线。基线在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。平直与否可反应出实验条件的稳定情况。v色谱峰高色谱峰高(h)：色谱峰顶点与基线的距离叫峰：色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。高。v峰面积峰面积：色谱峰与峰底基线所围成区域的面：色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。积叫峰面积。第十七页，本课件共有79页v色谱峰区域宽度色谱峰区域宽度：色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作重要参数之一，可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。宽度越窄，其效率越高，分离的效条件下的动力学因素。宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。果也越好。v区域宽度通常有三种表示方法：区域宽度通常有三种表示方法：v标准差标准差：峰高：峰高0.607倍处峰宽处的一半。倍处峰宽处的一半。v半峰宽半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354 v峰底宽峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。距离。W=4。第十八页，本课件共有79页v5.保留值保留值v保留值是试样各组分在色谱柱或色谱体系中保留行保留值是试样各组分在色谱柱或色谱体系中保留行为的度量，反映溶质与色谱固定相作用力类型和大为的度量，反映溶质与色谱固定相作用力类型和大小，是色谱热力学参数和定性依据。小，是色谱热力学参数和定性依据。v比移值比移值Rf：溶质通过色谱柱的平均线速度：溶质通过色谱柱的平均线速度u与流动相与流动相平均线速度平均线速度ux之比。之比。v溶质分子在流动相中消耗的时间分数等于溶质分子在溶质分子在流动相中消耗的时间分数等于溶质分子在流动相中分布的分子分数，这样得到：流动相中分布的分子分数，这样得到：vnm和和ns分别为溶质在流动相和固定相的分子数或物质分别为溶质在流动相和固定相的分子数或物质的量。的量。第十九页，本课件共有79页v溶质在流动相中消耗的时间越多，溶质在流动相中消耗的时间越多，nm越大，越大，ux越大，越大，Rf也越大。也越大。v如果溶质在流动相中消耗时间分数为如果溶质在流动相中消耗时间分数为1，即溶质一直，即溶质一直在流动相中迁移，未在固定相中停留，在流动相中迁移，未在固定相中停留，ux=u，Rf=1。v如果溶质一直停留在固定相，谱带不随流动相迁移，则如果溶质一直停留在固定相，谱带不随流动相迁移，则ux=0，Rf=0。v通常，通常，0Rf1.5,1.5,R R增增加加不大不大)。改改变变 的的方方法法有有：降降低低柱柱温温、改改变变流流动动相相及及固固定定相的性质和组成。相的性质和组成。第六十二页，本课件共有79页v3）分离度）分离度R 分配比分配比 k 的关系的关系v k 增增加加，分分离离度度R 增增加加，但但当当k10，则则R的的增增加不明显。通常加不明显。通常k在在210之间。之间。v 改改变变 k 的的方方法法有有：适适当当增增加加柱柱温温(GC)、改改变变流流动相性质和组成动相性质和组成(LC)以及固定相含量。以及固定相含量。第六十三页，本课件共有79页70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂溶剂(流动相流动相)组成对色谱分离的影响组成对色谱分离的影响(梯度淋洗梯度淋洗)1 1：9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；2 2：2-2-甲基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；3 3：2-2-乙基乙基-9,10-9,10-蒽醌蒽醌4 4：1,4-1,4-二甲基二甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；5 5：2-2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；改变组成使 k 最佳第六十四页，本课件共有79页3.3.分析时间分析时间 t t 分分析析时时间间通通常常指指最最后后一一个个组组分分出出峰峰的的时时间间。其其值值为为可可见见，分分析析时时间间与与R R，k k、H/uH/u等等参参数数有有关关。R R 增加增加1 1 倍，分析时间则是原来的倍，分析时间则是原来的 4 4 倍。倍。实实际际工工作作中中，即即要要能能获获得得有有效效的的分分离离，又又要要在较短时间内完成分析。在较短时间内完成分析。第六十五页，本课件共有79页例例：两两物物质质A A和和B B在在30cm30cm长长的的色色谱谱柱柱上上的的保保留留时时间间分分别别为为16.416.4和和17.63min17.63min，有有一一不不与与固固定定相相作作用用的的物物质质，其其在在此此柱柱上上的的保保留留时时间间为为1.30 1.30 minmin。物物质质A A和和B B的的峰峰底底宽宽分分别别为为1.111.11和和1.21min1.21min。试试问：问：1 1）柱分辨率）柱分辨率R R；2 2）柱平均理论塔板数）柱平均理论塔板数n navav3 3）平均塔板高度）平均塔板高度H Havav4 4）若要求）若要求R R达到达到1.51.5，则柱长至少应为多少？，则柱长至少应为多少？5 5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？6 6）不不增增加加柱柱长长，要要求求在在原原来来的的分分析析时时间间内内R R达达到到1.51.5，该该柱柱的的塔板高度应为多少？塔板高度应为多少？第六十六页，本课件共有79页1 1）柱分辨率柱分辨率R R；第六十七页，本课件共有79页 2 2）柱平均理论塔板数柱平均理论塔板数n navav第六十八页，本课件共有79页v3）平均塔板高度平均塔板高度Hav第六十九页，本课件共有79页4 44 4）若要求若要求R R达到达到1.51.5，则柱长至少应为多少？，则柱长至少应为多少？第七十页，本课件共有79页5 5）使使用用上上述述较较长长的的柱柱进进行行分分析析时时，其其分分析析时时间间为为多长？多长？第七十一页，本课件共有79页6 6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内）不增加柱长，要求在原来的分析时间内R R达到达到1.51.5，该柱的塔板高度应为多少？，该柱的塔板高度应为多少？第七十二页，本课件共有79页第五节第五节 色谱方法选择色谱方法选择v方法选择方法选择v根据试样物理、化学性质和分析要求来选择色谱方根据试样物理、化学性质和分析要求来选择色谱方法：法：v各种气体、沸点各种气体、沸点500以下具有挥发性的试样，采用气以下具有挥发性的试样，采用气相色谱分析。相色谱分析。v非挥发性试样，包括有机物、无机物、高分子化合物、可非挥发性试样，包括有机物、无机物、高分子化合物、可解离化合物采用高效液相色谱分析。解离化合物采用高效液相色谱分析。v薄层色谱为非仪器分析方法，为高效液相色谱流动相、薄层色谱为非仪器分析方法，为高效液相色谱流动相、固定相选择的辅助手段。固定相选择的辅助手段。第七十三页，本课件共有79页第六节第六节 色谱分析色谱分析v1.定性分析定性分析v色谱定性：鉴定试样中各组分，即每个色谱峰是何种化合色谱定性：鉴定试样中各组分，即每个色谱峰是何种化合物。物。v基于色谱分离的主要定性依据是保留值，包括保留时间、基于色谱分离的主要定性依据是保留值，包括保留时间、保留体积、相对保留值等。保留体积、相对保留值等。v色谱保留值色谱保留值与分子结构有关，可以用来鉴定已知物。与分子结构有关，可以用来鉴定已知物。v如在同样色谱条件下，用已知化合物与试样中色谱峰对照如在同样色谱条件下，用已知化合物与试样中色谱峰对照定性；将已知化合物加入试样中，导致某色谱峰增高来定定性；将已知化合物加入试样中，导致某色谱峰增高来定性。性。v应用保留值确定试样中不存在某个化合物是可靠的，而准确应用保留值确定试样中不存在某个化合物是可靠的，而准确鉴定某一色谱峰是某个化合物，需要反复验证。鉴定某一色谱峰是某个化合物，需要反复验证。第七十四页，本课件共有79页v保留指数保留指数也是一种相对保留值，保留指数在固定液上的保也是一种相对保留值，保留指数在固定液上的保留行为，是目前使用最广泛并被国际上公认的定性指标。留行为，是目前使用最广泛并被国际上公认的定性指标。它具有重现性好、标准统一及温度系数小等优点。它具有重现性好、标准统一及温度系数小等优点。v它是把正构烷烃中某两个组分的调整保留值的对数作为它是把正构烷烃中某两个组分的调整保留值的对数作为相对的尺度。保留指数仅与固定相的性质、柱温有关，相对的尺度。保留指数仅与固定相的性质、柱温有关，与其它实验条件无关。其准确度和重现性都很好。只要与其它实验条件无关。其准确度和重现性都很好。只要柱温与固定相相同，就可应用文献值进行鉴定，而不必柱温与固定相相同，就可应用文献值进行鉴定，而不必用纯物质相对照。用纯物质相对照。第七十五页，本课件共有79页v2.定量分析定量分析v定量依据是根据检测响应信号大小，测定试样中各组分定量依据是根据检测响应信号大小，测定试样中各组分的相对含量。的相对含量。v定量分析的依据是每个组分的量与色谱检测器的响应定量分析的依据是每个组分的量与色谱检测器的响应值成正比，与峰高或峰面积响应成正比。值成正比，与峰高或峰面积响应成正比。v每个色谱峰高每个色谱峰高h可从色谱图直接测定，色谱峰面积可从色谱图直接测定，色谱峰面积A以以峰高与半峰高宽峰高与半峰高宽2W1/2相乘求出相乘求出:A=h 2W1/2v在试样和标样平行分析时，必须严格控制柱温、在试样和标样平行分析时，必须严格控制柱温、流动相流速、进样速度等条件，才能获得准确的流动相流速、进样速度等条件，才能获得准确的峰高测定结果。峰高测定结果。第七十六页，本课件共有79页v标准校正法标准校正法v配制一系列组成与试样相近的标准溶液，按标准溶液色配制一系列组成与试样相近的标准溶液，按标准溶液色谱图，可求出每个组分浓度与相应峰面积或峰高校准曲谱图，可求出每个组分浓度与相应峰面积或峰高校准曲线。线。v再按相同色谱条件下试样色谱图相应组分峰面积或峰高，再按相同色谱条件下试样色谱图相应组分峰面积或峰高，求出其浓度或量。求出其浓度或量。v标准校正法为绝对定量校正法，分离、检测条件的稳定标准校正法为绝对定量校正法，分离、检测条件的稳定性对定量结果影响很大。为获得高定量准确性，定量校性对定量结果影响很大。为获得高定量准确性，定量校准曲线需经常重复校正。准曲线需经常重复校正。第七十七页，本课件共有79页v内标法内标法v选择一个不存在于试样中的合适内标化合物。要求：选择一个不存在于试样中的合适内标化合物。要求：内标物是高纯化合物；与试样中各组分很好分离，内标物是高纯化合物；与试样中各组分很好分离，且不与组分发生化学反应；分子结构、保留值与检且不与组分发生化学反应；分子结构、保留值与检测响应最好与待测组分相近。测响应最好与待测组分相近。v内标法是相对定量校正法，分离、检测条件对定量内标法是相对定量校正法，分离、检测条件对定量结果影响不如外标法敏感。结果影响不如外标法敏感。v首先测定待测组分、内标物对标准物的相对定量校首先测定待测组分、内标物对标准物的相对定量校正因子正因子v内标物的相对定量校正因子为：内标物的相对定量校正因子为：第七十八页，本课件共有79页感感谢谢大大家家观观看看第七十九页，本课件共有79页