蛋白质分离纯化PPT精选课件.ppt

关于蛋白质分离纯化PPT第一页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化n n （一）材料（一）材料（一）材料（一）材料 1 1 1 1、选材、选材、选材、选材 2 2 2 2、破碎、破碎、破碎、破碎 3 3 3 3、混合物的分离、混合物的分离、混合物的分离、混合物的分离n n （二）粗分级（二）粗分级（二）粗分级（二）粗分级n n （三）细分级（三）细分级（三）细分级（三）细分级n n （四）结晶（四）结晶（四）结晶（四）结晶第二页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化样品的前处理样品的前处理n1 1、生物样品的选择和处理、生物样品的选择和处理样品的选择：有效成分含量高、来源丰富、保持新鲜、实验条件恒定、取材工艺简单、有综合利用价值等。处理：包括去除脂肪、结缔组织等。n2 2、细胞破碎、细胞破碎：机械破碎法、物理学方法、化学法、酶学法n3 3、抽提（、抽提（extractionextraction）：）：是指在一定条件下，用适当的溶剂和方法，使有效成分充分溶解到溶剂的过程。第三页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质的分离方法蛋白质的分离方法n n根据蛋白质的溶解度差异分离根据蛋白质的溶解度差异分离根据蛋白质的溶解度差异分离根据蛋白质的溶解度差异分离 沉淀技术沉淀技术沉淀技术沉淀技术n n根据蛋白质分子大小的差异分离根据蛋白质分子大小的差异分离根据蛋白质分子大小的差异分离根据蛋白质分子大小的差异分离n n根据蛋白质的荷电差异分离根据蛋白质的荷电差异分离根据蛋白质的荷电差异分离根据蛋白质的荷电差异分离n n根据蛋白质与某些物质的吸附差异根据蛋白质与某些物质的吸附差异根据蛋白质与某些物质的吸附差异根据蛋白质与某些物质的吸附差异吸附分离吸附分离吸附分离吸附分离n n利用生物分子专一性结合的特性利用生物分子专一性结合的特性利用生物分子专一性结合的特性利用生物分子专一性结合的特性亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析第四页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化n n根据蛋白质的溶解度差异分离根据蛋白质的溶解度差异分离 沉淀技术沉淀技术沉淀技术沉淀技术n n可逆沉淀：可逆沉淀：可逆沉淀：可逆沉淀：等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀n n不可逆沉淀：不可逆沉淀：不可逆沉淀：不可逆沉淀：热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀第五页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化1、根据溶解度不同、根据溶解度不同（1 1）盐析（）盐析（salting outsalting out）1 1）定义：）定义：在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高这种现象称为盐溶（salting in），但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析（salting out）。2 2）原理）原理Salting in：蛋白质吸附某种离子蛋白质彼此排斥，而蛋白质与水相互作用加强溶解度提高。Salting out：大量中性盐加入破坏蛋白质分子表面的水活膜，降低水的活度，蛋白质表面的电荷被中和蛋白质相互聚集而析出。3 3）盐析中最常用的盐是：）盐析中最常用的盐是：(NH4)2SO4 4、Na2SO4、MgSO4，尤其以(NH4)2SO4为最佳。原因：(NH4)2SO4溶解度大而温度系数小，分离效果好，能保持蛋白质的天然构象，且价廉可得，这是蛋白质粗提纯的一种最常用方法。第六页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化（2 2）等电点沉淀法）等电点沉淀法1）pH 偏离pI时，蛋白质带相同符号的净电荷而互相排斥蛋白质溶解度大。2）pH=pI时，蛋白质的净电荷为0蛋白质聚集沉淀3）等电点沉淀法的缺点：沉淀不完全。（3 3）有机溶剂沉淀法）有机溶剂沉淀法1 1）原理：）原理：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜。2 2）注意：）注意：高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。第七页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化2 2、根据分子大小不同、根据分子大小不同（1 1）透析和超滤）透析和超滤1 1）透析（）透析（DialysisDialysis）：）：就是利用蛋白质分子不能通过半透膜（Semipermeable membrane）而小分子可以自由透过的性质，使蛋白质与小分子物质分开。作用：脱盐、无机离子和小分子物质等。透析膜：动物膜、羊皮纸、火棉胶、赛璐玢或其他材料等。第八页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化透析透析只用于除盐类和小分子杂质只用于除盐类和小分子杂质第九页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化透析透析只用于除盐类和小分子杂质只用于除盐类和小分子杂质第十页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化2 2）超滤（）超滤（ultrafiltrationultrafiltration）：）：是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量的物质分离的技术。Ultrafiltration的功能：纯化和浓缩（同PEG，聚乙二醇）。Ultrafiltration膜：丙烯氰、醋酸纤维素、硝酸纤维素和尼龙等。第十一页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化超过滤超过滤除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液第十二页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化（2）凝胶层析）凝胶层析n n又叫分子筛层析。又叫分子筛层析。又叫分子筛层析。又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。n n具备条件：具备条件：具备条件：具备条件：1 1 1 1、惰性，、惰性，、惰性，、惰性，2 2 2 2、水不溶性，、水不溶性，、水不溶性，、水不溶性，3 3 3 3、能高度水化。、能高度水化。、能高度水化。、能高度水化。n n常用分子筛：常用分子筛：常用分子筛：常用分子筛：葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（SephadexSephadexSephadexSephadex）型号：型号：型号：型号：G200G200G200G200、G150G150G150G150、G100G100G100G100、G75G75G75G75、G50G50G50G50、G25G25G25G25、G15G15G15G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐分离大蛋白质、小蛋白质，除盐分离大蛋白质、小蛋白质，除盐分离大蛋白质、小蛋白质，除盐 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶（瑞典（瑞典（瑞典（瑞典SepharoseSepharoseSepharoseSepharose、美国、美国、美国、美国Bio-GelABio-GelABio-GelABio-GelA）孔径大，用于分离大分子物质孔径大，用于分离大分子物质孔径大，用于分离大分子物质孔径大，用于分离大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelPBio-GelPBio-GelPBio-GelP）第十三页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化n n原理：原理：原理：原理：1 1 1 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；快；快；快；2 2 2 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。以小分子物质迁移速度慢。以小分子物质迁移速度慢。以小分子物质迁移速度慢。第十四页，本课件共有81页第十五页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化第十六页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化第十七页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化第十八页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化（3）密度梯度离心）密度梯度离心n原理：原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。第十九页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化密度梯度离心密度梯度离心滴加样品4%8%12%16%20%塑料离心管蔗糖密度梯度（介质还可用：氯化铯、甘油等）蔗糖浓度%分子量由小 大第二十页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化3 3、根据带电性质不同、根据带电性质不同n电泳法电泳法n离子交换层析离子交换层析第二十一页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化（1）电泳法）电泳法n n类型：类型：类型：类型：1 1 1 1、区带电泳、区带电泳、区带电泳、区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。细丝电泳、凝胶电泳。细丝电泳、凝胶电泳。细丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。2 2 2 2、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。第二十二页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化垂直板电泳垂直板电泳第二十三页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化垂直板电泳垂直板电泳第二十四页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化垂直板电泳垂直板电泳第二十五页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。第二十六页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化连续系统：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统：不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳第二十七页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化在浓缩胶中的三个主要作用角色：第二十八页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化浓缩效应：第二十九页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n n 蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。及分子大小和形状等因素。及分子大小和形状等因素。及分子大小和形状等因素。n n 加入加入加入加入SDSSDSSDSSDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与原蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与原蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与原蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关。来所带电荷、分子形状无关。来所带电荷、分子形状无关。来所带电荷、分子形状无关。n n SDSSDSSDSSDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。此时子处于伸展状态。此时子处于伸展状态。此时子处于伸展状态。此时SDSSDSSDSSDS以其烃链与蛋白质分子的侧以其烃链与蛋白质分子的侧以其烃链与蛋白质分子的侧以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个SDSSDSSDSSDS分分分分子。子。子。子。第三十页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n n导致：导致：导致：导致：1 1 1 1、由于、由于、由于、由于SDSSDSSDSSDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电是阴离子，使多肽表面覆盖的负电是阴离子，使多肽表面覆盖的负电是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。的电荷差异。的电荷差异。的电荷差异。2 2 2 2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDSSDSSDSSDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。大小成正比变化。大小成正比变化。大小成正比变化。第三十一页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n n 由于不同蛋白质的由于不同蛋白质的由于不同蛋白质的由于不同蛋白质的SDSSDSSDSSDS复合物具有相同的荷质复合物具有相同的荷质复合物具有相同的荷质复合物具有相同的荷质比，并具有相似的构象，因而有如下公式：比，并具有相似的构象，因而有如下公式：比，并具有相似的构象，因而有如下公式：比，并具有相似的构象，因而有如下公式：lgM=KlgM=KlgM=KlgM=K1 1 1 1KKKK2 2 2 2RRRR （K1K1K1K1、K2K2K2K2为常数，为常数，为常数，为常数，RRRR为相对迁移率）为相对迁移率）为相对迁移率）为相对迁移率）n n 实际测定时，以几种标准单体蛋白质分子量的对数值对实际测定时，以几种标准单体蛋白质分子量的对数值对实际测定时，以几种标准单体蛋白质分子量的对数值对实际测定时，以几种标准单体蛋白质分子量的对数值对其其其其RRRR作图，根据样品的作图，根据样品的作图，根据样品的作图，根据样品的RRRR值，从标准曲线上就可查值，从标准曲线上就可查值，从标准曲线上就可查值，从标准曲线上就可查出其分子量。出其分子量。出其分子量。出其分子量。第三十二页，本课件共有81页第三十三页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第三十四页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化第三十五页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化等电聚焦等电聚焦（Isoelectric focusing）(1)(1)(1)(1)以不同蛋白质的等电点的差异分离。以不同蛋白质的等电点的差异分离。以不同蛋白质的等电点的差异分离。以不同蛋白质的等电点的差异分离。(2)(2)(2)(2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。(3)(3)(3)(3)载体两性电解质：载体两性电解质：载体两性电解质：载体两性电解质：a a a a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能相差太大是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能相差太大是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能相差太大是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能相差太大（小数点后（小数点后（小数点后（小数点后2 2 2 2位）；最常用为位）；最常用为位）；最常用为位）；最常用为3.0-10.03.0-10.03.0-10.03.0-10.0范围，还有范围，还有范围，还有范围，还有3.0-7.03.0-7.03.0-7.03.0-7.0、5.0-10.05.0-10.05.0-10.05.0-10.0。b b b b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列；混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列；混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列；混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列；c c c c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的脂肪族化合物；脂肪族化合物；脂肪族化合物；脂肪族化合物；d d d d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。第三十六页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化等电聚焦等电聚焦（Isoelectric focusing）n n 通电后，在介质中由于通电后，在介质中由于通电后，在介质中由于通电后，在介质中由于H H H H+与与与与OHOHOHOH-的相向移动，形成了的相向移动，形成了的相向移动，形成了的相向移动，形成了从从从从3.0-10.03.0-10.03.0-10.03.0-10.0的一系列的一系列的一系列的一系列pHpHpHpH梯度。当载体两性电解质移动到梯度。当载体两性电解质移动到梯度。当载体两性电解质移动到梯度。当载体两性电解质移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持pHpHpHpH梯梯梯梯度（电导、缓冲能力）。度（电导、缓冲能力）。度（电导、缓冲能力）。度（电导、缓冲能力）。即：即：即：即：pHpHpHpH梯度由梯度由梯度由梯度由H H H H+与与与与OHOHOHOH-建立，而由载体两性电解质建立，而由载体两性电解质建立，而由载体两性电解质建立，而由载体两性电解质来维持。当蛋白质移动到相应的来维持。当蛋白质移动到相应的来维持。当蛋白质移动到相应的来维持。当蛋白质移动到相应的pHpHpHpH值处，结束。值处，结束。值处，结束。值处，结束。n n注意事项：注意事项：注意事项：注意事项：1 1 1 1、时间相对长对分离有利；、时间相对长对分离有利；、时间相对长对分离有利；、时间相对长对分离有利；2 2 2 2、也可用来测定蛋白质的等电点。、也可用来测定蛋白质的等电点。、也可用来测定蛋白质的等电点。、也可用来测定蛋白质的等电点。第三十七页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化等电聚焦等电聚焦（Isoelectric focusing）第三十八页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化第三十九页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化等电聚焦等电聚焦（Isoelectric focusing）第四十页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化（2）离子交换层析）离子交换层析n以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。n基本原理：基本原理：离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。第四十一页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化n离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。n平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换阴离子交换剂剂。n当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。第四十二页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化离子交换层析离子交换层析第四十三页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化第四十四页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化第四十五页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化离子交换层析离子交换层析n n吸附本质：非共价连接吸附本质：非共价连接吸附本质：非共价连接吸附本质：非共价连接n n常用吸附剂：结晶磷酸钙、硅胶常用吸附剂：结晶磷酸钙、硅胶常用吸附剂：结晶磷酸钙、硅胶常用吸附剂：结晶磷酸钙、硅胶n n脱附方式：脱附方式：脱附方式：脱附方式：1 1 1 1、改变蛋白质带电状态；、改变蛋白质带电状态；、改变蛋白质带电状态；、改变蛋白质带电状态；2 2 2 2、改变环境溶液的、改变环境溶液的、改变环境溶液的、改变环境溶液的pHpHpHpH、离子强度等。、离子强度等。、离子强度等。、离子强度等。第四十六页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化4 4、根据配体特异性不同、根据配体特异性不同n亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography)是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。n亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，具有很高的分辨率，在生物分离中有广泛的应用。第四十七页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化n亲和层析的基本原理：亲和层析的基本原理：生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原抗体、酶底物或抑制剂、激素受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。一个分子进行分离纯化。第四十八页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化n被固定在基质上的分子称为配体配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂亲和吸附剂。n亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力的物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等等。并将配体共价结合在适当的不溶性基质上，如常用的Sepharose4B等。n将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。第四十九页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化第五十页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化第五十一页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化小小 结结n n粗分级一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级等方粗分级一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级等方粗分级一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级等方粗分级一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级等方法；法；法；法；n n细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换层析、细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换层析、细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换层析、细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等方法。必要时，还可采用电泳法，吸附层析、亲和层析等方法。必要时，还可采用电泳法，吸附层析、亲和层析等方法。必要时，还可采用电泳法，吸附层析、亲和层析等方法。必要时，还可采用电泳法，包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步骤。包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步骤。包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步骤。包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步骤。第五十二页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质测序，主要指的是蛋白质的一级结构的测定，包括组成蛋白质的多肽链数目，多肽链的氨基酸种类、数目及排列顺序。测序要求测序要求 1 样品必须纯（97%以上）；2 知道蛋白质的分子量知道蛋白质的分子量；3 知道蛋白质由几条肽链组成；4 测定蛋白质的氨基酸组成，并根据分子量计算每种氨基酸的个数；5 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。第五十三页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定n n最小分子量测定法最小分子量测定法最小分子量测定法最小分子量测定法 如如如如MbMbMbMb含含含含FeFeFeFe为为为为0.335%0.335%0.335%0.335%，则，则，则，则 M=55.8/0.335%=16700M=55.8/0.335%=16700M=55.8/0.335%=16700M=55.8/0.335%=16700。这就是最小分子量。这就是最小分子量。这就是最小分子量。这就是最小分子量。其实，真实分子量是最小分子量的其实，真实分子量是最小分子量的其实，真实分子量是最小分子量的其实，真实分子量是最小分子量的n n n n倍，倍，倍，倍，n n n n指指指指FeFeFeFe的数目，的数目，的数目，的数目，MbMbMbMb的的的的n=1n=1n=1n=1，所以，所以，所以，所以M=16700M=16700M=16700M=16700；而；而；而；而HbHbHbHb用其他方法测得分子量为用其他方法测得分子量为用其他方法测得分子量为用其他方法测得分子量为68000680006800068000，则说，则说，则说，则说HbHbHbHb含含含含4 4 4 4个个个个FeFeFeFe原子。原子。原子。原子。第五十四页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定n n渗透压法渗透压法渗透压法渗透压法M=CRT/第五十五页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定n n超离心法超离心法超离心法超离心法沉降平衡法：样品溶液在分析池中经低速长时间离心，分析池内样品浓度分布达到热力学平衡时，根据分析池内样品的浓度分布可以求算分子量。第五十六页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定n n凝胶过滤法凝胶过滤法凝胶过滤法凝胶过滤法 经验公式：经验公式：经验公式：经验公式：lgM=K1-K2VelgM=K1-K2VelgM=K1-K2VelgM=K1-K2Ve（K1K1K1K1、K2K2K2K2为常数）为常数）为常数）为常数）用几种已知蛋白质，测其用几种已知蛋白质，测其用几种已知蛋白质，测其用几种已知蛋白质，测其VeVeVeVe，再对，再对，再对，再对lgMlgMlgMlgM作图得标准作图得标准作图得标准作图得标准曲线。再测定未知蛋白质的曲线。再测定未知蛋白质的曲线。再测定未知蛋白质的曲线。再测定未知蛋白质的VeVeVeVe，可得，可得，可得，可得M M M M。第五十七页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定n nSDS-SDS-SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 lgM=KlgM=KlgM=KlgM=K1 1 1 1KKKK2 2 2 2RRRR （K1K1K1K1、K2K2K2K2为常数，为常数，为常数，为常数，RRRR为相对迁移率）为相对迁移率）为相对迁移率）为相对迁移率）第五十八页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化氨基酸平均分子量为氨基酸平均分子量为128128，测得某蛋白质分子量约为，测得某蛋白质分子量约为5646.5646.由此推断由此推断该蛋白质含有的肽链条数和氨基酸个数依次是？该蛋白质含有的肽链条数和氨基酸个数依次是？氨基酸脱水缩合形成肽链，再形成蛋白质。氨基酸脱水缩合形成肽链，再形成蛋白质。每两个氨基酸脱掉一个水分子（就像每两个氨基酸脱掉一个水分子（就像5个手指头，有个手指头，有4个手指缝一样），倘若一个手指缝一样），倘若一个肽链，则有个肽链，则有X个氨基酸，就会脱掉（个氨基酸，就会脱掉（X-1）个水；若两个肽链，则有）个水；若两个肽链，则有X个氨基个氨基酸，就会脱掉（酸，就会脱掉（X-2）个水。依此类推）个水。依此类推假设：氨基酸个数为假设：氨基酸个数为X个，肽链有个，肽链有y条，则，脱掉水分子个数为（条，则，脱掉水分子个数为（X-y）个）个列式：列式：128x-18（x-y）=5646110 x+18y=5646110 x=5646-18y因为肽链个数都有限，所以，因为肽链个数都有限，所以，y的数字从的数字从1开始试着带进去，看什么时候，开始试着带进去，看什么时候，x能得到整数能得到整数解（因为无论氨基酸还是水都不可能是小数个）解（因为无论氨基酸还是水都不可能是小数个）例如：当例如：当y=1时，时，x=51.16,现实中不可能，所以，结果排出现实中不可能，所以，结果排出再试着带入再试着带入y=2时，时，x=51，整数解，符合实际情况，所以，答案应为，整数解，符合实际情况，所以，答案应为2和和51第五十九页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化测定步骤测定步骤1 1 多肽链的拆分。多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。2 2 测定蛋白质分子中多肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。3 3 二硫键的断裂。二硫键的断裂。几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的巯基乙醇巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。第六十页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化4 4 测定每条多肽链的氨基酸组成，测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比或并计算出氨基酸成分的分子比或各种残基的数目各种残基的数目用6mol/L6mol/L的盐酸或的盐酸或4mol/L4mol/L的硫酸的硫酸在105-110条件下进行水解，反应时间约20小时，色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。用5mol/L5mol/L氢氧化钠氢氧化钠煮沸10-20小时，色氨酸在水解中不受破坏，其它氨基酸都受到不同程度的破坏。5 5 分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端 N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；氨肽酶法），C末端分析法（肼解法；羧肽酶法；硼氢化锂法）。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。氨肽酶氨肽酶：能催化多肽链的游离N端（氨基末端），由外向里，把肽链的氨基酸逐个切下。较常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶。特殊的氨肽酶有仅作用于N末端为脯氨酸的脯氨酸亚氨肽酶以及只作用于三肽的氨基三肽酶等。第六十一页，本课件共有81页蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化SangerSanger法法N