血液细胞组织化学幻灯片精选课件.ppt

关于血液细胞组织化学幻灯片第一页，本课件共有65页概述 l l细胞化学染色是在组织化学的基础上发展细胞化学染色是在组织化学的基础上发展起来的一个学科分支，是细胞学与化学相结起来的一个学科分支，是细胞学与化学相结合而形成的一门科学，研究细胞的化学成分，合而形成的一门科学，研究细胞的化学成分，在保存血液细胞形态的基础上，在细胞原位在保存血液细胞形态的基础上，在细胞原位显示化学反应的结果，根据化学反应的原理，显示化学反应的结果，根据化学反应的原理，研究细胞成分的化学性质。研究细胞成分的化学性质。第二页，本课件共有65页研究目的及临床应用 l l研究正常血液细胞的活动与生理功能l l提高血液病的诊断和鉴别诊断水平确定急性白血病的类型有助于某些血液病的鉴别诊断观察疗效和估计预后l l探索某些血液病的发病原理及治疗机制 第三页，本课件共有65页标本的选择l lBM片、血片、淋巴结印片、脾印片等均可作组化染色。l l用于酶染色的标本应尽可能新鲜。l l用于非酶染色的标本可在室温下放置1个月，如PAS标本。第四页，本课件共有65页固定的目的及方法l l目的 保保持持细细胞胞生生前前的的结结构构与与化化学学成成分分，并并使使血血膜膜在在染色、冲洗过程中不易脱落损坏。染色、冲洗过程中不易脱落损坏。l l常用化学固定方法常用化学固定方法 甲醛蒸汽固定：将滤纸平铺于染色缸底部，加入少许40%甲醛溶液。将涂片标本放入缸内，加盖使甲醛蒸汽固定血膜5-105-10分钟，水洗后晾干。分钟，水洗后晾干。液体固定：常用的固定液为乙醇、丙酮、甲醇、甲醛等，也可用两种或两种以上成分组成混合固定液。第五页，本课件共有65页显示方法l l 纯化学方法金属沉淀法偶氮偶联法联苯胺色素法Schiff反应普鲁士蓝反应l l 类化学方法类化学方法l l物理学方法第六页，本课件共有65页复染方法 l l复染是细胞内化学成分显色后，为了便于观察而进行的对比染色方法。细胞核复染法：常用染料为苏木精、甲基绿、核固红、沙黄等。细胞浆复染法：常用染料为伊红、光绿等第七页，本课件共有65页过氧化物酶染色（Peroxidase stain,POX）第八页，本课件共有65页目的 l l急性白血病的鉴别诊断 AML：阳性 ALL：阴性 第九页，本课件共有65页分布特点-1l l原粒细胞：阴性，白血病副原粒细胞可呈阳性反应。原粒细胞：阴性，白血病副原粒细胞可呈阳性反应。原粒细胞：阴性，白血病副原粒细胞可呈阳性反应。原粒细胞：阴性，白血病副原粒细胞可呈阳性反应。l l中性粒细胞：自早幼粒细胞起随细胞成熟阳性强度中性粒细胞：自早幼粒细胞起随细胞成熟阳性强度中性粒细胞：自早幼粒细胞起随细胞成熟阳性强度中性粒细胞：自早幼粒细胞起随细胞成熟阳性强度递增。阳性颗粒圆形，规则，直径与嗜苏丹黑颗粒递增。阳性颗粒圆形，规则，直径与嗜苏丹黑颗粒递增。阳性颗粒圆形，规则，直径与嗜苏丹黑颗粒递增。阳性颗粒圆形，规则，直径与嗜苏丹黑颗粒相仿，比瑞氏染色特殊颗粒大。相仿，比瑞氏染色特殊颗粒大。相仿，比瑞氏染色特殊颗粒大。相仿，比瑞氏染色特殊颗粒大。l l 嗜酸粒细胞：阳性反应，颗粒比中性粒细胞的嗜酸粒细胞：阳性反应，颗粒比中性粒细胞的 大，着色深。大，着色深。大，着色深。大，着色深。l l嗜碱粒细胞：阴性反应，在嗜碱粒细胞：阴性反应，在CMLCML时可出现阳性时可出现阳性反应。反应。第十页，本课件共有65页分布特点-2l l在粒细胞系统中，过氧化物酶颗粒的出现和在粒细胞系统中，过氧化物酶颗粒的出现和增多与特殊颗粒增多与特殊颗粒 的出现和增多有平行关系。的出现和增多有平行关系。l l单核细胞系：原单呈阴性反应，幼单和单核细单核细胞系：原单呈阴性反应，幼单和单核细胞呈弱阳性反应。阳性颗粒少而细小，弥散分胞呈弱阳性反应。阳性颗粒少而细小，弥散分布，有的也可呈阴性反应。布，有的也可呈阴性反应。l l其他细胞：淋巴细胞、巨核细胞、血小板、其他细胞：淋巴细胞、巨核细胞、血小板、幼红细胞、浆细胞和组织细胞均呈阴性反应。幼红细胞、浆细胞和组织细胞均呈阴性反应。有的吞噬细胞可呈阳性反应有的吞噬细胞可呈阳性反应 第十一页，本课件共有65页第十二页，本课件共有65页试剂配制l l0.3%联苯胺酒精溶液：联苯胺0.3g+95%乙醇全溶后，加入亚硝 基铁氰化钠饱和水溶液1ml。可保存1-2年。l l过氧化氢溶液配制：3%过氧化氢1滴+蒸馏水5ml，须每次用时新鲜配制。第十三页，本课件共有65页染色步骤 l l于新鲜涂片上滴加复方联苯胺染液38滴，使涂片盖满。l l12分钟后加入等量过氧化氢溶液。l l48分钟后用水冲洗，空气中晾干。l l用瑞氏染液复染，凉干后油镜观察。第十四页，本课件共有65页染色原理 l l粒细胞及部分单核细胞胞浆内的颗粒中含有过氧化物酶，该酶能分解过氧化氢，释放出新生态的氧。从而使无色的联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝。l l联苯胺蓝是一种不稳定的中间产物，它可进一步氧化变成棕色的化合物 第十五页，本课件共有65页结果判断 l l阳性反应为蓝色或蓝棕色颗粒，定位于胞浆中。第十六页，本课件共有65页临床意义 l lALLALL时，原始细胞的POXPOX阳性小于阳性小于3%。l lAML时，原始细胞的阳性3%。l l在多数的在多数的M1、绝大部分、绝大部分M2和和M3中，原始细胞的阳性中，原始细胞的阳性率大于率大于85%85%。M4和M5时，原单有时可呈弱阳性，但绝大多数的原单是POXPOX阴性。阴性。M6，原粒和幼稚粒，原粒和幼稚粒细胞是细胞是POX阳性，幼红细胞是阳性，幼红细胞是POXPOX阴性。在M7，血小板POXPOX的活性只能在超微结构上证实。l lMDSMDS时，粒细胞白血病和感染所致的时，粒细胞白血病和感染所致的WBCWBC增高时，成熟中性粒细胞的POXPOX活性可能降低或消失。活性可能降低或消失。l lCML时，成熟中性粒细胞的时，成熟中性粒细胞的POX活性增强。第十七页，本课件共有65页注意事项 l l已固定的血膜因为酶已破坏不能再作过氧化物酶染色。l l所用过氧化氢必须新鲜，加于血膜上应能发生泡沫。过量时红细胞可出现假阳性。l l过氧化氢的浓度要适当加减，过量则颗粒色深，不足则颗粒色淡。l l滴加过氧化氢液之后，最好将染片置于载物台上，用低倍镜观察，发现胞浆出现阳性颗粒时，立即水洗。第十八页，本课件共有65页第十九页，本课件共有65页糖原染色（Periodicacid-Schiffreaction,PAS）第二十页，本课件共有65页目的 l l红白血病（+）与巨幼红细胞贫血（-）的鉴别诊断l lMDS与巨幼红细胞贫血（-）的鉴别诊断l l单核细胞白血病（+）与组织细胞病（MH）的鉴别诊断l l淋巴肉瘤、何杰金病与急性淋巴细胞白血病的鉴别诊断l l高歇病与尼曼-匹克病的鉴别诊断以上都是前者增高，后者降低或阴性。第二十一页，本课件共有65页试剂-1l l10g/L过碘酸液l lSchiff染液：碱性品红0.5g0.5gDH2O100mlDH2O100mlDH2 2O O煮沸后待片刻，加入碱性品红，振荡数分钟使煮沸后待片刻，加入碱性品红，振荡数分钟使品红溶解，冷至品红溶解，冷至5050加入1M的盐酸的盐酸20ml，混匀。待冷却至25加入偏重亚硫酸钠0.5g，混合，置于带塞的棕色瓶中，放于暗处24小时。染液为无色，如为微红则加活性炭1 12g，混合过滤，如过滤液仍有红色，应再加少许活性炭，至红色完全被吸收为止。制成后置于棕色瓶内保存在冰箱备用，如变为红色，则不能使用。第二十二页，本课件共有65页试剂-2 l l苏木素液：苏木素苏木素0.9g9595乙醇10ml10ml铵（钾）明矾铵（钾）明矾20g20gDHDH2O200ml将苏木素溶于将苏木素溶于95的乙醇，钾明矾溶于水（可加热），然后将苏木素液加入明矾液中混合，用强火煮沸后加氧化汞0.5g0.5g，迅速搅拌，呈深紫色，迅速移入冷，迅速搅拌，呈深紫色，迅速移入冷水中，次日过滤，临用时取此液水中，次日过滤，临用时取此液95ml加冰醋酸5ml，可使细胞着色清楚。可使细胞着色清楚。第二十三页，本课件共有65页染色步骤 l l将新鲜血片或骨髓片用95乙醇固定10分钟。l l10g/L过碘酸液作用20分钟l lDH2O洗涤1分钟，晾干l lSchiff染液，60分钟l l用自来水洗涤15分钟（细水长流冲洗）l l苏木素染液10分钟。l l自来水冲洗15分钟，待干镜检。第二十四页，本课件共有65页染色原理 l l过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛，再与Schiff氏液的无色品红结合，呈红色，定位于胞浆上。第二十五页，本课件共有65页结果判断 l l正常BM：有有核核红红细细胞胞几几乎乎均均呈呈阴阴性性反反应应，在在AMLM6M6，幼红细胞为，幼红细胞为PASPAS强阳性。强阳性。l l中性粒细胞：原原粒粒细细胞胞多多为为阴阴性性，早早幼幼粒粒阶阶段段开开始始呈呈PASPAS阳性，其后各阶段阳性逐渐增强。l l巨巨核核细细胞胞和和血血小小板板：不含糖原，但含粘多糖等，故巨核细胞为细小弥散的阳性，PLT为粉红色。l lALLALL：可以是密集粗块状的颗粒，也能是细小弥散的颗粒，或是这两种颗粒的混合。ALL的PAS也也可可能为阴性，特别是能为阴性，特别是L3时。时。l l单核细胞白血病，原单细胞常为阴性，幼单和成熟，原单细胞常为阴性，幼单和成熟单可有弱阳性或弥散阳性。单可有弱阳性或弥散阳性。第二十六页，本课件共有65页注意事项 l l1）Schiff液变红不能再用。l l2）碱性品红的质量很重要，如碱性品红不合格，加活性炭，颜色也不被吸附。l l如无苏木精复染液，可用1%甲绿复染25分替代。第二十七页，本课件共有65页第二十八页，本课件共有65页第二十九页，本课件共有65页第三十页，本课件共有65页非特异性酯酶染色第三十一页，本课件共有65页原理原理 l l非特异性酯酶是作用于短链脂肪的酶，当酯酶活性存在时，水解基质中的醋酸萘酚，与重氮盐偶联，生成不溶性的有机产物，定位于胞浆上。第三十二页，本课件共有65页试剂试剂l l甲醛：l l基质液：1/15M的磷酸缓冲液 PH7.4 40mll l10g/L 醋酸萘酚50丙酮液 0.8ml 重氮盐（Diazo blue B）40mg第三十三页，本课件共有65页方法方法 l l新鲜涂片用甲醛蒸汽固定新鲜涂片用甲醛蒸汽固定5分钟。分钟。l l流水冲洗流水冲洗5分钟，晾干。分钟，晾干。l l置于基质液中置于基质液中371小时，水洗泡小时，水洗泡10分钟。分钟。l l20g/L甲绿复染甲绿复染2030分钟。分钟。l l水洗，晾干，镜检。水洗，晾干，镜检。第三十四页，本课件共有65页临床意义临床意义 l l单核细胞系统呈阳性，伴随着细胞的成熟而加强，对AL有鉴别诊断作用。第三十五页，本课件共有65页非特异性酯酶-氟化钠抑制试验 l l同非特异性酯酶，只是在同非特异性酯酶，只是在1ml作用液中，加入作用液中，加入1.5mg 氟化钠，即可抑制单核细胞的酯酶，氟化钠，即可抑制单核细胞的酯酶，故可作急性单核细胞白血病的鉴别诊断。故可作急性单核细胞白血病的鉴别诊断。第三十六页，本课件共有65页第三十七页，本课件共有65页第三十八页，本课件共有65页第三十九页，本课件共有65页急性白血病中的组化染色 白血病白血病白血病白血病POXNSEPASPOXNSEPASALL ALL+AML AML M0M0+M1M1+(3(3原始细胞原始细胞原始细胞原始细胞)M2M2+M3M3+M4M4+（原单细胞）（原单细胞）（原单细胞）（原单细胞）M5M5/+/+/+/+M6M6+（原粒细胞）（原粒细胞）（原粒细胞）（原粒细胞）+（幼红细胞）（幼红细胞）（幼红细胞）（幼红细胞）M7M7+第四十页，本课件共有65页中性粒细胞碱性磷酸酶染色（AKP）第四十一页，本课件共有65页目的l l鉴别白血病（低）和白血病样（高）反应鉴别白血病（低）和白血病样（高）反应l l鉴别淋巴肉瘤（高）和何杰金病鉴别淋巴肉瘤（高）和何杰金病l l鉴别细菌性感染（高）与病毒性感染鉴别细菌性感染（高）与病毒性感染 第四十二页，本课件共有65页分布 l l血细胞的碱性磷酸酶活性，主要见于成熟的血细胞的碱性磷酸酶活性，主要见于成熟的中性粒细胞，定位于胞浆中。中性粒细胞，定位于胞浆中。第四十三页，本课件共有65页原理 l l细胞中的细胞中的AKP在在PH9.59.6缓冲液中能使基缓冲液中能使基质中的磷酸萘酚钠水解，释放出萘酚。后者质中的磷酸萘酚钠水解，释放出萘酚。后者与一种稳定的重氮盐（常用有固紫与一种稳定的重氮盐（常用有固紫Fast-Garnet，GBC或固蓝或固蓝RR）偶联，生成不溶性）偶联，生成不溶性的偶氮染料，沉积于细胞上。的偶氮染料，沉积于细胞上。第四十四页，本课件共有65页试剂 l l95%乙醇乙醇乙醇乙醇l l固酱紫固酱紫GBCl lAS-BI磷酸萘酚磷酸萘酚12.5mg+DH2O100mll l0.2M0.2Mtristris缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液：三三三三羟羟羟羟甲甲甲甲基基基基氨氨氨氨基基基基甲甲甲甲烷烷烷烷2.43g+DH2O溶溶溶溶至至至至100ml。l l0.05M0.05Mtristris缓缓冲冲液液（PH8.6-9.0PH8.6-9.0）：0.20.2MMtristris缓缓冲冲液液25ml+0.1MHCL49ml25ml+0.1MHCL49mll l贮贮贮贮存存存存液液液液：50ml50mlAS-BIAS-BI磷磷酸酸萘萘酚酚+PH8.80.05Mtris缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液50ml混匀，冰箱保存混匀，冰箱保存l l1%甲基绿甲基绿 第四十五页，本课件共有65页染色步骤 新鲜新鲜BM片及血片待干片及血片待干l l95%乙醇固定乙醇固定10分钟分钟l l固固酱酱紫紫1mg+2ml贮贮存存液液混混匀匀，立立即即滴滴加加数数滴在血片或滴在血片或BM片上，置片上，置37孵箱孵育孵箱孵育30分钟分钟l l用蒸馏水快冲用蒸馏水快冲 l l放入放入1%甲绿中复染甲绿中复染5分钟分钟l l用蒸馏水快冲，待干，镜检用蒸馏水快冲，待干，镜检 第四十六页，本课件共有65页结果判断 l l阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆 内。内。l l 计数方法，按碱酶活性强弱，分为计数方法，按碱酶活性强弱，分为计数方法，按碱酶活性强弱，分为计数方法，按碱酶活性强弱，分为0-4+0-4+共共5级。级。分数分数特点特点0胞浆内无红色的颗粒胞浆内无红色的颗粒11弥散的红色，偶见颗粒弥散的红色，偶见颗粒22弥散的红色，有中等量的颗粒弥散的红色，有中等量的颗粒33显著的红色，有较多的颗粒显著的红色，有较多的颗粒44显著的红色，有充满胞浆的粗大颗粒显著的红色，有充满胞浆的粗大颗粒第四十七页，本课件共有65页计算积分分数分数细胞数目细胞数目积分积分0200145452255035154520总数总数100130=LAP积分积分 第四十八页，本课件共有65页临床意义临床意义 l l正正正正常常常常的的的的LAPLAP积积分分是是2020100分分，但但因因为为计计数数的的主主观观性，很重要的是建立每个实验室自己的正常值。性，很重要的是建立每个实验室自己的正常值。临床诊断临床诊断临床诊断临床诊断积分积分积分积分正常正常20100CML1313类白血病类白血病类白血病类白血病100真红真红100200200继发性红细胞增多继发性红细胞增多继发性红细胞增多继发性红细胞增多10100 第四十九页，本课件共有65页第五十页，本课件共有65页铁粒染色铁粒染色第五十一页，本课件共有65页原理原理 l骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其中的三价铁与分子中的蛋白铁，其中的三价铁与分子中的蛋白质结合不牢，经稀盐酸处理后而游质结合不牢，经稀盐酸处理后而游离出来，并能在酸性亚铁氰化钾溶离出来，并能在酸性亚铁氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞内铁液中产生普鲁士蓝反应。细胞内铁也可用此法显示。根据反应的强弱也可用此法显示。根据反应的强弱了解骨髓中铁的含量。了解骨髓中铁的含量。第五十二页，本课件共有65页试剂试剂 l l酸性亚铁氰化钾溶液：酸性亚铁氰化钾溶液：200g/L亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液 5 5份份份份 浓盐酸浓盐酸 1份份份份 取取200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入浓亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入浓亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入浓亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入浓盐酸，边滴加边摇匀，至出现白色沉淀，再滴加盐酸，边滴加边摇匀，至出现白色沉淀，再滴加盐酸，边滴加边摇匀，至出现白色沉淀，再滴加盐酸，边滴加边摇匀，至出现白色沉淀，再滴加200g/L200g/L亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消失为止，备用。失为止，备用。失为止，备用。失为止，备用。l l2g/L核固红硫酸铝溶液：取硫酸铝核固红硫酸铝溶液：取硫酸铝核固红硫酸铝溶液：取硫酸铝核固红硫酸铝溶液：取硫酸铝10g加入加入加入加入100ml DH2O再加入核固红再加入核固红再加入核固红再加入核固红EMEREMER出品出品 0.2g0.2g，置于，置于37水浴中水浴中水浴中水浴中1 1小时，并经常振荡，使溶解，过滤后使用。小时，并经常振荡，使溶解，过滤后使用。小时，并经常振荡，使溶解，过滤后使用。小时，并经常振荡，使溶解，过滤后使用。第五十三页，本课件共有65页方法方法l l选骨髓小粒丰富的骨髓涂片l l玻片上滴加酸性亚铁氰化钾，染色30分钟。（可置于37）l l用DH2O冲洗后用核固红染液复染1015分钟。l l流水冲洗，晾干，油镜检查。第五十四页，本课件共有65页结果结果 l l正常人细胞外铁：幼红细胞呈鲜红色，胞浆成淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。细胞外铁的判断用低倍镜观察涂片，特别时涂片尾部和骨髓小粒附近。第五十五页，本课件共有65页细胞外铁判断标准l l无颗粒l l有少数铁颗粒或偶见铁小珠l l有较多的铁颗粒和小珠l l有很多的铁颗粒，小珠和少数小块状l l有极多的铁颗粒，小珠并有很多的小块，密集成堆第五十六页，本课件共有65页第五十七页，本课件共有65页铁粒幼红细胞的分型l l1型仅含一个铁颗粒l l2型含25个铁颗粒l l3型含69个铁颗粒l l4型含10个以上的铁颗粒第五十八页，本课件共有65页第五十九页，本课件共有65页环形铁粒幼细胞 l l含铁颗粒6个以上，其中2/3以上的铁颗粒围绕核周围排列成完全环形或不完全环形（围绕核周围指分布紧靠着细胞核或靠近细胞核的1/3胞浆内，铁颗粒增多时，可分布于外2/3的胞浆内。第六十页，本课件共有65页第六十一页，本课件共有65页临床意义临床意义 l lIDA：骨骨髓髓细细胞胞外外铁铁和和内内铁铁显显著著减减少少或或消消失失，铁铁粒粒幼幼红红细细胞胞阳阳性性率率为为016，铁铁颗颗粒粒极极少少并并着着色色浅浅，以以1型型为为主主，2型型者者极极少少，3型型以以上上者者不不见见。经经铁铁剂剂治治疗疗后后细细胞胞外外铁铁和和内内铁铁可可迅迅速速增增多多，因因此此是是诊诊断断IDA和和指指导导铁铁剂剂治治疗疗的的一种辅助方法。一种辅助方法。第六十二页，本课件共有65页l l是诊断铁粒幼红细胞贫血的重要依据，能发是诊断铁粒幼红细胞贫血的重要依据，能发现数量不等的环状铁粒幼红细胞，并且多见现数量不等的环状铁粒幼红细胞，并且多见粗颗粒的粗颗粒的3型和型和4型铁粒幼红细胞。型铁粒幼红细胞。第六十三页，本课件共有65页注意事项注意事项 l l玻玻片片必必须须经经无无铁铁处处理理：将将新新玻玻片片经经清清洁洁液液浸浸泡泡24小小时时，取取出出后后反反复复水水洗洗浸浸入入95酒酒精精24小小时时，晾晾干干，再再浸浸泡泡在在5盐盐酸酸中中24小小时时，用用D2H2O反复洗玻片，取出烤干后备用。反复洗玻片，取出烤干后备用。l l酸性亚铁氰化钾液必须新鲜配制。酸性亚铁氰化钾液必须新鲜配制。l l最好用骨髓小粒丰富的骨髓涂片进行染色并作最好用骨髓小粒丰富的骨髓涂片进行染色并作细胞外铁观察。细胞外铁观察。第六十四页，本课件共有65页感感谢谢大大家家观观看看第六十五页，本课件共有65页