实验紫外分光光度法测定蛋白质含量.ppt

分光光度法分光光度法分光光度法的原理分光光度法的原理vvLambert-BeerLambert-Beer定律（光吸收定律）定律（光吸收定律）定律（光吸收定律）定律（光吸收定律）vv溶液的质量浓度（溶液的质量浓度（溶液的质量浓度（溶液的质量浓度（C C）越大，液层厚度（）越大，液层厚度（）越大，液层厚度（）越大，液层厚度（L L）越厚，则）越厚，则）越厚，则）越厚，则溶液对光线吸收得越多。溶液对光线吸收得越多。溶液对光线吸收得越多。溶液对光线吸收得越多。当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即KK吸光系数为定值），溶液对光线的吸收与溶液中吸光吸光系数为定值），溶液对光线的吸收与溶液中吸光吸光系数为定值），溶液对光线的吸收与溶液中吸光吸光系数为定值），溶液对光线的吸收与溶液中吸光物质的浓度成正比。物质的浓度成正比。物质的浓度成正比。物质的浓度成正比。所以可通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的所以可通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的所以可通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的所以可通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的含量。含量。含量。含量。入射光入射光 I I0 0出射光出射光It反射光反射光 IrIa吸收光吸收光I It tI I0 0 T TT T（transmittance transmittance）称为透光度称为透光度称为透光度称为透光度 ，表示透过光的强度是，表示透过光的强度是，表示透过光的强度是，表示透过光的强度是入射光强度的百分比。入射光强度的百分比。入射光强度的百分比。入射光强度的百分比。A AC C 光密度与浓度成正比光密度与浓度成正比光密度与浓度成正比光密度与浓度成正比T T与与与与C C成反比，浓度愈大，成反比，浓度愈大，成反比，浓度愈大，成反比，浓度愈大，T T愈小愈小愈小愈小A=A=-lg-lg=KCLKCL T T A A （AbsorbanceAbsorbance）称为称为称为称为吸光度，吸光度，吸光度，吸光度，指指指指溶液对光线的吸收程度溶液对光线的吸收程度溶液对光线的吸收程度溶液对光线的吸收程度又又又又称为光密度（称为光密度（称为光密度（称为光密度（Optical densityOptical density，OD OD）。）。）。）。分光光度法的应用分光光度法的应用vv用标准管法计算待测液浓度用标准管法计算待测液浓度用标准管法计算待测液浓度用标准管法计算待测液浓度 在相同条件下测定在相同条件下测定在相同条件下测定在相同条件下测定已知浓度（已知浓度（已知浓度（已知浓度（C CS S）标准液的吸光度（标准液的吸光度（标准液的吸光度（标准液的吸光度（A AS S），及未知浓度（），及未知浓度（），及未知浓度（），及未知浓度（C CU U）溶液的吸光度（）溶液的吸光度（）溶液的吸光度（）溶液的吸光度（A AU U），根据定律得：），根据定律得：），根据定律得：），根据定律得：A AU U=K=KU UC CU UL LU U ；A AS S=K=KS SC CS SL LS S 因为因为因为因为KKU U=K=KS S，L LU U=L=LS S 所以所以所以所以A AS S与与与与A AU U之比值也等于两浓度之比值之比值也等于两浓度之比值之比值也等于两浓度之比值之比值也等于两浓度之比值 即即即即 A AU U/A AS S=C=CU U/C/CS S ，C CU U=A AU UA AS S C CS S分光光度法的应用分光光度法的应用vv 用标准曲线法求出待测溶液的浓度用标准曲线法求出待测溶液的浓度 先配制一系列已知浓度的测定物溶液，分别测先配制一系列已知浓度的测定物溶液，分别测先配制一系列已知浓度的测定物溶液，分别测先配制一系列已知浓度的测定物溶液，分别测得各管的吸光度。以各管吸光度为纵坐标，测定物得各管的吸光度。以各管吸光度为纵坐标，测定物得各管的吸光度。以各管吸光度为纵坐标，测定物得各管的吸光度。以各管吸光度为纵坐标，测定物含量为横坐标；在方格坐标纸上作图即得标准曲线含量为横坐标；在方格坐标纸上作图即得标准曲线含量为横坐标；在方格坐标纸上作图即得标准曲线含量为横坐标；在方格坐标纸上作图即得标准曲线图。图。图。图。吸光度吸光度吸光度吸光度A A蛋白质浓度蛋白质浓度蛋白质浓度蛋白质浓度C C（g/mlg/ml）0.20.20.40.40.60.6.40408080120120160160分光光度法分光光度法vv分光光度法分光光度法分光光度法分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。质或测定其含量的一项技术。质或测定其含量的一项技术。质或测定其含量的一项技术。vv特点：分光光度法灵敏度较高、精确度高、操作简特点：分光光度法灵敏度较高、精确度高、操作简特点：分光光度法灵敏度较高、精确度高、操作简特点：分光光度法灵敏度较高、精确度高、操作简便、快速。便、快速。便、快速。便、快速。vv分光光度法所使用的光谱范围主要是波谱图中分光光度法所使用的光谱范围主要是波谱图中分光光度法所使用的光谱范围主要是波谱图中分光光度法所使用的光谱范围主要是波谱图中2002001000nm1000nm为一段波长的光谱。为一段波长的光谱。为一段波长的光谱。为一段波长的光谱。紫外光区紫外光区紫外光区紫外光区200200400nm400nm 可见光区可见光区可见光区可见光区400400760nm760nm 红外光区红外光区红外光区红外光区7607601000nm1000nm分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构光源光源单色色光器光器吸收池吸收池测光光机机构构钨丝灯灯氢灯灯氘灯灯棱棱镜衍射光衍射光栅玻璃比色杯玻璃比色杯石英比色杯石英比色杯硒硒光光电池池光光电管管光光电倍增管倍增管 将光能转将光能转将光能转将光能转变为电能，光变为电能，光变为电能，光变为电能，光电流的强弱与电流的强弱与电流的强弱与电流的强弱与溶液的吸光量溶液的吸光量溶液的吸光量溶液的吸光量强弱有关。强弱有关。强弱有关。强弱有关。分光光度计使用的注意事项分光光度计使用的注意事项vv试管架或试剂瓶不得放置于仪器上，以防试剂溅出试管架或试剂瓶不得放置于仪器上，以防试剂溅出试管架或试剂瓶不得放置于仪器上，以防试剂溅出试管架或试剂瓶不得放置于仪器上，以防试剂溅出腐蚀机壳。腐蚀机壳。腐蚀机壳。腐蚀机壳。vv拉杆动作要轻，防溶液溅出，腐蚀机件。拉杆动作要轻，防溶液溅出，腐蚀机件。拉杆动作要轻，防溶液溅出，腐蚀机件。拉杆动作要轻，防溶液溅出，腐蚀机件。vv比色杯应与分光光度计相配对，禁止随意挪用。比色杯应与分光光度计相配对，禁止随意挪用。比色杯应与分光光度计相配对，禁止随意挪用。比色杯应与分光光度计相配对，禁止随意挪用。vv比色杯应持其侧壁的比色杯应持其侧壁的比色杯应持其侧壁的比色杯应持其侧壁的毛玻璃面毛玻璃面毛玻璃面毛玻璃面。vv盛液时不能太满（约达比色杯盛液时不能太满（约达比色杯盛液时不能太满（约达比色杯盛液时不能太满（约达比色杯2/32/32/32/3体积），外壁如有体积），外壁如有体积），外壁如有体积），外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。vv测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后方可倒掉。后方可倒掉。后方可倒掉。后方可倒掉。原原 理理v大多数蛋白质都含有色氨酸大多数蛋白质都含有色氨酸(Trp)、酪氨酸、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸和苯丙氨酸(Phe)。这些氨基酸有苯环。这些氨基酸有苯环共轭双键，在紫外光区共轭双键，在紫外光区280nm显示最大光显示最大光吸收，且吸光度与浓度成正比。吸收，且吸光度与浓度成正比。蛋白质定量蛋白质定量紫外分光光度法紫外分光光度法试剂配制表（试剂配制表（ml）试试管管012345标标准蛋白准蛋白质质溶液溶液（1mg/ml）0.51.52.54.01.0（待）（待）蒸蒸馏馏水水4.03.52.51.53.0浓浓度度00.1250.3750.6251A280蛋白质定量蛋白质定量紫外分光光度法紫外分光光度法1.标准管法（标准管法（以第三管为标准管以第三管为标准管）蛋白质定量蛋白质定量紫外分光光度法紫外分光光度法结果处理结果处理A测测A标标 C标标4（稀释倍数）（稀释倍数）C测测=2.标准曲线法标准曲线法 以标准管以标准管浓度为横坐标浓度为横坐标，标准管，标准管吸光度为纵坐标吸光度为纵坐标，在在坐标纸坐标纸上绘制标准曲线。根据待测管的吸光度，上绘制标准曲线。根据待测管的吸光度，从标准曲线上从标准曲线上查出待测溶液的浓度查出待测溶液的浓度并乘以并乘以稀释倍数稀释倍数。