实验1-大肠杆菌的培养与分离.ppt

生物技术概述生物技术概述生物技术生物技术也叫生物工程也叫生物工程,是应用自然科学及工程学是应用自然科学及工程学的原理的原理,以微生物、动物、植物作为反应器以微生物、动物、植物作为反应器,将物将物料进行加工料进行加工,以提供产品为社会服务的技术。以提供产品为社会服务的技术。例如：以酵母为反应器制酒、以醋杆菌为反应器制醋、以例如：以酵母为反应器制酒、以醋杆菌为反应器制醋、以转基因的大肠杆菌为反应器生产生长激素、以羊为反应器转基因的大肠杆菌为反应器生产生长激素、以羊为反应器生产人乳。生产人乳。实验实验1-大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离n1、传统生物技术、传统生物技术n如酿酒、制作酸奶、污水处理、垃圾处理如酿酒、制作酸奶、污水处理、垃圾处理实验实验1-大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离利用大肠杆菌生产胰岛素、生长激素、促红细利用大肠杆菌生产胰岛素、生长激素、促红细胞生成素等药品。胞生成素等药品。实验实验1-大肠杆菌的培大肠杆菌的培养与分离养与分离细胞工程、细胞工程、发酵工程、发酵工程、酶工程、酶工程、蛋白质工程、蛋白质工程、基因工程基因工程n基因工程：剔除或改变有害基因，引入正确基基因工程：剔除或改变有害基因，引入正确基因或有利基因。因或有利基因。第一部分第一部分:微生物的微生物的应用应用特点：特点：结构都相当结构都相当简单简单,个体多数十分个体多数十分微小微小.通常要用通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构胞结构.微生物微生物病毒病毒细菌细菌放线菌放线菌真菌真菌原生动物原生动物 原核生物原核生物 原生生物原生生物真菌真菌实验实验1-大肠杆菌的培大肠杆菌的培养与分离养与分离：是一切肉眼看不见或看不清：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称楚的微小生物的总称(二二)细菌的常识细菌的常识1、结构、结构2、分裂、分裂3、生殖、生殖4、在基因工程中的、在基因工程中的应用应用大肠杆菌大肠杆菌实验实验1-大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌属于杆状菌大肠杆菌属于杆状菌图图1-1常见的三种细菌典型形态常见的三种细菌典型形态A.球菌球菌B.杆菌杆菌C.螺旋菌螺旋菌n根据细菌所利用的根据细菌所利用的能源和碳源能源和碳源的不同的不同将细菌分为两大营养类型。将细菌分为两大营养类型。n自养菌自养菌:n异养菌异养菌:实验实验1-大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离光能自养型光能自养型:光合细菌光合细菌化能自养型化能自养型:硝化细菌硝化细菌,铁细菌铁细菌,硫细菌硫细菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌n单个或少数细菌在单个或少数细菌在固体培养基固体培养基上大量繁殖上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的形态结构的子细胞群体子细胞群体，叫做菌落，叫做菌落。n菌落的形态是菌落的形态是鉴定菌种鉴定菌种的重要依据。的重要依据。菌落菌落细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色 革兰氏染色法是一种用于细菌的染色革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的两种菌的差别在于细胞壁的成分不同差别在于细胞壁的成分不同。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌大肠杆菌属于革兰氏阴性菌培养基培养基培养基（培养液）是培养基（培养液）是由人工方法配制由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养合营养液。液。1.1.培养基的类型培养基的类型(三三)细菌的培养细菌的培养成分区别：有无琼脂成分区别：有无琼脂液体培养基：液体培养基：扩增细菌（培养）扩增细菌（培养），工业生产，工业生产固体培养基：固体培养基：纯化（分离），纯化（分离），鉴定、保藏菌种鉴定、保藏菌种2.2.不同的微生物往往需要采用不同的不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方培养基配方 3.3.不管哪种培养基，基本成分都是相同不管哪种培养基，基本成分都是相同的。一般都含有的。一般都含有水水、碳源碳源、和、和氮源氮源、无无机盐机盐、生长因子生长因子等等营养物质，另外还需营养物质，另外还需要满足微生物生长对要满足微生物生长对pH pH、氧气氧气、渗透渗透压压的要求的要求细菌喜荤，霉菌喜素细菌喜荤，霉菌喜素大肠杆菌培养基大肠杆菌培养基LB培养基培养基配方：配方：酵母提取物酵母提取物0.25g蛋白胨蛋白胨0.5gNacl0.5g琼脂琼脂1g水水:50ml无菌技术无菌技术1.1.无菌技术的概念无菌技术的概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。所有防止杂菌污染的方法。是成功地培养微生物的关键。是成功地培养微生物的关键。（）（）消毒定义：消毒定义：2.2.消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别（2 2）灭菌的定义：）灭菌的定义：是指杀灭病原微生物的方法。如乙醇消毒是指杀灭病原微生物的方法。如乙醇消毒是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞芽胞、孢子孢子）的方法。的方法。灭菌的方法：灭菌的方法：3.3.常用的消毒与灭菌的方法常用的消毒与灭菌的方法1 1、灼烧灭菌、灼烧灭菌2 2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 160-170 下加热下加热1-2h1-2h。3 3、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa100kPa、121 121 下下维持维持15-30min.15-30min.高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。实验实验1-大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离1.进行进行大肠杆菌的大肠杆菌的扩增扩增，利用，利用液体培养基液体培养基进行细菌培养的操作进行细菌培养的操作2.进行进行大肠杆菌的大肠杆菌的分离分离，用，用固体平板培养固体平板培养基进行细菌的划线培养基进行细菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理原理实验目的实验目的设备及用品：见课本设备及用品：见课本21页页二、大肠杆菌的培养和分离实验操作二、大肠杆菌的培养和分离实验操作（一）培养基的配置与灭菌（一）培养基的配置与灭菌取取2个个250ml的三角瓶中分别装入的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养液体培养基和基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体液体培养基培养基细菌的扩大培养细菌的扩大培养LB固体固体培养基培养基细菌的分离和保藏细菌的分离和保藏封口膜：既通气封口膜：既通气又不使菌进入又不使菌进入（二）倒平板（二）倒平板灭菌后的培养基在灭菌后的培养基在无菌操作台无菌操作台上倒入上倒入4个培养皿中，倒后个培养皿中，倒后立即置于立即置于水平水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。待凝，使之形成平面。注意事项：注意事项：1、培养基灭菌后，需要冷却到、培养基灭菌后，需要冷却到60左右时，才能用左右时，才能用来倒平板。来倒平板。2、灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭、灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒。菌；桌面及人手用酒精棉球消毒。3、操作时右手无名指和小指、操作时右手无名指和小指夹住封口膜夹住封口膜,另外三指持另外三指持三角瓶三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边左手拿培养皿并打开上盖的一边,在在酒酒精灯火精灯火焰旁焰旁操作操作.4、需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，、需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌。灼烧灭菌。5、平板冷凝后，要将、平板冷凝后，要将平板倒置平板倒置，既可以使培养基表面，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。养基，造成污染。（三）大肠杆菌的扩大培养（三）大肠杆菌的扩大培养将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体灭菌后的液体培养基培养基中中,使其在使其在37摇床培养摇床培养12小时。小时。注意事项注意事项:1、火焰旁火焰旁从斜面上用接种环取菌从斜面上用接种环取菌;2、取菌前、取菌前接种环接种环要用酒精灯要用酒精灯灼烧灼烧灭菌，冷却后方能取菌灭菌，冷却后方能取菌;3、取菌后封口膜和棉塞复原、取菌后封口膜和棉塞复原.（四四）大肠杆菌的划线分离）大肠杆菌的划线分离分离方法分离方法:划线分离法和涂布分离法划线分离法和涂布分离法平板划线的操作平板划线的操作1、划线分离法：、划线分离法：无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的平板上连续划线的平板上连续划线.不能使用脱不能使用脱脂棉，否则脂棉，否则容易吸水，容易吸水，造成污染。造成污染。一旦划破，会造成划线不均匀，难一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。分离后分离后,一个菌体一个菌体便会形成一个菌落便会形成一个菌落,这是这是消除污染杂消除污染杂菌的通用方法菌的通用方法,也也是用于是用于筛选高表达筛选高表达量菌株量菌株的最简便方的最简便方法之一。法之一。（四四）大肠杆菌的划线分离）大肠杆菌的划线分离注意事项注意事项:1、接种环、接种环只蘸一次菌液只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置，但要在培养基不同位置连连续划线多次续划线多次。2、划线、划线首尾不能相接。首尾不能相接。3、划线后，培养皿、划线后，培养皿倒置培养倒置培养1224h。1、划线分离法、划线分离法 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环每次划线前灼烧接种环是为了是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，划线结束后灼烧接种环，能及时能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。感染操作者。2 2、在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却、在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3 3、在作第二次以及其后的划线操作时，、在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：答：划线后，线条末端细菌的数目比线条划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2、涂布分离法、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量然后取一定量稀释液加在固体培养基上稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。单菌落更易分开，但操作复杂。（五五）大肠杆菌分离后保存）大肠杆菌分离后保存1 1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于后置于44冰箱保存。冰箱保存。2 2、长期保存：甘油冷冻管藏法。、长期保存：甘油冷冻管藏法。1、如何操作才可以尽量避免被杂菌污染、如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?(1)(1)胆大心细，操作快捷。胆大心细，操作快捷。（2 2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。污染概率。（3 3）注意微生物生长条件，如）注意微生物生长条件，如PHPH、渗透压、温、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜3737C C；霉菌喜；霉菌喜酸，喜糖，喜酸，喜糖，喜25-3025-30C C。课后习题：课后习题：2、在培养后如何判断是否有杂菌污染、在培养后如何判断是否有杂菌污染?（1）菌落的形态菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小。显微镜观察其形态、大小。看是否有菌丝、孢子看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法革兰氏染色法等。等。3、进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置、进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。的。4、实验完成后，接种过细菌的器皿应如何处理、实验完成后，接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。弃物也要高压灭菌后再抛弃。5、如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保证不被普通、如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保证不被普通的大肠杆菌所污染的大肠杆菌所污染?转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的过改造的，通常加入了抗性基因的DNADNA序列，序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。行培养。【课堂练习课堂练习】例例1 1关微生物营养物质的叙述中，正确的是（关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A.A.是碳源的物质不可能同时是氮源是碳源的物质不可能同时是氮源 B.B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量 C.C.除水以外的无机物只提供无机盐除水以外的无机物只提供无机盐 D.D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量D例例2 2下面对发酵工程中灭菌的理解下面对发酵工程中灭菌的理解不正确不正确不正确不正确的是的是（）A.A.防止杂菌污染防止杂菌污染 B.B.接种前菌种要进行灭菌接种前菌种要进行灭菌C.C.培养基和发酵设备都必须灭菌培养基和发酵设备都必须灭菌 D.D.灭菌必须在接种前灭菌必须在接种前B编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gH H2 2OO100ml100ml例例3 3右表是某微生物培右表是某微生物培养基成分，请据此回答：养基成分，请据此回答：（1 1）右表培养基可培养）右表培养基可培养的微生物类型是的微生物类型是 。自养型微生物自养型微生物（2）若除去成分）若除去成分，加入（加入（CH2O），该培），该培养基可用于培养养基可用于培养。（3）表中营养成分共）表中营养成分共有有类。类。固氮微生物固氮微生物3（4 4）不论何种培养基，在各种成分都）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是溶化后分装前，要进行的是 。（5 5）右表中各成分重量确定的原则是）右表中各成分重量确定的原则是 。（6 6）若右表培养基用于菌种鉴定，应）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分该增加的成分 。调整调整pHpH依微生物的生长需要确定依微生物的生长需要确定琼脂（或凝固剂）琼脂（或凝固剂）实验实验1-大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离n超净工作台超净工作台