实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质.ppt

实验二实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质(1)学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。实验原理实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带的净电荷的多少、分子的大小和形状等因素。如果用过量的还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇等）和十二烷基硫酸钠（缩写SDS）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，蛋白质-SDS复合物具有相同的电荷密度，并引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率不再受原带的电荷和形状的影响，而取决于相对分子质量的大小，电泳时纯粹靠凝胶的分子筛效应进行分离。n Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。n 化学法化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。n 采用不同浓度的Acr、Bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。n这次实验是利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大肠杆菌全蛋白。nSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行；包括浓缩胶（积层胶）和分离胶。材料与试剂材料与试剂n1材料：n标准样BSA（小牛血清白蛋白）,已经与上样缓冲液混合完毕n2试剂n1）30%(Acr)/0.8%N,N-甲叉双丙烯酰胺（BIS）n2）5SDS电泳缓冲液,稀释成1n3）Tris-HCl/SDS,浓缩胶pH 6.8n4）Tris-HCl/SDS,分离胶pH 8.8n5）10%过硫酸铵(AP)n6）TEMED 商品试剂实验步骤实验步骤n1装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。2制分离胶：按所需的浓度配制12.5分离胶分离胶。TEMED最后加，快速混匀后用移液枪灌胶，由固定位置灌入，注意不能有气泡；灌完分离胶后在胶面上小心加1毫升水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）30%Acr-Bis Tris-HCl pH 8.8 H2O10%APTEMED5ml3ml4ml120 l20 ln3制浓缩胶浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶浓缩胶，配方如下：30%Arc-Bis Tris-HCl pH 6.8 H2O10%APTEMED400ul750ul1800ul50ul7.5ul 4.4.灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。理。n5加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样7.5L。n6电泳：先恒压80V，待样品进入分离胶后，调电压为120V（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，停止电泳。7翘开玻璃板，将浓缩胶切掉,剥下凝胶，准备染 色。8 凝胶染色：使用考马斯亮蓝R250染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约15-20秒，摇床振荡15分钟，回收染液至指定容器回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（25%乙醇，7.5%乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，每次10分钟。注意事项注意事项 (1)Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩。(2)玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。(3)样品槽模板梳齿应平整光滑。(4)灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。(5)切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。(6)电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。(7)稀释5SDS/电泳缓冲液至1浓度灌入电泳槽，需800毫升。移液枪的使用方法移液枪的使用方法移液器量程的调节使用干净的枪头移液器的使用手法，两档位吸液吸液放液放液去去枪枪头头的的方方法法1.将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。2.在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。3.将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内灌胶，放上梳子，待胶凝固。4.取出制好的玻璃（连带胶），将玻璃放入电极架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向电极架，厚玻璃的箭头朝上，玻璃与红色橡胶条必须完全紧贴。（需同时放置两块制好的胶，如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必须使塑料板与橡胶条完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容器。5.将底座的开关打开，并向外拨动透明的架子，使中间空隙增大，放入电极架。6.如图所示将电极架往下压（约12mm），使底面完全接触。7.关上底座开关。8.放入电泳槽内，加上加样架加样。注意加样架与刚才制胶所用的梳子齿数必须一致。