干细胞及其应用.pptx
干细胞及其应用高志买江苏银丰鼎城生物工程有限公司南京军区干细胞库2ScienceScience于于19991999年和年和20002000年年连续两次两次将干将干细胞技胞技术评为世界十大科学成就之一世界十大科学成就之一干细胞技术是医学发展的未来3干细胞技术是医学发展的未来干细胞基本知识干细胞基本知识干细胞分类来源及功能干细胞分类来源及功能干细胞(stem cells,SC)是指一类具有自我复制能力(self-renewing)和分化（differentiating）潜能的细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。定义：定义：恩尼斯特恩尼斯特莫科洛克莫科洛克和和詹姆士詹姆士堤尔堤尔脾脏来源细胞集落形成的发现开启了脾脏来源细胞集落形成的发现开启了干细胞研究的大门干细胞研究的大门1、BECKERAJ,McCULLOCHEA,TILLJE.Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells。Nature.1963Feb2;197:452-4.2、SIMINOVITCHL,MCCULLOCHEA,TILLJE.THE DISTRIBUTION OF COLONY-FORMING CELLS AMONG SPLEEN COLONIES.JCellPhysiol.1963Dec;62:327-36.胚胎干细胞胚胎干细胞根据发育过程分类根据发育过程分类人人 类类5 6天天 的的胚胚 胎胎干干 细细胞胞成体干细胞成体干细胞根据功能性分类根据功能性分类全能干细胞多功能干细胞单功能干细胞成肌细胞造血干细胞胚胎干细胞用于临床的干细胞来源用于临床的干细胞来源1自体外周血2自体骨髓3 胎盘及其附属物（脐带、脐血）4 脂肪、牙周组织9 目前细胞治疗常用的细胞种类一：骨髓一：骨髓总有核有核细胞（胞（NCNC）从自体骨髓从自体骨髓获得，去除大部分得，去除大部分红细胞，剩胞，剩下的下的全部有核全部有核细胞胞。其中富含各系血其中富含各系血细胞、造血干胞、造血干细胞、造血胞、造血各系祖各系祖细胞、血管内皮祖胞、血管内皮祖细胞和内皮胞和内皮细胞胞。910目前细胞治疗常用的细胞种类二：二：单个核个核细胞（胞（MNCMNC）从自体骨髓或异体从自体骨髓或异体脐血中血中获得，去除得，去除绝大部分大部分红细胞、血小板、巨核胞、血小板、巨核细胞和多核胞和多核细胞，剩下的胞，剩下的单个核个核细胞。胞。其中富含胚胎其中富含胚胎样多能干多能干细胞、造血干胞、造血干细胞、造胞、造血各系祖血各系祖细胞和血管内皮祖胞和血管内皮祖细胞。胞。1011目前细胞治疗常用的细胞种类三：三：CD34+CD34+细胞胞 （HSC&EPCHSC&EPC）从骨髓或从骨髓或脐血血单个核个核细胞中胞中经免疫磁珠法分免疫磁珠法分选的表达的表达CD34CD34糖蛋白的糖蛋白的细胞。胞。其中造血干其中造血干细胞和血管内皮祖胞和血管内皮祖细胞的胞的纯度极高，度极高，对实验室人室人员操作要求操作要求较高。高。1112目前细胞治疗常用的细胞种类四：四：间充充质干干细胞（胞（MSCMSC）首先分离骨髓、首先分离骨髓、脐带或脂肪或脂肪组织的的单个核个核细胞，胞，经过培养培养获得得贴壁壁细胞群，呈梭形，体型胞群，呈梭形，体型较大，能分大，能分化化为多种多种细胞。胞。其中富含其中富含间质干干细胞、成胞、成纤维细胞、巨噬胞、巨噬细胞、胞、树突状突状细胞和内皮胞和内皮细胞。胞。还残留少量残留少量单个核个核细胞。胞。对实验室操作人室操作人员要求要求较高。高。起源于中胚层，存在于骨髓、脐带、脐血、脂肪、乳牙起源于中胚层，存在于骨髓、脐带、脐血、脂肪、乳牙组织、胎盘等，具备干细胞的自我复制和多向分化性，组织、胎盘等，具备干细胞的自我复制和多向分化性，在发育的不同阶段和特定环境条件下，能分化为多种间在发育的不同阶段和特定环境条件下，能分化为多种间质起源的组织。质起源的组织。间充质干细胞间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）国国际际细细胞胞疗疗法法间间充充质质与与组组织织干干细细胞胞委委员员会会(t th he e MMe es se en nc ch hy ymma al l a an nd d T Ti is ss su ue e S St te emm C Ce el ll l C Co ommmmi it tt te ee e o of f t th he e I In nt te er rn na at ti io on n2 2 a al l S So oc ci ie et ty y f fo or r C Ce el ll lu ul la ar r T Th he er ra ap py y)制制定定的的最最低低标标准准：形态：在标准培养条件下呈贴壁生长细胞表型：表达CD105,CD73和CD90,不表达CD45,CD34,CD14或CD11b,CD79a或CD19和HLA2DR;分化功能：在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。15FACS检测干细胞的免疫表型16MSC来源来源取材操作取材操作细胞含量细胞含量增殖分化能力增殖分化能力免疫原免疫原性性伦理争议伦理争议骨髓有创，痛苦较低较低，受年龄影响较高存在脂肪有创较高较强，受年龄影响较高存在脐血无创极低较强，无年龄影响低无脐带组织无创丰富较强，无年龄影响低无不同来源不同来源MSC生物特性比较生物特性比较18自体骨髓 MSC 的优点1.1.取自自身，不受取自自身，不受伦理、道德及法律方面的限制；理、道德及法律方面的限制；2.2.无无HLAHLA限制，无限制，无GVHDGVHD和和HVGDHVGD；3.3.可多向分化，在神可多向分化，在神经、心肌等、心肌等细胞治胞治疗方面具有广方面具有广阔的的临床前景。床前景。4.4.可可调节免疫反免疫反应，适宜于自身免疫病的，适宜于自身免疫病的调节。自体骨髓 MSC 的缺点1.过程痛苦；2.老人和某些患者（如运动神经元病）无法扩增培养；3.生长慢。19脐带 MSC 的优点1.1.取材方便，易于收集、保存和冷取材方便，易于收集、保存和冷冻。2.2.不受不受伦理、道德及法律方面的限制。理、道德及法律方面的限制。3.3.由于胎血屏障，没有病毒由于胎血屏障，没有病毒污染，使其在神染，使其在神经、心肌等、心肌等细胞治胞治疗方面具有广方面具有广阔的的临床前景。床前景。4.4.人人脐带MSCsMSCs含量丰富，含量丰富，较为原始，分化能力原始，分化能力强，可在，可在体外体外进行分离、培养，行分离、培养，扩增迅速，且生物性能增迅速，且生物性能稳定，定，多次多次传代代扩增仍能保持旺盛功能，可以增仍能保持旺盛功能，可以为临床提供充床提供充足的足的细胞来源。胞来源。5.5.人人脐带MSCsMSCs不表达或低表达免疫排斥相关不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫，免疫原性低，是一原性低，是一类免疫缺陷免疫缺陷细胞，不胞，不须经过严格配格配对使使用，异体移植无免疫排斥反用，异体移植无免疫排斥反应或反或反物物较弱弱，适宜于不，适宜于不同个体之同个体之间的移植，是的移植，是细胞治胞治疗的理想的工具的理想的工具细胞胞。20自体骨髓 MSC 的优点1.1.取自自身，不受取自自身，不受伦理、道德及法律方面的限制；理、道德及法律方面的限制；2.2.无无HLAHLA限制，无限制，无GVHDGVHD和和HVGDHVGD；3.3.可多向分化，在神可多向分化，在神经、心肌等、心肌等细胞治胞治疗方面具有广方面具有广阔的的临床前景。床前景。4.4.可可调节免疫反免疫反应，适宜于自身免疫病的，适宜于自身免疫病的调节。自体骨髓 MSC 的缺点1.过程痛苦；2.老人和某些患者（如运动神经元病）无法扩增培养；3.在某些疾病中使用自身MSC可能会加重（如肝硬化）；4.生长慢。21脐带 MSC 的优点1.1.取材方便，易于收集、保存和冷取材方便，易于收集、保存和冷冻。2.2.不受不受伦理、道德及法律方面的限制。理、道德及法律方面的限制。3.3.由于胎血屏障，没有病毒由于胎血屏障，没有病毒污染，使其在神染，使其在神经、心肌等、心肌等细胞治胞治疗方面具有广方面具有广阔的的临床前景。床前景。4.4.人人脐带MSCsMSCs含量丰富，含量丰富，较为原始，分化能力原始，分化能力强，可在，可在体外体外进行分离、培养，行分离、培养，扩增迅速，且生物性能增迅速，且生物性能稳定，定，多次多次传代代扩增仍能保持旺盛功能，可以增仍能保持旺盛功能，可以为临床提供充床提供充足的足的细胞来源。胞来源。5.5.人人脐带MSCsMSCs不表达或低表达免疫排斥相关不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫，免疫原性低，是一原性低，是一类免疫缺陷免疫缺陷细胞，不胞，不须经过严格配格配对使使用，异体移植无免疫排斥反用，异体移植无免疫排斥反应或反物或反物应较弱，适宜于弱，适宜于不同个体之不同个体之间的移植，是的移植，是细胞治胞治疗的理想的工具的理想的工具细胞胞。HUMSC制备方法制备方法脐带组织结构：脐带组织结构：脐带由两条动脉、一条静脐带由两条动脉、一条静脉、粘液结缔组织（华通脉、粘液结缔组织（华通胶，胶，Whartons Jelly）及）及羊膜上皮组织羊膜上皮组织构成。构成。脐带血管内皮及内皮下、脐带血管内皮及内皮下、羊膜上皮组织也能培养出羊膜上皮组织也能培养出MSCMSC样细胞，但细胞表型、样细胞，但细胞表型、分化功能不够完整。分化功能不够完整。华通华通胶成为胶成为HUMSCHUMSC的主要来源部的主要来源部分。分。H HU UM MS SC C制制备备流流程程HUMSC制备方法制备方法母血病毒检测洗涤分离华通胶组织贴壁培养传代培养种子冻存细胞复苏传代扩增微生物，支/衣原体、内毒素检测微生物检测，支/衣原体、内毒素检测收获灌装脐带采集MSC临床治疗机制临床治疗机制l替代和修复死亡和受损伤的细胞l激活休眠和处于抑制状态的细胞l旁分泌作用（分泌趋化因子、神经营养因子、抗凋亡因子等）l免疫调控机制（诱导免疫耐受和免疫调节）l促进细胞间电能力、电传导的恢复（分泌连接蛋白帮助细胞间连接、促进离子通道的开放等）MSC的适应症自身免疫性疾病自身免疫性疾病神经系统疾病神经系统疾病消化系统疾病消化系统疾病骨骼及运动系统骨骼及运动系统疾病疾病系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化病共济失调、帕金森、脊髓损伤、脑萎缩、老年痴呆、运动神经元病、多发性硬化、脑中风、脑瘫肝硬化、溃疡性结肠炎、克隆氏病股骨头缺血性坏死、关节软骨病变、骨折不愈合及延迟愈合心脑血管疾病心脑血管疾病呼吸系统疾病呼吸系统疾病泌尿系统疾病泌尿系统疾病内分泌系统疾病内分泌系统疾病心肌梗塞、脑梗塞、冠心病、缺血缺氧性脑病肺动脉高压、肺纤维化慢性肾小球炎、肾病综合征、高血压肾病、糖尿病肾病及所致的急慢性肾衰竭糖尿病、下肢血管性疾病、糖尿病足眼科疾病眼科疾病美容美容亚健康亚健康视神经萎缩、黄斑病变供者MSC联合HSC移植明显降低了GVHD的发生率临床结果MSC n=10Non-MSCn=15急性GVHDGrade II-IV11.1%(1/9)53.3%(8/15)慢性GVHD14.3%(1/7)28.6%(4/14)军事医学科学院307医院血液科陈虎主任医院血液科陈虎主任Leukemia.2008；22：593-599.（IF 8.6)（同期刊发表两篇专家述（同期刊发表两篇专家述评）评）Leukemia.2009；23：179-180.（IF 8.6)髓芯减压联合干细胞治疗股骨头坏死Indian J Orthop.2009 Jan-Mar;43(1):4045.干细胞治疗骨不连干细胞治疗卵巢早衰PLoS ONE 7(3):e32462.doi:10.1371Development of the ovary in BMT animal(A)compared to untreated control animal(B).脂肪来源MSC在丰胸上的应用o人数：40o平均输入脂肪体积270mlo平均乳房增大100-200mlo2个月后未见明显的萎缩o几乎所有人都对柔软且外观自然的丰胸效果表示满意Preoperative(top)and postoperative(bottom)views at 24 months.A 30-year-old woman underwent breast augmentation with cell-assisted lipotransfer(CAL)(310 ml in each breast).Her breasts were dramatically augmented with an increase in breast circumference difference by 8 cm at 24 months.The breast mounds were soft with no subcutaneous indurations.Radiologic views of patient 3.(A)A preoperative computed tomography(CT)image in the horizontal plane at the level of the nipples.Only a very thin fatty layer is observed around the mammary glands.(B)A horizontal magnetic resonance image(MRI)(T1 weighted)24 months after surgery.Transplanted adipose tissues survived and formed thick layers around and under the mammary glands.(C)Mammograms 24 months after surgery show no abnormal signs脂肪来源MSC的抗皱效果Evaluation of wrinkles by replica analysis after ADSC injection.Control(A),1*103 cells(B),1*104 cells(C),and 1*105 cells(D).Representative clinical photography of fractional carbon dioxide laser-treated sites.The ADSC-CM-treated side shows less erythema and hyperpigmentation.FxCR 8 mJ with ADSC-CM(T1),FxCR 8 mJ with DMEM medium(C1),FxCR 16 mJ with ADSC-CM(T2),and FxCR 16 mJ with DMEM medium(C2).干细胞条件培养液的抗辐射损伤作用干细胞抗衰老衰老的本质o在生理上，衰老是人的诞生，即受精卵的形成开始一直进行到老年死亡的个体发育史。o人体衰老所表现的组织器官结构退行性变化和机能降低，其本质是细胞衰减，而细胞的衰减又主要由干细胞衰减所致。o从临床医学的角度看，干细胞疗法可能很好的改变许多疾病的治疗方法，特别是通过组织和器官替代和修复治疗许多难治性疾病。Nature Communications 3,608 doi:10.1038/ncomms1611,3 January 2012谢谢欢迎批评指正
