重组及重组技术精选课件.ppt

目录目录关于重组及重组技术第一页，本课件共有93页目录目录nDNA重重组组（DNA recombination）是是指指不不同同DNA分分子子断断裂裂和和连连接接而而产产生生DNA片片段段的交换并重新组合形成新的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。分子的过程。n重重 组组 DNA技技 术术（recombinant DNA technology）是是指指在在体体外外将将两两个个或或两两个个以以上上DNA分分子子重重新新组组合合并并在在适适当当细细胞胞中中增增殖殖形成新形成新DNA分子的过程。分子的过程。第二页，本课件共有93页目录目录第一节第一节自然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移DNA Recombination and Gene Transfer in Nature第三页，本课件共有93页目录目录DNA重组重组同源重组同源重组(homologous recombination)位点特异性重组位点特异性重组(site-specific recombination)转座重组转座重组(transposition recombination)接合作用接合作用(conjugation)转化作用转化作用(transformation)转导作用转导作用(transduction)第四页，本课件共有93页目录目录n发发 生生 在在 同同 源源 序序 列列 间间 的的 重重 组组 称称 为为同同 源源 重重 组组(homologous recombination)，又又称称基基本本重重组组（general recombination）。是是最最基基本本的的DNA重重组组方方式式，通通过过链链的的断断裂裂和和再再连连接接，在在两两个个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。n以以E.coli的的同同源源重重组组为为例例，了了解解同同源源重重组组机机制制的的Holliday模型。模型。一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式第五页，本课件共有93页目录目录nHolliday模型的模型的4个关键步骤：个关键步骤：两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐；排列整齐；片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant)n一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对对应的链连接，形成应的链连接，形成Holliday中间体；中间体；n通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA；nHolliday中间体切开并修复，形成两个双链重组中间体切开并修复，形成两个双链重组体体DNA，分别为：，分别为：第六页，本课件共有93页目录目录n片段重组体片段重组体（见模型图右边产物）：（见模型图右边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。n拼接重组体拼接重组体（见模型图左边产物）：（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本的两侧来自不同亲本DNA。第七页，本课件共有93页目录目录n参参与与细细菌菌DNA同同源源重重组组的的酶酶有有数数十十种种，其其中中最最关关键的是键的是RecA蛋白蛋白、RecBCD复合物复合物和和RuvC蛋白蛋白。nRecBCD复复合合物物具具有有三三种种酶酶活活性性，即即依依赖赖于于ATP的的核核酸酸外外切切酶酶活活性性、可可被被ATP增增强强的的核核酸酸内内切切酶酶活性以及需要活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。的解螺旋酶活性。nRecA蛋蛋白白可可结结合合单单链链DNA（ssDNA），形形成成RecA-ssDNA复合物。复合物。nRuvC有有内内切切酶酶活活性性，能能专专一一性性识识别别Holliday连连接接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。点，并有选择地切开同源重组体的中间体。第八页，本课件共有93页 内切酶内切酶(recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA)内切酶内切酶(recBCD)DNA 连接酶连接酶535353535353535353535353535333535335535353Holliday中间体中间体53535353第九页，本课件共有93页Holliday中间体中间体535353535535533335555333355553335555333355553333内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶拼拼接接重重组组体体片片段段重重组组体体第十页，本课件共有93页目录目录二、位点特异重组是发生在特异位点二、位点特异重组是发生在特异位点间的间的DNA整合整合n位点特异性重组位点特异性重组(site-specific recombination)是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点序列的特异位点间发生的整合。间发生的整合。第十一页，本课件共有93页目录目录噬噬菌菌体体的的整整合合酶酶识识别别噬噬菌菌体体和和宿宿主主染染色色体体的的特特异异靶靶位位点点发发生生选选择择性性整整合合；反反转转录录病病毒毒整整合合酶酶可可特特异异地地识识别别、整整合合反反转转录录病病毒毒cDNA的的长长末末端重复序列端重复序列(long terminal repeat,LTR)。（一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合第十二页，本课件共有93页目录目录（二）细菌的位点特异性重组（二）细菌的位点特异性重组沙门氏菌沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变第十三页，本课件共有93页目录目录nhix为为反反向向重重复复序序列列，它它们们之之间间的的H片片段段可可在在Hin控控制制下下进进行行特特异异位位点点重重组组(倒倒位位)。H片片段段上上有有两两个个启启动动子子P，其其一一驱驱动动hin基基因因表表达达，另另一一正正向向时时驱驱动动H2和和rH1基基因因表表达达，反反向向(倒倒位位)时时H2和和rH1不不表表达达。rH1为为H1的的阻阻遏蛋白基因。遏蛋白基因。第十四页，本课件共有93页目录目录 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重组酶重组酶转位片段转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA启动序列启动序列H1启动序列启动序列沙门氏菌沙门氏菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变第十五页，本课件共有93页目录目录（三）免疫球蛋白基因的重排（了解）（三）免疫球蛋白基因的重排（了解）n免免疫疫球球蛋蛋白白(Ig)，由由两两条条轻轻链链(L链链)和和两两条条重重链链(H链链)组组成成，分分别别由由三三个个独独立立的的基基因因族族编编码码，其其中中两个编码轻链两个编码轻链(和和)，一个编码重链。，一个编码重链。轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 第十六页，本课件共有93页目录目录n重重链链(IgH)基基因因的的V-D-J重重排排和和轻轻链链(IgL)基基因因的的V-J重重排排均均发发生生在在特特异异位位点点上上。在在V片片段段的的下下游游，J片片段段的的上上游游以以及及D片片段段的的两两侧侧均均存存在在保保守守的的重重组组信信号号序序列列(recombination signal sequence,RSS)。此此重重排排的的重重组组酶酶基基因因rag(recombination activating gene)共共有有两两个个，分分别产生蛋白质别产生蛋白质RAG1和和RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段第十七页，本课件共有93页目录目录免免疫疫球球蛋蛋白白基基因因重重排排过过程程第十八页，本课件共有93页目录目录三、转座重组三、转座重组可使基因移位可使基因移位n由由插插入入序序列列和和转转座座子子介介导导的的基基因因移移位位或或重重排称为排称为转座转座(transposition)。n大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。序列包括插入序列和转座子。第十九页，本课件共有93页目录目录n 插入序列插入序列(insertion sequences,IS)组成：组成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列转座（一）插入序列转座n二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats,IR)序列序列n特有的正向重复序列特有的正向重复序列n一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因第二十页，本课件共有93页目录目录n插入序列发生转座的形式：插入序列发生转座的形式：保守性转座保守性转座(conservative transposition)复制性转座复制性转座(duplicative transposition)第二十一页，本课件共有93页目录目录插插入入序序列列的的复复制制性性转转座座第二十二页，本课件共有93页目录目录n转座子转座子(transposons)可从一个染色体位可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposase Gene有用基因有用基因（二）转座子转座（二）转座子转座n转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因第二十三页，本课件共有93页目录目录 细菌的可流动性元件细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示箭头所示)B转座子转座子Tn3：含有转座酶、：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L第二十四页，本课件共有93页目录目录由转座子介导的转座由转座子介导的转座第二十五页，本课件共有93页目录目录四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组基因转移或重组（一）接合作用（一）接合作用 当当细细胞胞与与细细胞胞、或或细细菌菌通通过过菌菌毛毛相相互互接接触触时时，质质粒粒DNA从从一一个个细细胞胞（细细菌菌）转转移移至至另另一一细细 胞胞（细细 菌菌）的的DNA转转移移称称为为接接 合合 作作 用用(conjugation)。第二十六页，本课件共有93页目录目录n可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor)细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。分子。n质粒质粒第二十七页，本课件共有93页目录目录（二）转化作用（二）转化作用通通过过自自动动获获取取或或人人为为地地供供给给外外源源DNA，使使细细胞胞或或培培养养的的受受体体细细胞胞获获得得新新的的 遗遗 传传 表表 型型，称称 为为 转转 化化 作作 用用(transformation)。第二十八页，本课件共有93页目录目录例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。第二十九页，本课件共有93页目录目录（三）转导作用（三）转导作用当当病病毒毒从从被被感感染染的的（供供体体）细细胞胞释释放放出出来来、再再次次感感染染另另一一（受受体体）细细胞胞时时，发发生生在在供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移及及基基因因重重组组即即为为转转导作用导作用(transduction)。第三十页，本课件共有93页目录目录噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)第三十一页，本课件共有93页目录目录第二节第二节 重组重组DNA技术技术Recombinant DNA Technology第三十二页，本课件共有93页目录目录重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。分子。1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。第三十三页，本课件共有93页目录目录重组重组DNA技术相关概念技术相关概念n克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。的集合。n获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。DNA克隆克隆第三十四页，本课件共有93页目录目录n技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)（即（即DNA 克隆）克隆）细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）第三十五页，本课件共有93页目录目录其其主主要要过过程程包包括括：在在体体外外将将目目的的DNA片片段段与与能能自自主主复复制制的的遗遗传传元元件件（又又叫叫载载体体）连连接接，形形成成重重组组DNA分分子子，进进而而在在受受体体细细胞胞中中复复制制、扩扩增增，从而获得单一从而获得单一DNA分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。n重重组组DNA技技术术，又又称称分分子子克克隆隆（molecular cloning）或或DNA克克 隆隆（DNA cloning）或或 基基 因因 工工 程程（genetic engineering）技术）技术第三十六页，本课件共有93页目录目录n 目的：目的：分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）第三十七页，本课件共有93页目录目录一、重组一、重组DNADNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶第三十八页，本课件共有93页重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯羟基末端之间形成磷酸二酯键，使键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接；分子或片段连接；缺口平移制作高比活缺口平移制作高比活探针；探针；DNA序列分析；序列分析；填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA；替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基第三十九页，本课件共有93页目录目录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶(restriction endonuclease,RE)是是一一类类核核酸酸内内切切酶酶，能能识识别别双双链链DNA分分子子内内部部的特异序列，并裂解磷酸二酯键。的特异序列，并裂解磷酸二酯键。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam Hn定义：定义：第四十页，本课件共有93页目录目录与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系系统，限制外源统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）n分类：分类：n作用：作用：第四十一页，本课件共有93页目录目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。n命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶第四十二页，本课件共有93页目录目录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGATCCCCTAGG第四十三页，本课件共有93页目录目录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口黏端切口黏端切口第四十四页，本课件共有93页目录目录有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍伍末末端端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg l l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT An 同尾酶同尾酶第四十五页，本课件共有93页目录目录来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同同一一位点，这些酶称位点，这些酶称同裂酶或同功异源酶同裂酶或同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bstn同裂酶：同裂酶：第四十六页，本课件共有93页名称名称 识别识别序列及切割位点序列及切割位点名称名称识别识别序列及切割点序列及切割点切割后切割后产产生生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后切割后产产生生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后切割后产产生平末端生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶第四十七页，本课件共有93页目录目录 二、重组二、重组DNADNA技术中常用的载体技术中常用的载体n 定义定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。n 载体按功能分为载体按功能分为 克隆载体克隆载体(cloning vector)表达载体表达载体(expression vector)第四十八页，本课件共有93页目录目录n克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设设计的载体称为计的载体称为克隆载体克隆载体。n表达载体表达载体(expression vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多多肽链而特意设计的载体称为肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。第四十九页，本课件共有93页目录目录（一）克隆载体（一）克隆载体至至少少有有一一个个复复制制起起点点使使载载体体在在宿宿主主细细胞胞中中进进行行自自主主复复制制，并并能使克隆的外源能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增。片段得到同步扩增。至至少少有有一一个个选选择择标标志志（selection marker）：选选择择标标志志是是区区分分含含与与不不含含载载体体的的细细胞胞所所必必需需的的，包包括括抗抗生生素素抗抗性性基基因因、-半半乳糖苷酶基因（乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等。）、营养缺陷耐受基因等。有有适适宜宜的的RE的的单单一一切切点点：载载体体中中一一般般都都构构建建有有一一段段特特异异性性核核苷苷酸酸序序列列，在在这这段段序序列列中中包包含含了了多多个个RE的的单单一一切切点点，可可供供外外源源基基因因插插入入时时选选择择，叫叫多多克克隆隆位位点点（multiple cloning sites，MCS）。）。1.1.克隆载体应具备的基本特点克隆载体应具备的基本特点 第五十页，本课件共有93页目录目录（1 1）质粒）质粒(plasmid)特特点点:存存在在于于细细菌菌染染色色体体外外的的环环状状双双链链超超螺螺旋旋结结构构。能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制，带带有有某某些些遗遗传传信信息息，会会赋赋予予宿宿主细胞一些遗传性状。主细胞一些遗传性状。2.常用的克隆载体常用的克隆载体 第五十一页，本课件共有93页第五十二页，本课件共有93页pUC18质粒载体图谱质粒载体图谱 第五十三页，本课件共有93页目录目录n 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组系列（置换型，适用基因组DNA克隆）克隆）（2 2）噬菌体）噬菌体DNADNA(phage)n M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列第五十四页，本课件共有93页目录目录n柯斯质粒柯斯质粒（cosmid）载体（又称黏粒载体）载体（又称黏粒载体）n酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome,YAC)n 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome,BAC)n 动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（3）其他克隆载体）其他克隆载体第五十五页，本课件共有93页目录目录（二）表达载体（二）表达载体表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。因的载体。根据宿主细胞的不同分为：根据宿主细胞的不同分为：原核表达载体原核表达载体真核表达载体真核表达载体第五十六页，本课件共有93页目录目录1.1.原核表达载体原核表达载体 原核表达载体的基本组成原核表达载体的基本组成 R R：调节序列；：调节序列；P P：启动子；：启动子；SDSD：SDSD序列；序列；TTTT：转录终止序列：转录终止序列第五十七页，本课件共有93页目录目录2.2.真核表达载体真核表达载体 真核表达载体的基本组成真核表达载体的基本组成 OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点；TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。第五十八页，本课件共有93页目录目录n基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 三、三、重组重组DNADNA技术的基本原理及操作步骤技术的基本原理及操作步骤第五十九页，本课件共有93页 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程第六十页，本课件共有93页目录目录（一）（一）目的的分离目的的分离获获取取分分1.1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列物的氨基酸序列 。2.2.从基因组从基因组DNADNA文库和文库和cDNAcDNA文库中获取目的文库中获取目的DNA(DNA(见第见第2020章章)3.3.PCRPCR法法 (见第见第2020章章)4.4.其他方法其他方法 (见第见第2020章章)第六十一页，本课件共有93页目录目录化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。第六十二页，本课件共有93页组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合n从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因第六十三页，本课件共有93页限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 第六十四页，本课件共有93页mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制n 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T第六十五页，本课件共有93页目录目录（二）载体的选择与构建（二）载体的选择与构建选选目的不同，操作基因的性质不同，载体的目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。选择和改建方法也不同。n 目的：目的：获得某一目的基因或获得某一目的基因或DNA片段片段 获得目的获得目的DNA片段所编码的蛋白质片段所编码的蛋白质第六十六页，本课件共有93页目录目录载体载体插入插入DNA片段片段宿主细胞宿主细胞质粒质粒510kb细菌，酵母细菌，酵母噬菌体载体噬菌体载体20kb细菌细菌黏粒黏粒50 kb细菌细菌BAC400kb细菌细菌YAC3 Mb酵母酵母不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞 第六十七页，本课件共有93页目录目录（三）目的（三）目的DNA与载体连接与载体连接接接方式：（方式：（1）单一相同黏端连接单一相同黏端连接 （2 2）不同黏端连接不同黏端连接 （3）通过其他措施产生黏端进行连接通过其他措施产生黏端进行连接 1.黏端连接黏端连接第六十八页，本课件共有93页Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连单单一一相相同同黏黏端端连连接接第六十九页，本课件共有93页不同黏端连接（定向克隆）不同黏端连接（定向克隆）Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体第七十页，本课件共有93页目录目录由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接。人工接头人工接头(linker)连接连接通过其他措施产生黏端进行连接通过其他措施产生黏端进行连接第七十一页，本课件共有93页目录目录人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R第七十二页，本课件共有93页目录目录在在末末端端转转移移酶酶(terminal transferase)的的作作用用下下，在在DNA片片段段末末端端加加上上同同聚聚物物序序列列、制制造造出出粘性末端，再进行粘端连接。粘性末端，再进行粘端连接。同聚物加尾连接同聚物加尾连接第七十三页，本课件共有93页目录目录5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体5第七十四页，本课件共有93页目录目录PCRPCR法法针针对对目目的的DNADNA的的5 5-和和3 3-端端，设设计计一一对对特特异异引引物物，在在每每条条引引物物的的5 5-端端分分别别加加上上不不同同的的RERE位位点点，然然后后以以目目的的DNADNA为为模模板板，经经PCRPCR扩扩增增便便可可得得到到带带有有引引物物序序列列的的目目的的DNADNA，再再用用相相应应RERE切切割割PCRPCR产产物物，产产生生黏黏端端，随随后后便便可可与与带带有有相相同同黏黏端端的的线线性性化化载载体体进行有效连接。进行有效连接。第七十五页，本课件共有93页目录目录2.平端连接平端连接 n限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端n粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：适用于：第七十六页，本课件共有93页目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连第七十七页，本课件共有93页目录目录3.3.粘粘-平末端连接平末端连接n黏黏-平末端连接是指目的平末端连接是指目的DNADNA和载体之间通过一和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。n属于定向克隆属于定向克隆第七十八页，本课件共有93页目录目录n受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent)n导入方式：导入方式：转化转化(transformation)转染转染(transfection)感染感染(infection)（四）重组（四）重组DNA转入受体细胞转入受体细胞转转第七十九页，本课件共有93页目录目录1.借助载体上的遗传标志进行筛选借助载体上的遗传标志进行筛选（初筛）（初筛）(1)利用抗生素抗性标志筛选利用抗生素抗性标志筛选(2)利用基因的插入失活利用基因的插入失活/插入表达插入表达 特性筛选特性筛选(3)利用标志补救筛选利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选利用噬菌体的包装特性进行筛选（五）重组体的筛选与鉴定（五）重组体的筛选与鉴定筛筛第八十页，本课件共有93页目录目录2.序列序列特异性筛选特异性筛选(1)RERE酶切法酶切法(2)PCR法法(3)核酸杂交法核酸杂交法(4)DNA测序法测序法 3.亲和筛选法亲和筛选法第八十一页，本课件共有93页插入失活筛选带有重组载体的克隆插入失活筛选带有重组载体的克隆 第八十二页，本课件共有93页 互补筛选（蓝互补筛选（蓝-白筛选）白筛选）第八十三页，本课件共有93页菌落或噬斑原位杂交筛选重组体菌落或噬斑原位杂交筛选重组体 第八十四页，本课件共有93页目录目录重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为：小结小结分分分离获取目的基因分离获取目的基因 选选载体的选择与构建载体的选择与构建接接目的目的DNADNA与载体连接与载体连接 转转重组重组DNADNA转入受体细胞转入受体细胞筛筛重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定第八十五页，本课件共有93页目录目录重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交第八十六页，本课件共有93页目录目录表达体系的建立：表达体系的建立：n 表达载体的构建表达载体的构建n 受体细胞的建立受体细胞的建立n 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达第八十七页，本课件共有93页目录目录n 标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点n E.coli表达体系的不足表达体系的不足：不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)；很难表达大量可溶性蛋白。很难表达大量可溶性蛋白。1.原核表达体系原核表达体系(E.coli表达体系最为常用表达体系最为常用)第八十八页，本课件共有93页目录目录n 优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累n 缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济n 转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2.2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）第八十九页，本课件共有93页目录目录第三节第三节 重组重组DNA技术在医学中的应用技术在医学中的应用Application of Recombinant DNA Technology in Medicine第九十页，本课件共有93页目录目录一、重组一、重组DNADNA技术广泛应用于生物制药技术广泛应用于生物制药n利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产利用基因工程生