逆转录聚合酶链反应中的细节问题精选课件.ppt

关于逆转录聚合酶链反应中的细节问题第一页，本课件共有49页RT-PCR原理原理第二页，本课件共有49页1实验器具与材料实验器具与材料1试剂试剂 1标本收集与保存标本收集与保存1 RNARNA抽提抽提1逆转录反应逆转录反应(RT)(RT)1聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR)PCR)介绍内容介绍内容介绍内容介绍内容第三页，本课件共有49页一、实验器具、材料一、实验器具、材料1 1、移液枪：、移液枪：1ml1ml、200l200l、20l20l2 2、吸头及吸头盒：、吸头及吸头盒：1ml1ml、200l200l、20l 20l（无菌无酶，可直接购买）（无菌无酶，可直接购买）3 3、EPEP管：管：1.5ml 1.5ml（无菌无酶，可直接购买）（无菌无酶，可直接购买）4 4、PCRPCR薄壁管薄壁管 0.2ml0.2ml 5 5、普通、普通EPEP管：管：1.5ml1.5ml、O.5mlO.5ml（高压灭菌）（高压灭菌）6 6、大瓷缸：、大瓷缸：2 2个个 （180180的高温干烤的高温干烤6h6h，灭活，灭活RNARNA酶，存放无酶酶，存放无酶EPEP管和管和PCRPCR管）管）7 7、组织捣碎棒（可直接购买）、组织捣碎棒（可直接购买）第四页，本课件共有49页1 1、DEPCDEPC水水 500ml500ml。2 2、75%75%乙醇：用无水乙醇乙醇：用无水乙醇 DEPCDEPC水配，然后放水配，然后放44保存保存3 3、异丙醇、异丙醇4 4、氯仿、氯仿5 5、电泳缓冲液、电泳缓冲液(TAE/TBE)(TAE/TBE)7 7、琼脂糖、琼脂糖8 8、TaqTaq酶（含酶（含MgCl2 BufferMgCl2 Buffer）,-20,-20 9 9、dNTP,-20dNTP,-20 1010、随机引物、随机引物,-20,-20 1111、M-MLVM-MLV逆转录酶逆转录酶 (Buffer),-20(Buffer),-20 1212、RNasin,-20RNasin,-20 1313、Trizol 100ml/1Trizol 100ml/1瓶瓶 ,-4,-4 1414、Marker,-20Marker,-20 1515、引物、引物,-20,-20 二、试剂二、试剂第五页，本课件共有49页三、标本收集与保存三、标本收集与保存 1 1、细胞：、细胞：悬浮细胞：悬浮细胞：1500rpm,5min1500rpm,5min离心，取沉淀离心，取沉淀-80-80 冻存，或直接抽冻存，或直接抽RNA;RNA;贴壁细胞：倒掉培养液，加贴壁细胞：倒掉培养液，加Trizol 1ml,Trizol 1ml,溶解细胞，直接抽溶解细胞，直接抽RNARNA或冻存（如没有或冻存（如没有TrizolTrizol，可用胰酶消化后，同悬浮细胞处理），可用胰酶消化后，同悬浮细胞处理）2 2、组织：、组织：液氮取材（越快越好），液氮取材（越快越好），-80-80 冻存：即可用于抽冻存：即可用于抽RNA,RNA,也可用于抽蛋白；也可用于抽蛋白；RNARNA保护剂取材保护剂取材:用普通冰袋即可，但不宜用于抽蛋白；用普通冰袋即可，但不宜用于抽蛋白；TrizolTrizol取材：同上；取材：同上；-80-80 冰袋取材：没办法的办法。冰袋取材：没办法的办法。目的：防止目的：防止目的：防止目的：防止RNARNARNARNA被被被被RNARNARNARNA酶降解酶降解酶降解酶降解措施：低温、措施：低温、措施：低温、措施：低温、RNARNARNARNA酶抑制剂、尽快取材防止细胞裂解酶抑制剂、尽快取材防止细胞裂解酶抑制剂、尽快取材防止细胞裂解酶抑制剂、尽快取材防止细胞裂解第六页，本课件共有49页四、四、RNARNA抽提抽提 目的：防止目的：防止目的：防止目的：防止RNARNARNARNA被被被被RNARNARNARNA酶降解，获得高质量的酶降解，获得高质量的酶降解，获得高质量的酶降解，获得高质量的RNARNARNARNA措施：措施：措施：措施：1.1.1.1.了解了解了解了解RNARNARNARNA酶的来源及应对方法：酶的来源及应对方法：酶的来源及应对方法：酶的来源及应对方法：（1 1 1 1）内源性：组织细胞裂解释放（低温、）内源性：组织细胞裂解释放（低温、）内源性：组织细胞裂解释放（低温、）内源性：组织细胞裂解释放（低温、RNARNARNARNA酶抑制剂）酶抑制剂）酶抑制剂）酶抑制剂）（2 2 2 2）外源性：实验者的皮肤分泌物、呼吸气体、唾液等（带手套、）外源性：实验者的皮肤分泌物、呼吸气体、唾液等（带手套、）外源性：实验者的皮肤分泌物、呼吸气体、唾液等（带手套、）外源性：实验者的皮肤分泌物、呼吸气体、唾液等（带手套、口罩）；口罩）；口罩）；口罩）；（3 3 3 3）实验环境中的灰尘、微生物等（环境清洁、消毒、在超净台内进行）；）实验环境中的灰尘、微生物等（环境清洁、消毒、在超净台内进行）；）实验环境中的灰尘、微生物等（环境清洁、消毒、在超净台内进行）；）实验环境中的灰尘、微生物等（环境清洁、消毒、在超净台内进行）；（4 4 4 4）实验器械（进行无酶处理）：）实验器械（进行无酶处理）：）实验器械（进行无酶处理）：）实验器械（进行无酶处理）：180180180180的高温下干烤的高温下干烤的高温下干烤的高温下干烤6h6h6h6h；0.1%0.1%0.1%0.1%DEPCDEPCDEPCDEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具不能使用）；用水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具不能使用）；用水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具不能使用）；用水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具不能使用）；用DEPCDEPCDEPCDEPC处处处处理过的无菌双蒸水配制溶液。理过的无菌双蒸水配制溶液。理过的无菌双蒸水配制溶液。理过的无菌双蒸水配制溶液。第七页，本课件共有49页2 2 2 2、了解、了解、了解、了解RNARNARNARNA抽提的步骤原理，知道哪些是需要注意抽提的步骤原理，知道哪些是需要注意抽提的步骤原理，知道哪些是需要注意抽提的步骤原理，知道哪些是需要注意RNARNARNARNA酶污染的关键步酶污染的关键步酶污染的关键步酶污染的关键步骤，做到胆大心细。举例如下：骤，做到胆大心细。举例如下：骤，做到胆大心细。举例如下：骤，做到胆大心细。举例如下：TRI REAGENT TRI REAGENT TRI REAGENT TRI REAGENT 分离分离分离分离RNARNARNARNA PROTOCOLPROTOCOLPROTOCOLPROTOCOL1 1 1 1）5 5 5 510101010101010106 6 6 6细胞沉淀，加细胞沉淀，加细胞沉淀，加细胞沉淀，加TRI Reagent 1ml,TRI Reagent 1ml,TRI Reagent 1ml,TRI Reagent 1ml,反复吹打将细胞溶解。反复吹打将细胞溶解。反复吹打将细胞溶解。反复吹打将细胞溶解。50-100 mg 50-100 mg 50-100 mg 50-100 mg 组织加组织加组织加组织加 1 ml TRI Reagent1 ml TRI Reagent1 ml TRI Reagent1 ml TRI Reagent于匀浆器中匀浆于匀浆器中匀浆于匀浆器中匀浆于匀浆器中匀浆 （注意：标本体积不（注意：标本体积不（注意：标本体积不（注意：标本体积不得超过得超过得超过得超过TRI Reagent TRI Reagent TRI Reagent TRI Reagent 体积的体积的体积的体积的10%10%10%10%）2 2 2 2）将匀浆于室温静置）将匀浆于室温静置）将匀浆于室温静置）将匀浆于室温静置 5 5 5 5 分钟（此步后将样本置分钟（此步后将样本置分钟（此步后将样本置分钟（此步后将样本置-80-80-80-80 至少可保存一个月）至少可保存一个月）至少可保存一个月）至少可保存一个月）3 3 3 3）然后向匀浆中加）然后向匀浆中加）然后向匀浆中加）然后向匀浆中加 入入入入0.2 ml0.2 ml0.2 ml0.2 ml氯仿氯仿氯仿氯仿,盖紧样本剧烈振摇盖紧样本剧烈振摇盖紧样本剧烈振摇盖紧样本剧烈振摇15151515秒秒秒秒4 4 4 4）将混合物室温静置）将混合物室温静置）将混合物室温静置）将混合物室温静置 2-15 min2-15 min2-15 min2-15 min，12,000 g 12,000 g 12,000 g 12,000 g，4444离心离心离心离心 15 min 15 min 15 min 15 min（低温离心很（低温离心很（低温离心很（低温离心很重要，否则，水相中会混入少量的重要，否则，水相中会混入少量的重要，否则，水相中会混入少量的重要，否则，水相中会混入少量的DNADNADNADNA）(离心后原混合物分为底层红色的离心后原混合物分为底层红色的 酚氯仿相酚氯仿相,中间相和上层无色的水相。中间相和上层无色的水相。RNA RNA 存在存在于水相于水相，而，而DNA DNA 和蛋白质分别存在于中间相和有机相。水相的体积大概占用于匀浆的和蛋白质分别存在于中间相和有机相。水相的体积大概占用于匀浆的TRI TRI ReagentReagent总体积的总体积的 60%60%。)5)5)5)5)转移上层无色的水相至新的管子中转移上层无色的水相至新的管子中转移上层无色的水相至新的管子中转移上层无色的水相至新的管子中,加加加加 0.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml异丙醇（从水相中沉淀异丙醇（从水相中沉淀异丙醇（从水相中沉淀异丙醇（从水相中沉淀RNARNARNARNA），室温静置），室温静置），室温静置），室温静置 5-10 5-10 5-10 5-10 分钟分钟分钟分钟6)12,000 g6)12,000 g6)12,000 g6)12,000 g，4 4 4 4 离心离心离心离心 8 min.8 min.8 min.8 min.此时可见此时可见此时可见此时可见RNA RNA RNA RNA 沉淀沉淀沉淀沉淀(离心前通常看不见离心前通常看不见离心前通常看不见离心前通常看不见)于管底或于管底或于管底或于管底或侧壁形成胶冻状或白色沉淀。侧壁形成胶冻状或白色沉淀。侧壁形成胶冻状或白色沉淀。侧壁形成胶冻状或白色沉淀。第八页，本课件共有49页7)7)7)7)移去上清，加至少移去上清，加至少移去上清，加至少移去上清，加至少1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 的的的的 75%75%75%75%乙醇洗涤乙醇洗涤乙醇洗涤乙醇洗涤RNA RNA RNA RNA 沉淀沉淀沉淀沉淀 (用用用用 涡旋涡旋涡旋涡旋)，（此时，（此时，（此时，（此时RNARNARNARNA可可可可至于至于至于至于75%75%75%75%乙醇中存于乙醇中存于乙醇中存于乙醇中存于 4 4 4 4 至少一周或存于至少一周或存于至少一周或存于至少一周或存于-20-20-20-20 至少一年）至少一年）至少一年）至少一年）8)8)然后于然后于 7,500 g 7,500 g，4 4 离心离心 5 min5 min（如（如 RNA沉淀积于管壁一侧和倾向于漂浮，于12,000 g沉淀）9)移去上层的乙醇洗液，将移去上层的乙醇洗液，将RNARNA沉淀置空气中短时干燥沉淀置空气中短时干燥.（注意不要让RNA沉淀完全干燥，因为这样将极大的降低其可溶性。但对于用于RT-PCR的样本而言，应尽量让RNA样本中的乙醇挥发，这对5-20微升的小体积样本尤其重要）10)10)10)10)用用用用30-5030-5030-5030-50mmmmlRNase-freelRNase-freelRNase-freelRNase-free的水溶解的水溶解的水溶解的水溶解RNARNARNARNA几分钟，可用吸头吹几下（如还不溶于几分钟，可用吸头吹几下（如还不溶于几分钟，可用吸头吹几下（如还不溶于几分钟，可用吸头吹几下（如还不溶于55-55-55-55-60 60 60 60 孵育孵育孵育孵育 10-15 10-15 10-15 10-15 分钟）分钟）分钟）分钟）11)11)11)11)浓度质量检测浓度质量检测浓度质量检测浓度质量检测所需试剂：所需试剂：TRI Reagent TRI Reagent（Molecular Research Center,INC.Molecular Research Center,INC.，Cat.No.TR 118Cat.No.TR 118）RNase-freeRNase-free的水（上海生工的水（上海生工 Cat.NoCat.No：D1005D1005100ml100ml）氯仿、异丙醇、乙醇氯仿、异丙醇、乙醇所需器材：所需器材：组织捣碎棒（组织捣碎棒（RNase-freeRNase-free，上海华舜，上海华舜 Cat.NoCat.No：W1220W1220）RNase-freeRNase-free，1.5ml1.5ml离心管离心管1ml1ml，200200微升、微升、2020微升微升 tip tip（RNase-freeRNase-free，已消毒盒装，已消毒盒装)第九页，本课件共有49页3 3 3 3、RNARNARNARNA质量检测质量检测质量检测质量检测1 1）检测）检测RNARNA溶液的吸光度溶液的吸光度 OD260/OD280=1.8OD260/OD280=1.82.0表示优质（表示优质（280280、260nm260nm下下的吸光度分别代表了核酸、和蛋白值），并可以检测浓度的吸光度分别代表了核酸、和蛋白值），并可以检测浓度;2 2）RNARNA的电泳图谱：检测的电泳图谱：检测28S28S和和18S18S条带的完整性和他们的比值。一般的，条带的完整性和他们的比值。一般的，如果如果28S28S和和18S18S条带明亮、清晰，并且条带明亮、清晰，并且28S28S的亮度在的亮度在18S18S条带的两倍以上，条带的两倍以上，RNARNA的质量是好的的质量是好的;3 3）保温试验（检测有无微量）保温试验（检测有无微量RNARNA酶残留）酶残留）4)4)直接逆转为直接逆转为cDNAcDNA，进行管家基因（如，进行管家基因（如bb-actin-actin）PCRPCR，琼脂糖电泳后，如有相，琼脂糖电泳后，如有相应的产物条带，则说明应的产物条带，则说明RNARNA可以使用可以使用5 5 5 5、RNARNARNARNA保存：保存：保存：保存：-80-80-80-80 冻存；或逆转为冻存；或逆转为冻存；或逆转为冻存；或逆转为cDNAcDNAcDNAcDNA保存（更安全）保存（更安全）保存（更安全）保存（更安全）4 4 4 4、DNADNADNADNA污染的检测与处理污染的检测与处理污染的检测与处理污染的检测与处理1 1 1 1）检测方法：）检测方法：）检测方法：）检测方法：a:a:a:a:用没有逆转录的用没有逆转录的用没有逆转录的用没有逆转录的RNARNARNARNA产物进行产物进行产物进行产物进行PCRPCRPCRPCR，有产物生成，提示污染，有产物生成，提示污染，有产物生成，提示污染，有产物生成，提示污染 b:b:b:b:设计上下游引物，使其与设计上下游引物，使其与设计上下游引物，使其与设计上下游引物，使其与DNADNADNADNA互补位点之间包含内含子，来源于互补位点之间包含内含子，来源于互补位点之间包含内含子，来源于互补位点之间包含内含子，来源于cDNAcDNAcDNAcDNA的的的的PCRPCRPCRPCR产物会比来源于沾染的基因组产物会比来源于沾染的基因组产物会比来源于沾染的基因组产物会比来源于沾染的基因组DNADNADNADNA的产物短的产物短的产物短的产物短 2 2 2 2）处理：在逆转录之前使用扩增级的）处理：在逆转录之前使用扩增级的）处理：在逆转录之前使用扩增级的）处理：在逆转录之前使用扩增级的DNaseDNaseDNaseDNase对对对对RNARNARNARNA进行处理进行处理进行处理进行处理 第十页，本课件共有49页五、逆转录反应五、逆转录反应 目的：以目的：以目的：以目的：以RNARNARNARNA为模板，逆转录合成为模板，逆转录合成为模板，逆转录合成为模板，逆转录合成cDNAcDNAcDNAcDNA措施：措施：措施：措施：1.1.1.1.获取优质的获取优质的获取优质的获取优质的RNA;RNA;RNA;RNA;2.2.2.2.采用优质的逆转录酶采用优质的逆转录酶采用优质的逆转录酶采用优质的逆转录酶n AMV(AMV(AMV(AMV(禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒)：逆转录酶和：逆转录酶和：逆转录酶和：逆转录酶和RNARNARNARNA酶酶酶酶H H H H活性。最适活性。最适活性。最适活性。最适42424242。n n MMLV(Moloney MMLV(Moloney MMLV(Moloney MMLV(Moloney 鼠白血病病毒鼠白血病病毒鼠白血病病毒鼠白血病病毒)：逆转录酶活性强，：逆转录酶活性强，：逆转录酶活性强，：逆转录酶活性强，RNARNARNARNA酶酶酶酶H H H H活性较弱。活性较弱。活性较弱。活性较弱。最适最适最适最适37373737或或或或42424242。3.3.3.3.引物选择引物选择引物选择引物选择:随机引物随机引物随机引物随机引物:适用于长的或具有发卡结构的适用于长的或具有发卡结构的适用于长的或具有发卡结构的适用于长的或具有发卡结构的RNA,RNA,RNA,RNA,特异性最低特异性最低特异性最低特异性最低;。Oligo(dT)Oligo(dT)：适用于具有：适用于具有PolyAPolyA尾巴的尾巴的RNARNA 特异性引物：与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的特异性引物：与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况序列已知的情况 4 4 4 4、质量检测：、质量检测：、质量检测：、质量检测：进行管家基因（如进行管家基因（如bb-actin-actin）PCRPCR5 5、产物保存：、产物保存：-20-20 第十一页，本课件共有49页First-Strand Synthesis of cDNAFirst-Strand Synthesis of cDNA举例举例1.1.试剂试剂(1)M-MLV Reverse Transcriptase(200u/ul)(1)M-MLV Reverse Transcriptase(200u/ul)（promegapromega，Catalog#M1701)Catalog#M1701)(2)M-MLV 5Reaction Buffer(2)M-MLV 5Reaction Buffer(3)rRNasin(40u/ul)(3)rRNasin(40u/ul)（promegapromega）(4)dNTP(10mM each)(4)dNTP(10mM each)（生工）（生工）(5)Random Primers(5)Random Primers（生工）（生工）(6)Nuclease-Free Water(6)Nuclease-Free Water2.2.操作步骤操作步骤（1)1)1)1)Total RNA2 ugPrimer(0.5ug/ul)2 ul Note:0.5ug/ug mRNANuclease-Free Water11 ulAdd to 15 ul70 70 ，5 5分钟以溶解模板的二级结构，取出立即置冰上冷却（防止二级结分钟以溶解模板的二级结构，取出立即置冰上冷却（防止二级结构重新形成），简单离心。构重新形成），简单离心。第十二页，本课件共有49页M-MLV 5Reaction Buffer5 uldNTP(10mM each)1.25 ulrRNasin(40u/ul)0.6 ul=25 uM-MLV Reverse Transcriptase(200u/ul)1 ulNuclease-Free Water2.15 ulTotal Volume 25 ul轻弹轻弹PCRPCR管，使其混匀，简单离心。管，使其混匀，简单离心。（3 3）在）在PCRPCR仪上执行仪上执行3737 60min 60min（Random PrimersRandom Primers，其它引物如，其它引物如 Oligo(dT)Oligo(dT)用用42 42 ）。）。（4 4）70 70 10 10分钟后进行分钟后进行PCRPCR或或20 20 保存备用。保存备用。（2 2）在冰上依次加入下列试剂：）在冰上依次加入下列试剂：第十三页，本课件共有49页六、聚合酶链反应（六、聚合酶链反应（PCR)PCR)目的：以目的：以目的：以目的：以cDNAcDNAcDNAcDNA为模板大量扩增目的基因片段为模板大量扩增目的基因片段为模板大量扩增目的基因片段为模板大量扩增目的基因片段措施：措施：措施：措施：1.1.1.1.合适的合适的合适的合适的PCRPCRPCRPCR引物引物引物引物;2.2.2.2.合适的合适的合适的合适的TaqTaqTaqTaq酶；酶；酶；酶；3.PCR3.PCR3.PCR3.PCR条件的优化条件的优化条件的优化条件的优化第十四页，本课件共有49页PCRPCRPCRPCR引物设计原理引物设计原理引物设计原理引物设计原理第十五页，本课件共有49页PCRPCRPCRPCR引物选择与设计引物选择与设计引物选择与设计引物选择与设计引物选择与设计引物选择与设计引物选择与设计引物选择与设计1.1.1.1.引用文献（影响因子较高的杂志或使用频率较高）引用文献（影响因子较高的杂志或使用频率较高）引用文献（影响因子较高的杂志或使用频率较高）引用文献（影响因子较高的杂志或使用频率较高）;2.2.2.2.找引物合成公司设计；找引物合成公司设计；找引物合成公司设计；找引物合成公司设计；3.3.3.3.自己设计自己设计自己设计自己设计:目的不同引物要求也不同：目的不同引物要求也不同：目的不同引物要求也不同：目的不同引物要求也不同：1.1.1.1.用于分子克隆的引物：应涵盖目的基因全长，引入酶切位点；用于分子克隆的引物：应涵盖目的基因全长，引入酶切位点；用于分子克隆的引物：应涵盖目的基因全长，引入酶切位点；用于分子克隆的引物：应涵盖目的基因全长，引入酶切位点；2.2.2.2.用于定性或半定量的用于定性或半定量的用于定性或半定量的用于定性或半定量的PCRPCRPCRPCR引物：涵盖部分目的基因即可（引物：涵盖部分目的基因即可（引物：涵盖部分目的基因即可（引物：涵盖部分目的基因即可（200bp)200bp)200bp)200bp)；3.3.3.3.用于用于用于用于real-time PCRreal-time PCRreal-time PCRreal-time PCR的引物：涵盖的目的基因不宜太长（的引物：涵盖的目的基因不宜太长（的引物：涵盖的目的基因不宜太长（的引物：涵盖的目的基因不宜太长（150-250bp)150-250bp)150-250bp)150-250bp)第十六页，本课件共有49页 用用用用Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0进行引物设计举例进行引物设计举例 以大鼠以大鼠以大鼠以大鼠olig2olig2olig2olig2的引物设计为例的引物设计为例的引物设计为例的引物设计为例1 1 1 1、查找大鼠、查找大鼠、查找大鼠、查找大鼠olig1 mRNAolig1 mRNAolig1 mRNAolig1 mRNA碱基序列碱基序列碱基序列碱基序列第十七页，本课件共有49页第十八页，本课件共有49页2 2、用、用Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0进行引物设计进行引物设计第十九页，本课件共有49页第二十页，本课件共有49页第二十一页，本课件共有49页第二十二页，本课件共有49页第二十三页，本课件共有49页第二十四页，本课件共有49页四种重要指标：发夹结构四种重要指标：发夹结构四种重要指标：发夹结构四种重要指标：发夹结构(Hairpin)(Hairpin)(Hairpin)(Hairpin)、二聚体、二聚体、二聚体、二聚体(Dimer)(Dimer)(Dimer)(Dimer)、错误引发情况、错误引发情况、错误引发情况、错误引发情况(False(False(False(False Priming)Priming)Priming)Priming)、上下游引物之间二聚体形成情况、上下游引物之间二聚体形成情况、上下游引物之间二聚体形成情况、上下游引物之间二聚体形成情况(Cross Dimer)(Cross Dimer)(Cross Dimer)(Cross Dimer)第二十五页，本课件共有49页第二十六页，本课件共有49页第二十七页，本课件共有49页第二十八页，本课件共有49页Sense:5 ACCTCCGACGCCAAGTGA 3Sense:5 ACCTCCGACGCCAAGTGA 3Sense:5 ACCTCCGACGCCAAGTGA 3Sense:5 ACCTCCGACGCCAAGTGA 3Anti-sense:5 CGGTTCCCAAATAATACGC 3Anti-sense:5 CGGTTCCCAAATAATACGC 3Anti-sense:5 CGGTTCCCAAATAATACGC 3Anti-sense:5 CGGTTCCCAAATAATACGC 34 4、引物同源性分析（用、引物同源性分析（用BlastBlast进行同源性比较）进行同源性比较）检查引物的特异性3 3、Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0设计的大鼠设计的大鼠olig2olig2引物引物第二十九页，本课件共有49页第三十页，本课件共有49页第三十一页，本课件共有49页第三十二页，本课件共有49页第三十三页，本课件共有49页第三十四页，本课件共有49页第三十五页，本课件共有49页5 5、BlastBlast进行同源性比较，确认引物的特异性后，联系公司，合成引物进行同源性比较，确认引物的特异性后，联系公司，合成引物6 6、引物的溶解和稀释、引物的溶解和稀释上下游引物干粉各加适量消毒双蒸水上下游引物干粉各加适量消毒双蒸水(灭菌注射用水灭菌注射用水)稀释至稀释至20M,-20M,-2020保存保存.第三十六页，本课件共有49页PCRPCR举例举例第三十七页，本课件共有49页注意：此注意：此注意：此注意：此PCRPCRPCRPCR反应条件中缺预变性反应条件中缺预变性反应条件中缺预变性反应条件中缺预变性（94949494，5min)5min)和最后的产物延伸（和最后的产物延伸（72 72，10min)10min)第三十八页，本课件共有49页第三十九页，本课件共有49页DNADNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 准备试剂：准备试剂：准备试剂：准备试剂：1 1 1 1电泳缓冲液：电泳缓冲液：电泳缓冲液：电泳缓冲液：(TBE(TBE(TBE(TBE或或或或TAETAETAETAE均可）均可）均可）均可）(1)(1)(1)(1)5 5 5 5TBE:TBE:TBE:TBE:Tris 54 g Tris 54 g Tris 54 g Tris 54 g Boric Acid 27.5 gBoric Acid 27.5 gBoric Acid 27.5 gBoric Acid 27.5 g0.5mol0.5mol0.5mol0.5molL EDTA 200 mL pH=8.0L EDTA 200 mL pH=8.0L EDTA 200 mL pH=8.0L EDTA 200 mL pH=8.0定容至定容至定容至定容至1000 ml1000 ml1000 ml1000 ml。(2)50 xTAE(2)50 xTAE(2)50 xTAE(2)50 xTAETris 242 gTris 242 gTris 242 gTris 242 g冰醋酸冰醋酸冰醋酸冰醋酸 57 mL 57 mL 57 mL 57 mL0.5mol0.5mol0.5mol0.5molL EDTA 200 mLpH 8.0L EDTA 200 mLpH 8.0L EDTA 200 mLpH 8.0L EDTA 200 mLpH 8.0 定容至定容至定容至定容至1000 ml1000 ml1000 ml1000 ml。2222凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液(6(6(6(6)3333琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖 4 4 4 4溴化乙锭溶液溴化乙锭溶液溴化乙锭溶液溴化乙锭溶液(EB)10mg(EB)10mg(EB)10mg(EB)10mgmLmLmLmL 5 5 5 5DNA DNA DNA DNA 分子量分子量分子量分子量MarkerMarkerMarkerMarker第四十页，本课件共有49页实验步骤实验步骤 配胶（配胶（1琼脂糖凝胶）琼脂糖凝胶）0.3 g 琼脂糖加入琼脂糖加入30 ml 0.5TBE中，摇匀；在微波炉中加中，摇匀；在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；冷却到热至琼脂糖完全溶解；冷却到60，加入，加入3l的的EB，并摇匀，并摇匀.制胶：把梳子插入制胶槽相应位置，将融解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固，垂制胶：把梳子插入制胶槽相应位置，将融解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固，垂直向上拔出梳子，将凝胶连同胶槽置入电泳槽中，加直向上拔出梳子，将凝胶连同胶槽置入电泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖电泳缓冲液至液面覆盖凝胶凝胶1-2mm。(3)点样：用移液抢吸取点样：用移液抢吸取PCR产物产物5l于塑料纸上，再加入于塑料纸上，再加入1l 的的6加样缓加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。冲液，混匀后，小心加入点样孔。(4)电泳：（由负极向正极电泳）打开电源开关，调节至合适电压电泳：（由负极向正极电泳）打开电源开关，调节至合适电压(一般电一般电场强度不要超过场强度不要超过5Vcm)；可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约；可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约15min-30min。(5)观察：关掉电源，将凝胶小心的从电泳槽中取出，置于紫外透射检测仪上观察，拍观察：关掉电源，将凝胶小心的从电泳槽中取出，置于紫外透射检测仪上观察，拍照，并分析。照，并分析。第四十一页，本课件共有49页PCRPCR反应条件的优化反应条件的优化（一）（一）PCRPCR反应的缓冲溶液反应的缓冲溶液提供合适的酸碱度和某些离子提供合适的酸碱度和某些离子101050mmol/L Tris-HCl50mmol/L Tris-HCl缓冲液缓冲液50mmol/L KCl50mmol/L KClBSABSA或明胶或明胶（二）镁离子浓度（二）镁离子浓度TaqTaq酶活性需要酶活性需要MgMg2+2+，MgMg2+2+浓度过高导致非特异扩增。浓度过高导致非特异扩增。一般常用一般常用1.5mmol/L1.5mmol/L三）底物浓度三）底物浓度dNTPdNTP浓度在浓度在2020200 200 mol/Lmol/L四种四种dNTPdNTP必须浓度相等必须浓度相等（四）（四）Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶Taq DNATaq DNA聚合酶在聚合酶在70708080具有最高聚合活性具有最高聚合活性第四十二页，本课件共有49页（五）引物（五）引物引物浓度一般为引物浓度一般为0.10.1 0.50.5 mol/Lmol/L（六）反应温度和循环次数（六）反应温度和循环次数n变性温度和时间变性温度和时间 95/30 95/30 60s60sn退火温度和时间退火温度和时间 454555/30 55/30 60s60sn延伸温度和时间延伸温度和时间 7272 60s 60sn循环次数循环次数 252530 30 不超过不超过3535第四十三页，本课件共有49页PCRPCR反应中可能出现的问题反应中可能出现的问题：n假阴性，不出现扩增条带假阴性，不出现扩增条带n假阳性假阳性n出现非特异扩增带出现非特异扩增带预防措施预防措施（一）防止污染（一）防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EPEP管一次性使用管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照（二）设立对照：阳性对照：阳性对照：阳性模板阳性模板阴性对照：阴性对照：阴性模板阴性模板试剂对照：试剂对照：除模板外的所有组分除模板外的所有组分第四十四页，本课件共有49页阴性结果应采取的措施阴性结果应采取的措施n用第一次扩增的产物作模板进行第二次扩增用第一次扩增的产物作模板进行第二次扩增n增加增加TaqDNATaqDNA聚合酶的浓度聚合酶的浓度n增加模板量增加模板量n纯化模板纯化模板n增加扩增循环次数增加扩增循环次数n适当降低退火温度适当降低退火温度n增加镁离子浓度增加镁离子浓度第四十五页，本课件共有49页出现非特异性产物时应采取的措施出现非特异性产物时应采取的措施n增加退火温度增加退火温度n减少减少TaqDNATaqDNA聚合酶的浓度聚合酶的浓度n减少退火及延伸时间减少退火及延伸时间n减少引物浓度减少引物浓度n减少扩增循环次数减少扩增循环次数n减少镁离子浓度减少镁离子浓度第四十六页，本课件共有49页谢谢！谢谢！第四十七页，本课件共有49页第四十八页，本课件共有49页感感谢谢大大家家观观看看第四十九页，本课件共有49页