第三章 基因工程常用技术.ppt

第三章第三章基因工程常用技术基因工程常用技术一、质粒一、质粒DNA的提取的提取二、核酸凝胶电泳技术二、核酸凝胶电泳技术三、核酸分子杂交技术三、核酸分子杂交技术四、聚合酶链反应四、聚合酶链反应(PCR)技术技术五、五、DNA序列分析技术序列分析技术1质粒质粒DNA的提取是基因工程操作中的提取是基因工程操作中最基本的技术，最常用的是最基本的技术，最常用的是碱裂解法碱裂解法。一、质粒一、质粒DNA的提取的提取2在在强强碱碱性性溶溶液液中中，DNA双双链链的的氢氢键键断断裂裂变变性性；当当溶溶液液恢恢复复中中性性时时，DNA双双链复性。链复性。（一）碱裂解法提取质粒（一）碱裂解法提取质粒DNA1、原理、原理3在变性后双链不分离、复性快。在变性后双链不分离、复性快。共价闭合环状的质粒共价闭合环状的质粒DNA：4强碱性强碱性变变性性后后双双链链分分离离、难难以以复复性性而而形形成成缠缠绕绕结结构构，与与蛋蛋白白质质-SDS复复合合物物结结合合在在一一起起，离离心时沉淀。心时沉淀。线性染色体线性染色体DNA：52、碱裂解法质粒、碱裂解法质粒DNA提取的步骤提取的步骤1）溶菌）溶菌使用使用“溶液溶液I”溶解细菌细胞壁。溶解细菌细胞壁。溶液溶液I：50mM葡萄糖葡萄糖25mMTris-HCl(pH8.0)10mMEDTA4-5mg/ml溶菌酶溶菌酶6葡萄糖：葡萄糖：增加溶液粘度，维持渗透压，防止增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力的作用而降解（震荡）。受机械力的作用而降解（震荡）。EDTA：Mg2+、Ca2+螯螯合合剂剂，抑抑制制DNase活活性性，防止防止DNA被降解。被降解。7溶菌酶：溶菌酶：为为糖糖苷苷水水解解酶酶，能能水水解解菌菌体体细细胞胞壁壁的的主主要要化化学学成成分分-肽肽聚聚糖糖中中的的-1,4糖糖苷苷键键，具有溶菌作用具有溶菌作用。82）变性）变性加入加入“溶液溶液II”，使细菌细胞膜破坏、使，使细菌细胞膜破坏、使蛋白质和蛋白质和DNA变性。变性。溶液溶液II：0.2NNaOH（10N贮存液现用现稀释）贮存液现用现稀释）1%SDS9NaOH：是是强强碱碱，提提供供pH12的的碱碱性性条条件件，使使DNA双链变性。双链变性。是是离离子子型型表表面面活活性性剂剂，溶溶解解细细胞胞膜膜和和细细胞胞内内蛋蛋白白，并并结结合合成成“蛋蛋白白质质-SDS”复复合合物物，使蛋白质（包括使蛋白质（包括DNase）变性沉淀。）变性沉淀。SDS：103）中和）中和加入加入“溶液溶液III”使使DNA复性、蛋白质复性、蛋白质-SDS复合物和染色体复合物和染色体DNA、RNA沉淀。沉淀。溶液溶液III：5NKAc60ml冰冰HAc11.5ml水水8.5ml11KAc：用用冰冰HAc把把KAc溶溶液液的的pH调调到到4.8，以以中和中和NaOH变性液，使变性液，使DNA复性。复性。高高浓浓度度KAc有有利利于于变变性性的的大大分分子子染染色色体体DNA、RNA、蛋白质、蛋白质-SDS复合物沉淀。复合物沉淀。冰冰HAc：12上清液中含有质粒上清液中含有质粒DNA。4）离心去除沉淀）离心去除沉淀135）纯化）纯化DNA酚酚-氯仿氯仿-异戊醇（异戊醇（25:24:1）抽提抽提或柱层析。或柱层析。14酚：酚：比比重重大大，能能加加速速有有机机相相与与水水相相分分层层，减减少残留在水相中的酚。少残留在水相中的酚。蛋蛋白白变变性性剂剂，进进一一步步抽抽提提DNA溶溶液液中中的的蛋白质，使蛋白质沉淀。蛋白质，使蛋白质沉淀。防止抽提时振荡起泡。防止抽提时振荡起泡。氯仿：氯仿：异戊醇异戊醇：152倍体积的倍体积的无水乙醇无水乙醇沉淀沉淀DNA。6）沉淀）沉淀DNADNA分分子子以以水水合合状状态态“溶溶于于”水水里里，乙乙醇能夺去醇能夺去DNA分子的水环境。分子的水环境。1670%乙醇洗涤乙醇洗涤DNA，干燥。，干燥。7）洗涤）洗涤8）贮存）贮存用含用含RNaseA(20 g/ml)的的TE溶解溶解DNA，贮存于，贮存于-20。17TE：由由Tris-HCl缓冲液和缓冲液和EDTA配制。配制。EDTA抑制抑制DNase，防止，防止DNA被酶降解。被酶降解。Tris-HCl不不含含金金属属离离子子（不不同同于于磷磷酸酸或或硼酸缓冲液），利于后续操作。硼酸缓冲液），利于后续操作。RNaseA：降解残留的降解残留的RNA。18许许多多公公司司研研制制出出商商品品化化质质粒粒提提取取试试剂剂盒盒，原原理理大大多多依依照照碱碱裂裂解解法法，但但在在纯纯化步骤上采用化步骤上采用柱层析柱层析。193、影响质粒、影响质粒DNA产量的因素产量的因素质质粒粒的的产产量量受受提提取取过过程程中中各各因因素素的的影影响响，但但最最重重要要的的是是菌菌株株的的遗遗传传背背景景和和质粒自身的质粒自身的拷贝数拷贝数。20一一般般使使用用endA基基因因突突变变的的E.coli菌菌株株，如如DH5、JM109等。等。1）受体菌株）受体菌株endA基基因因编编码码核核酸酸内内切切酶酶I，在在Mg2+存存在在下下，可可将将双双链链DNA消消化化为为7bp的的寡寡核核苷苷酸酸片断。片断。21是直接决定是直接决定DNA产量的重要因素之一。产量的重要因素之一。2）质粒拷贝数）质粒拷贝数3）质粒大小）质粒大小分子量大的质粒拷贝数低。分子量大的质粒拷贝数低。22常用质粒的理论产量常用质粒的理论产量pUCpGEMpBR322ColE1pSC1012.7kb2.7kb4.4kb4.5kb9.0kb500-700300-700251562.9-4.11.8-4.10.320.150.12质粒质粒分子大小分子大小拷贝数拷贝数质粒产量质粒产量（kb）（g/ml）23（二）（二）DNA的定量和纯度测定的定量和纯度测定1、紫外光谱法、紫外光谱法原原理理：基基于于DNA在在260nm波波长长处处有有特特异异的的紫紫外外吸吸收收峰峰（蛋蛋白白质质在在280nm处处有有吸吸收收峰峰），用用微微量量比比色色杯杯在在紫紫外外分分光光光光度度计直接测定。计直接测定。24在在波波长长260nm紫紫外外光光下下，1OD值值的的吸吸光光度度相当于双链相当于双链DNA浓度为浓度为50 g/ml。25纯纯DNA样品：样品：OD260/OD280=1.8OD260/OD2302.0OD260/OD2302.0：有残存的盐和小分子杂质，：有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。如核苷酸、氨基酸、酚等。OD260/OD2801.9：有：有RNA污染；污染；26原原理理：利利用用溴溴化化乙乙锭锭(EB)能能插插入入DNA分分子子中中，在在紫紫外外光光照照射射下下能能发发红红色色荧荧光光，将将其其荧荧光光强强度度与与已已知知浓浓度度的的DNA(如如DNAmarker)电电泳条带对比，可估算出泳条带对比，可估算出DNA含量。含量。2、琼脂糖凝胶电泳估计、琼脂糖凝胶电泳估计27（三）（三）DNA分子量的估计分子量的估计通通过过琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳，与与已已知知分分子子量量的的DNAmarker对比得知。对比得知。28二、核酸凝胶电泳技术二、核酸凝胶电泳技术（一）电泳的基本原理（一）电泳的基本原理生生物物大大分分子子在在一一定定pH条条件件下下，通通常常带带电电荷荷，将将其其置置于于电电场场中中，会会以以一一定定的的速速度度向向与与其其电电荷荷性性质质相相反反的的电电极极迁迁移移，迁移速度称迁移速度称电泳速率电泳速率。29摩摩擦擦系系数数与与分分子子的的大大小小、构构型型及及介介质质的粘度有关。的粘度有关。电电泳泳速速率率与与电电场场强强度度、分分子子所所带带的的净净电电荷荷数数成成正正比比，与与分分子子与与介介质质的的摩摩擦擦系系数数成反比。成反比。30在在生生理理条条件件下下，DNA分分子子糖糖-磷磷酸酸骨骨架架中中的的磷磷酸酸基基团团呈呈离离子子化化状状态态，故故DNA实实际际上上呈呈多多聚聚阴阴离离子子状状态态，在在电电场场中中向向方方向迁移。向迁移。糖糖-磷磷酸酸骨骨架架在在结结构构上上重重复复，故故等等量量的的双双链链DNA几乎带等量的净电荷。几乎带等量的净电荷。正极正极31如如电电场场强强度度一一定定、电电泳泳介介质质相相同同，电电泳泳速率就取决于核酸分子的速率就取决于核酸分子的大小大小和和构型构型。构型相似构型相似的分子：分子量越大、迁移越慢。的分子：分子量越大、迁移越慢。分子量相同分子量相同的分子的分子(如质粒如质粒)：cccDNA迁迁 移移 最最 快快、L-DNA次次 之之、ocDNA最慢。最慢。323334固体支持介质：固体支持介质：琼脂糖琼脂糖(agarose)聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺(polyarylamide)固固体体支支持持介介质质可可形形成成复复杂杂的的网网孔孔结结构构，DNA穿过这些网孔才能到达正极。穿过这些网孔才能到达正极。分分子子量量小小、结结构构致致密密的的DNA分分子子更更易易穿过网孔，泳动速度也越快。穿过网孔，泳动速度也越快。35（二）琼脂糖凝胶电泳（二）琼脂糖凝胶电泳 是是一一种种线线性性多多糖糖聚聚合合物物，从从红红色色海海藻藻产物琼脂中提取而来。产物琼脂中提取而来。琼脂糖：琼脂糖：36琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶：琼琼脂脂糖糖在在电电泳泳液液中中加加热热到到沸沸点点后后溶溶解解，冷冷却却后后凝凝固固成成均均匀匀的的胶胶体体“胨胨”，成成为很好的电泳介质。为很好的电泳介质。37琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)分离分离DNA的范围的范围(kb)0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3琼琼脂脂糖糖浓浓度度的的高高低低决决定定凝凝胶胶孔孔隙隙的的大大小小，浓度越高、孔隙越小、分辨率越高。浓度越高、孔隙越小、分辨率越高。38（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺：聚丙烯酰胺：由由丙丙烯烯酰酰胺胺和和N,N-甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺聚合而成。聚合而成。39在在过过硫硫酸酸铵铵和和TEMED存存在在时时，丙丙烯烯酰酰胺胺单单体体形形成成长长链链，由由N,N-甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺的的双双功功能能基基团团和和链链末末端端的的自自由由基基团团反反应应而而发发生生交交联联，形形成成聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺。40为中枢神经毒物，尽量避免接触和吸入为中枢神经毒物，尽量避免接触和吸入!过硫酸铵：过硫酸铵：催化过硫酸铵产生自由基，加速聚合。催化过硫酸铵产生自由基，加速聚合。丙烯酰胺丙烯酰胺和和N,N-甲叉双丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺：碱性条件下产生自由基。碱性条件下产生自由基。TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二铵四甲基乙二铵)：41聚丙烯酰胺浓度聚丙烯酰胺浓度(%)分离分离DNA的范围的范围(bp)3.51000-20005.085-5008.060-40012.040-20015.025-15020.06-100聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺浓浓度度的的高高低低决决定定凝凝胶胶孔孔隙隙的的大小，浓度越高、孔隙越小、分辨率越高。大小，浓度越高、孔隙越小、分辨率越高。42聚丙烯酰胺凝胶的优点：聚丙烯酰胺凝胶的优点：比琼脂糖凝胶的比琼脂糖凝胶的分辨率高分辨率高得多。得多。0.3-2%琼脂糖凝胶电泳分辨率：琼脂糖凝胶电泳分辨率：60,000-100bp；3.5-20%聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率：聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率：2,000-6bp。43（四）电泳缓冲液（四）电泳缓冲液Tris-乙乙酸酸（TAE）Tris-硼酸（硼酸（TBE）Tris-磷酸（磷酸（TPE）TAE价格便宜，但缓冲容量低；价格便宜，但缓冲容量低；TBE与与TPE缓缓冲冲容容量量高高，分分离离效效果果好好，但但TPE在在DNA片片段段回回收收时时含含磷磷酸酸盐盐浓浓度度高高，易易使使DNA沉淀。沉淀。推荐使用推荐使用44EDTA可螯合二价阳离子，抑制可螯合二价阳离子，抑制DNase活性，活性，防止防止DNA被降解。被降解。临用时用水稀至临用时用水稀至0.5 TBE（20倍稀释）倍稀释）10 TBE缓冲液的配制：缓冲液的配制：Tris碱碱108g硼酸硼酸Boricacid55gEDTA9.3g加加H2O至至1L（调（调PH为为8.0-8.2）45（五）核酸电泳的指示剂与染色剂（五）核酸电泳的指示剂与染色剂1、指示剂：、指示剂：常常用用溴溴酚酚兰兰，在在碱碱性性液液体体中中呈呈紫紫兰兰色色，在在0.6%、1%、1.4%和和2%琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中，迁迁移移率率分分别别与与1kb、0.6kb、0.2kb和和0.15kb的双链线性的双链线性DNA片段大致相同。片段大致相同。46使样品呈色，便于加样操作；使样品呈色，便于加样操作；指示剂与蔗糖、甘油组成指示剂与蔗糖、甘油组成加样缓冲液加样缓冲液。增加样品比重，确保增加样品比重，确保DNA均匀沉入加样孔；均匀沉入加样孔；在在电电泳泳中中形形成成肉肉眼眼可可见见的的指指示示带带，可可预预测测DNA电泳的速度和位置。电泳的速度和位置。加样缓冲液的加样缓冲液的作用作用：47482、染色剂：、染色剂：核酸电泳后，需经染色才能显出带型。核酸电泳后，需经染色才能显出带型。溴化乙锭染色法溴化乙锭染色法银染色法银染色法49溴溴化化乙乙锭锭(ethidiumbromide,EB)能能插插入入到到DNA分分子子的的相相邻邻碱碱基基之之间间，并并在在300nm波波长长的的紫紫外外光光照照射射下下发发出出红红色色荧光。荧光。1）溴化乙锭染色法：）溴化乙锭染色法：50可可将将EB直直接接加加到到凝凝胶胶介介质质中中（终终浓浓度度0.5 g/ml）；也也可可在在电电泳泳后后，将将凝凝胶胶浸浸入入该浓度的溶液中染色该浓度的溶液中染色10-15min。EB与与DNA分分子子结结合合，而而不不与与凝凝胶胶结结合合，DNA分子吸收分子吸收EB并发出荧光。并发出荧光。51琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶EB染染色色后后，在在紫紫外外光光下下观观察察，可检测出可检测出50ng的的DNA。在在适适当当染染色色条条件件下下，荧荧光光强强度度与与DNA片片段段的数量成正比。的数量成正比。522、银染色法：、银染色法：Ag+可可与与核核酸酸形形成成稳稳定定的的复复合合物物，用用还还原原剂剂(如如甲甲醛醛)使使Ag+还还原原成成银银颗颗粒粒，可可将将电电泳泳条条带带染染成成黑黑褐褐色色，用用于于聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶染色。胶染色。优点：优点：灵敏度比灵敏度比EB高高200倍倍。缺点：缺点：银染色后，银染色后，DNA不宜回收。不宜回收。53聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染结果聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染结果银染银染10min银染银染15min54三、核酸分子杂交技术三、核酸分子杂交技术1968年年，华华盛盛顿顿卡卡内内基基学学院院的的RoyBritten及其同事发明。及其同事发明。目的：目的：用特异探针鉴定复杂靶用特异探针鉴定复杂靶DNA中的同源片段。中的同源片段。55DNA与与DNA杂交：杂交：A=T、GC DNA与与RNA杂杂交：交：A=U、GC依据：依据：碱基互补、变性和复性碱基互补、变性和复性随温度逐渐降低，变性的两条单链重新随温度逐渐降低，变性的两条单链重新形成互补双链。形成互补双链。在高温下，核酸双链解为两条单链；在高温下，核酸双链解为两条单链；碱基互补碱基互补变性：变性：复性：复性：56利利用用核核酸酸双双链链的的碱碱基基互互补补、变变性性和和复复性性的的原原理理，用用已已知知碱碱基基序序列列的的单单链链核核酸酸片片段段作作为为探探针针(probe)，与与待待测测样样本本中中的的单单链链核核酸酸互互补补配配对对，以判断有无互补同源核酸序列的存在。以判断有无互补同源核酸序列的存在。57（一）核酸探针（一）核酸探针指指一一段段带带有有检检测测标标记记、与与目目的的DNA片段特异互补、已知序列的核酸片段。片段特异互补、已知序列的核酸片段。探针长度一般以探针长度一般以50-300bp为宜。为宜。58核酸探针的种类：核酸探针的种类：放射性探针放射性探针非放射性探针非放射性探针根据核酸性质不同，分为：根据核酸性质不同，分为：RNA探针探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针DNA探针探针cDNA探针探针根据标记方法不同，分为：根据标记方法不同，分为：59寡核苷酸探针寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe)简并简并探针组成的寡核苷酸探针库探针组成的寡核苷酸探针库6个个氨基酸连续序列氨基酸连续序列倒倒推基因序列推基因序列人工合成人工合成单一单一已知序列的寡核苷酸探针已知序列的寡核苷酸探针已知序列已知序列人工合成人工合成60根根据据生生物物体体对对简简并并密密码码子子的的偏偏爱爱性性，合合成成系系列列探针；探针；简并探针的设计依据：简并探针的设计依据：参参考考生生物物体体EST(expressedsequencetag)数数据据库，进行库，进行倾向性倾向性简并序列设计。简并序列设计。EST：对对一一个个随随机机选选择择的的cDNA克克隆隆，进进行行5端端和和3端端单单一一次次测测序序，获获得得的的cDNA部部分分序序列列，代代表表一一个个完完整基因的一小部分，平均长度整基因的一小部分，平均长度360120bp。61寡核酸探针的优点：寡核酸探针的优点：序列短，杂交速度快、特异性强；序列短，杂交速度快、特异性强；可在短时间内大量制备；可在短时间内大量制备；可在合成中进行标记；可在合成中进行标记；可可合合成成单单链链探探针针，避避免免双双链链探探针针在在杂杂交交中中自我复性，提高杂交效率；自我复性，提高杂交效率；可检测靶序列内可检测靶序列内1个碱基的变化。个碱基的变化。62寡核苷酸探针的设计原则：寡核苷酸探针的设计原则：长度长度18-50bp；分子内部不含互补区；分子内部不含互补区；GACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGC AG+C含量含量40-60%；避免同一碱基连续出现（不能多于避免同一碱基连续出现（不能多于4个）个）；与非靶序列与非靶序列70%以上同源性、或连续以上同源性、或连续8个以上个以上碱基序列相同，最好不用。碱基序列相同，最好不用。631、标记物的种类：、标记物的种类：前者更敏感，但后者保存时间较长，无前者更敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。同位素污染。非放射性：非放射性：生物素、地高辛、荧光素等。生物素、地高辛、荧光素等。放射性：放射性：32P、35S、125I等；等；（二）核酸探针的标记（二）核酸探针的标记64缺刻平移法缺刻平移法随机引物延伸法随机引物延伸法反转录标记法反转录标记法末端标记法末端标记法2、探针标记方法：、探针标记方法：1）放射性同位素标记：）放射性同位素标记：655G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C51）Klenow酶介导的酶介导的3末端标记法：末端标记法：KlenowdNTPs（-32P-dATP）5G-C-T-G-A-A-T-TA-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-AT-T-A-A-G-C-T-C5末端标记法末端标记法665335AA-32P-ddATPTdT552）TdT介导的介导的3末端标记法：末端标记法：673）T4-PNP介导的介导的5末端标记法：末端标记法：5P3HOOH3P55HO3HOOH3OH5CIPT4-PNP-32P-ATP5P3HOOH3P5682）非放射性同位素标记：）非放射性同位素标记：酶促反应标记法酶促反应标记法化学修饰标记法化学修饰标记法69将将标标记记物物预预先先标标记记在在核核苷苷酸酸分分子子上上，再再利利用酶促反应，将标记的核苷酸掺入探针中。用酶促反应，将标记的核苷酸掺入探针中。酶促反应标记法酶促反应标记法1）标记物标记物-dUTP的生成；的生成；（如（如Bio-11-dUTP、Dig-11-dUTP）2）将标记物）将标记物-dUTP作为作为DNApolI的底物，的底物，掺入掺入DNA分子中。分子中。70Bio-11-dUTP：生物素生物素(Biotin)Biotin与与dUTP之间连接臂的碳链长度。之间连接臂的碳链长度。11：Bio：广广泛泛存存在在于于各各种种组组织织中中，若若样样品品本本身身含含内源性生物素，会对结果产生干扰。内源性生物素，会对结果产生干扰。71Dig-11-dUTP：地高辛地高辛(digoxigenin)；Dig：洋洋地地黄黄植植物物的的花花和和叶叶是是Dig在在自自然然界界中中的的唯唯一一来来源源，抗抗Dig抗抗体体不不会会与与其其他他生生物物物物质质结结合，可满足合，可满足特异性特异性标记的需要。标记的需要。从洋地黄植物中提取的类固醇物质。从洋地黄植物中提取的类固醇物质。72地高辛系统标记：地高辛系统标记：DIG-11-dUTPDIG抗体抗体-显色酶显色酶交联复合物交联复合物73化学修饰标记法化学修饰标记法利利用用标标记记物物分分子子上上的的活活性性基基团团与与探探针针分分子子上上的的基基团团发发生生的的化化学学反反应应，将将标标记记物物直接结合直接结合到探针分子上。到探针分子上。74ABC荧光标记荧光标记：荧光胺荧光胺Avidin链亲和素链亲和素GCTTGAGCAGTAACCTGBiotin生物素生物素烷烃连接臂烷烃连接臂ABC：AvidinBiotinComplex75ABC显色酶标记：显色酶标记：GCTTGAGCAGTAACCTGBiotin生物素生物素烷烃连接臂烷烃连接臂显色酶显色酶生色底物生色底物颜色产物颜色产物Avidin链亲和素链亲和素ABC：AvidinBiotinComplex76（三）核酸分子杂交的分类（三）核酸分子杂交的分类待待测测核核酸酸样样本本先先结结合合到到固固相相支支持持物物（硝硝硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜、尼尼龙龙膜膜等等）上上，再再与与溶溶液液中中的特异性探针进行杂交反应。的特异性探针进行杂交反应。待待测测核核酸酸样样本本与与特特异异性性探探针针同同时时溶溶于于杂杂交液中进行杂交反应。交液中进行杂交反应。液相杂交：液相杂交：固相杂交：固相杂交：77液液相相核核酸酸分分子子杂杂交交78固相核酸分子杂交固相核酸分子杂交制备待测核酸制备待测核酸样品样品制备核酸制备核酸探针探针分离、变性、转印、固定分离、变性、转印、固定与杂交液预杂交与杂交液预杂交标记标记漂洗去除未参与杂交的标记探针漂洗去除未参与杂交的标记探针检测杂交信号检测杂交信号杂交杂交加入标记核酸探针加入标记核酸探针预预杂杂交交：消消除除膜膜对对探探针针的的非非特特异异性性结结合合，降降低低杂交背景。杂交背景。79Southern印迹杂交印迹杂交Northern印迹杂交印迹杂交斑点杂交斑点杂交/狭缝杂交狭缝杂交菌落杂交菌落杂交夹心杂交夹心杂交原位杂交原位杂交常用固相核酸杂交方法常用固相核酸杂交方法801、Southern印迹杂交印迹杂交是是将将DNA分分子子从从电电泳泳凝凝胶胶转转印印到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，进进行行核核酸酸杂杂交交的的一一种种实实验验方法。方法。1975年年，由由英英国国爱爱丁丁堡堡大大学学的的EdwenSouthern创建，故称创建，故称Southernblot。81提提取取DNA样样本本限限制制酶酶酶酶切切琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离NaOH变变性性DNA转转印印至至膜膜上上预预杂杂交交标标记记探探针针与与之之杂杂交交放放射射自自显显影影或显色反应或显色反应检测杂交信号检测杂交信号结果分析。结果分析。Southernblot的基本过程：的基本过程：用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品样品。8283水水稻稻叶叶绿绿体体DNA分分别别用用BglII(A-C)、BamHI(D-F)、EcoRI(G-I)、HindIII(J-L)消消化化，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离，然然后后与与32P标标记记的的玉玉米米psbA探探针针Southern杂杂交交，X光底片中显现阳性条带，表明含玉米光底片中显现阳性条带，表明含玉米psbA基因序列。基因序列。842、Northern印迹杂交印迹杂交1979年年，J.C.Alwine等等人人发发展展而而来来，是是将将RNA分分子子从从电电泳泳凝凝胶胶转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，进行核酸杂交的一种实验方法。进行核酸杂交的一种实验方法。方方法法与与Southernblot类类似似，故故称称Northern印迹杂交（印迹杂交（Northernblot）。）。85提提取取RNA样样本本RNA变变性性琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离转转印印至至膜膜上上预预杂杂交交标标记记探探针针与与之之杂杂交交放放射射自自显显影影或或显显色色反反应应检检测测杂杂交信号交信号结果分析。结果分析。Northernblotting的基本过程：的基本过程：用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测RNA样品样品。86873、斑点杂交、斑点杂交/狭缝杂交狭缝杂交（spot/slotblothybridization）基本过程：基本过程：将将变变性性的的DNA或或RNA直直接接点点到到膜膜上上，或或通通过过一一个个长长形形狭狭缝缝转转印印至至膜膜上上膜膜变变性性预预杂杂交交标标记记探探针针与与之之杂杂交交放放射射自自显显影影或或显色反应显色反应检测杂交信号检测杂交信号结果分析。结果分析。88DNA样品样品使使用用特特殊殊设设计计的的加加样样装装置置，可可使使众众多多待待测测样样品品一一次次同同步步转转印印至至杂杂交交膜膜上上，并并有有规规律律地地排排列列成成点阵或线阵。点阵或线阵。点样点样Probe-32P检测检测AB123489简便、快速、灵敏、样本用量少。简便、快速、灵敏、样本用量少。特异性不高，有一定比例的假阳性。特异性不高，有一定比例的假阳性。优点：优点：缺点：缺点：90AB固固相相支支持持物物固相吸附探针固相吸附探针标记检测探针标记检测探针需需两两个个靠靠近近且且不不重重叠叠的的探探针针，一一个个作作固相吸附探针，另一个作标记检测探针。固相吸附探针，另一个作标记检测探针。4、夹心杂交、夹心杂交(sanwichhybridization)91优点：优点：样样品品不不需需固固定定，对对粗粗制制样样品品即即能能做做出出可靠的检测。可靠的检测。特特异异性性强强，只只有有两两个个探探针针都都杂杂交交时时，才能产生可检测的信号；才能产生可检测的信号；92注意：注意：为为避避免免产产生生高高本本底底信信号号，两两探探针针必必须须分分别别克克隆隆入入两两个个非非同同源源载载体体内内，如如一一个克隆入个克隆入PUC19，另一克隆入，另一克隆入pBR322。935、菌落杂交、菌落杂交(colonyhybridization)基本过程：基本过程：将将菌菌落落从从平平板板转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上裂裂解解菌菌落落、释释放放DNA将将DNA烘烘干干固固定定于于膜膜上上标标记记的的探探针针与与之之杂杂交交放放射射自自显显影影检检测杂交信号测杂交信号与平板上的菌落对位。与平板上的菌落对位。94用用于于从从大大量量菌菌落落中中筛筛选选含含特特异异DNA序序列列的的目的重组子。目的重组子。956、原位杂交、原位杂交(insituhybridization,ISH)是是一一种种可可在在细细胞胞涂涂片片、组组织织切切片片以以及及分分裂裂中中期期染染色色体体带带中中检检测测DNA或或RNA的的技技术术，可可对对组组织织细细胞胞原原位位的的待待测测核核酸酸分分子子进进行定性、定量及定位分析。行定性、定量及定位分析。96优点：优点：不不需需提提取取核核酸酸，可可完完整整保保持持组组织织或或细细胞胞的的形态，更准确地反映组织细胞的功能状态。形态，更准确地反映组织细胞的功能状态。FISH检测检测HER-2基因在基因在乳腺癌组织中的表达乳腺癌组织中的表达FISH检测慢性粒细胞白血病的检测慢性粒细胞白血病的费城染色体费城染色体(22和和9号染色体异位号染色体异位)97是是利利用用耐耐热热DNA聚聚合合酶酶的的反反复复作作用用，通通过过变变性性-退退火火-延延伸伸的的循循环环操操作作，在在体体外外迅迅速速将将DNA模模板板扩扩增增数数百百万万倍倍的的一一种种操操作作技术。技术。四、聚合酶链反应技术四、聚合酶链反应技术（polymerasechainreaction,PCR）981、模板、模板:（一）（一）PCR反应系统的组成反应系统的组成 无论哪种无论哪种DNA，都要有较高的，都要有较高的纯度纯度。质粒质粒-DNA染色体染色体DNA大小大小较小较小较大较大非常大非常大目的基因单拷贝目的基因单拷贝变性变性易易较难较难难难用量用量lng300-500ng可以是可以是DNA或或RNA。99mRNAcDNAPCR，称为，称为RT-PCR。逆转录逆转录RNA作为模板时，需要：作为模板时，需要：RT-PCR：ReverseTranscriptionPCR100是是根根据据模模板板DNA待待扩扩增增区区两两端端的的序序列列而而设设计计的的一一对对寡寡核核苷苷酸酸小小片片断断，长长度度一一般般为为15-30bp，最多不超过最多不超过50bp。3、引物、引物2、TaqDNA聚合酶聚合酶101引物设计的原则：引物设计的原则：长度适宜，一般长度适宜，一般15-30bp；G+C含量含量40-60；4种碱基应随机分布；种碱基应随机分布；内部不应存在互补序列；内部不应存在互补序列；两条引物之间不应有多于两条引物之间不应有多于4个碱基的互补；个碱基的互补；3端不应有任何修饰；端不应有任何修饰；5端可修饰，如端可修饰，如32P、生物素、荧光素。、生物素、荧光素。102上游引物上游引物5端：端：起始起始密码子密码子ATG；注意：注意：下游引物下游引物5端：端：终止终止密码子密码子TAA、TAG或或TGA；上、下游引物上、下游引物5端：端：限制酶限制酶识别序列及其保护碱基。识别序列及其保护碱基。1035GGAATTCCCTATGACCCAG3不同限制酶需保护碱基的数量不同，如：不同限制酶需保护碱基的数量不同，如：EcoRI1HindIII3 BamHI2-3 PstI4保护碱基数量不合适，会影响限制酶酶切。保护碱基数量不合适，会影响限制酶酶切。保护碱基保护碱基1044、dNTPs 终浓度：终浓度：50 mol/L，4种种dNTPs浓度应相等。浓度应相等。注意：注意：不稳定，保存时间长会失效不稳定，保存时间长会失效.1051）不同的酶需不同）不同的酶需不同Mg2+：5、Mg2+：Taq酶：酶：0.5-1.5mM；pfu酶：酶：2-3mM；dNTP、引物用量约增加、引物用量约增加1倍。倍。106EDTA鳌合鳌合Mg2+；选择低浓度选择低浓度TE(10mMTris,1mMEDTA)；如扩增效率不理想，注意调整如扩增效率不理想，注意调整Mg2+浓度！浓度！2）外界影响：）外界影响：DNA模板、引物、模板、引物、dNTPs的磷酸基团均可的磷酸基团均可结合结合Mg2+。107模板模板DNA0.1-2 g引物引物各各10-100pmolTaq酶酶2.5U4种种dNTP混合物混合物各各200 mol/LMg2+1.5mmol/LddH2O标准的标准的PCR反应体系：反应体系：100 L1081、变性温度：、变性温度：（二）（二）PCR参数参数94-95，一般，一般30-45sec。模模板板DNA完完全全变变性性对对RCR能能否否成成功功至关重要。至关重要。可可95加热加热3-5min预变性预变性。1092、退火温度：、退火温度：Tm：50的的引引物物和和互互补补序序列列表表现现为为双双链链DNA分子时的温度，为退火温度的参考依据。分子时的温度，为退火温度的参考依据。Tm=4(G+C)+2(A+T)退火温度介于退火温度介于55-72之间，一般选择之间，一般选择Tm-5；选择较高的退火温度，可减少引物与模板选择较高的退火温度，可减少引物与模板非特异性结合，提高非特异性结合，提高PCR的的特异性特异性。1103、延伸温度：、延伸温度：72，一般一般40-60sec。72时时，Taq酶酶处处于于最最高高的的活活力力状状态态，反应速率约反应速率约35-100nt/s。延延伸伸时时间间视视扩扩增增片片段段的的长长短短而而定定，如如扩增扩增1-2kb的的PCR产物，延伸产物，延伸1min已足够。已足够。1114、循环次数、循环次数取决于模板浓度，一般选择取决于模板浓度，一般选择30次。次。分分析析性性PCR一一般般25-30次次，制制备备性性PCR一一般般30-35次，不超过次，不超过40次。次。循循环环次次数数太太多多会会使使非特异性产物增加。非特异性产物增加。112常采用的常采用的PCR条件：条件：95变性变性30sec55退火退火30sec72延伸延伸1min30-35cycles72保温保温10min95预变性预变性5min4终止终止forever113五、五、DNA序列分析技术序列分析技术目前用于测序的主要技术：目前用于测序的主要技术：双脱氧链末端终止法双脱氧链末端终止法化学降解法化学降解法114双脱氧链末端终止法双脱氧链末端终止法1977年，英国剑桥大学年，英国剑桥大学FrederickSanger发明。发明。1）在在单单链链模模板板、引引物物、4种种dNTPs存存在在时时，Klenow酶酶能能不不断断地地将将dNTP加加到到引引物物3-OH末末端，合成出与单链模板互补的新链。端，合成出与单链模板互补的新链。基本原理：基本原理：1152）Klenow酶酶还还能能以以ddNTP作作为为底底物物，使使之之掺掺入入正正在在延延伸伸的的DNA链链中中，但但因因ddNTP缺缺少少3-OH，无无法法和和下下一一个个核核苷苷酸酸之之间间形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键，故故在在ddNTP掺入位置，链延长终止。掺入位置，链延长终止。脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（dNTP）双脱氧双脱氧核苷三磷酸（核苷三磷酸（ddNTP）116双脱氧末端终止测序法的基本操作：双脱氧末端终止测序法的基本操作：ACGTssDNAssDNAssDNAssDNAPrimerPrimerPrimerPrimerKlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsddATPddCTPddGTPddTTPDNA聚合反应聚合反应-32P-dATP-32P-dATP-32P-dATP-32P-dATP117OH35PKlenowTdNTPs+-32P-dATP+ddATPTTTTTOH35PDNA聚合反应聚合反应AG TC聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳5GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA31181191203730全自动测序仪全自动测序仪121