miRNA及SiRNA.ppt

miRNA及及SiRNA前言前言n n近些年来，人类发现了许多不同种类的RNA分子，其中最为重要的是小RNA分子的发现。n n有些小RNA分子 能直接调控某些基因的开关从而控制细胞的生长发育并决定细胞分化的组织类型，对探索生物进化及防治人类疾病具有重要的意义。RNA的分类 细胞和和胞液 线粒体 功能核蛋白体RNA rRNA mt rRNA 核蛋白体组成成分信使RNA mRNA mt mRNA 蛋白质合成模板转运RNA tRNA mt tRNA 转运氨基酸不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前体小核RNA snRNA 参与hnRNA的剪接、转运小胞浆RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位合成的 信号识别体的组成成分 小小小小RNARNA分子本身又包含了若干类分子本身又包含了若干类分子本身又包含了若干类分子本身又包含了若干类RNARNA，根据小，根据小，根据小，根据小 RNA RNA 的生成、结构和功能大约可分为以下三类：的生成、结构和功能大约可分为以下三类：的生成、结构和功能大约可分为以下三类：的生成、结构和功能大约可分为以下三类：n na miRNA （microRNA)n nb siRNA (short interfering RNA)n nc 其他小RNAWhat are microRNAs？（？（1）n n19931993年，年，LeeLee等在秀丽新小杆线虫（等在秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis Caenorhabditis eleganelegan）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因基因lin-4lin-4；n nmiRNAmiRNA是是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的编码蛋白质的RNARNA家族，它们是由家族，它们是由19-2519-25个核苷酸组个核苷酸组成的单链成的单链RNARNA（3 3端可有端可有1212个碱基长度的变化）；个碱基长度的变化）；n nmiRNAmiRNA的表达具有组织特异性和阶段特异性。即：的表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不同组织中表达有不同类型的在不同组织中表达有不同类型的miRNAmiRNA，在生物发，在生物发育的不同阶段里有不同的育的不同阶段里有不同的miRNAmiRNA表达；表达；What are microRNAs？（？（2）n n miRNA miRNA具有具有高度保守性高度保守性高度保守性高度保守性，即各种，即各种miRNAmiRNA都能在其他种都能在其他种系中找到同源体；系中找到同源体；n n miRNA miRNA独有的特征：独有的特征：其其5 5端第一个碱基对端第一个碱基对U U有强烈的倾向性，而对有强烈的倾向性，而对GG却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U U，一般来讲，除第四个碱基外，其他，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏位置碱基通常都缺乏C C n n miRNA miRNA执行一定的执行一定的生物学功能生物学功能生物学功能生物学功能：对与其互补的对与其互补的mRNAmRNA表达水平具有调节作用；表达水平具有调节作用；一些偏大的一些偏大的miRNAmiRNA可能参与了基因组的重组装（可能参与了基因组的重组装（27nt27nt）；）；miRNA的成熟的成熟n n据体内外实验研究表明miRNA的生成至少需要两个步骤：1）由长的内源性转录本（pri-miRNA)生成70nt左右的miRNA前体（pre-miRNA)，该过程发生在细胞核;2)将pre-miRNA加工为成熟miRNA，该过程发生在细胞质中。Pre-miRNAn nPre-miRNA Pre-miRNA Pre-miRNA Pre-miRNA 是由内源性是由内源性基因间区或内含子的基因间区或内含子的DNADNA反向重复序列转录反向重复序列转录而来而来,它是一种长约它是一种长约70nt70nt的非编码的非编码RNA,RNA,具有茎具有茎-环结构也即发夹状结构。环结构也即发夹状结构。n nPre-miRNAPre-miRNA在在DicerDicer的作的作用下可被剪切成用下可被剪切成miRNAmiRNAn nmiRNA miRNA 只是只是pre-miRNA pre-miRNA 茎中的一个臂茎中的一个臂miRNA与靶与靶mRNA的作用模式：的作用模式：n n1 1）二者不完全互补，即二者不完全时配对结合时，）二者不完全互补，即二者不完全时配对结合时，主要影响翻译过程而对主要影响翻译过程而对mRNAmRNA的稳定性无任何影的稳定性无任何影响。如线虫的响。如线虫的lin-4lin-4n n2 2）二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似）二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似siRNAsiRNA与靶与靶mRNAmRNA的结合，特异性的切割的结合，特异性的切割mRNAmRNA。如如miR39/miR171miR39/miR171n n3 3）上述两种模式均具备。当其与靶）上述两种模式均具备。当其与靶mRNAmRNA完全互完全互补配对时，直接靶向切割补配对时，直接靶向切割mRNAmRNA，而不完全互补，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。如配对时起调节基因翻译的作用。如let-7 let-7 果蝇果蝇/线虫线虫miRNA与与siRNA的区别的区别：miRNA 产生：细胞内RNA的固有组 分之一（正常）来源：内源转录本直接来源：发夹状pre-miRNA 结构：单链互补性：不完全互补，存在 错配现象对靶RNA特异性：相对较低，一个 突变不影响miRNA的 的效应途径 ：miRNA途径对RNA的影响：在RNA代谢的 各个 层面进行调控功能：调节内源基因的表达 在蛋白质合成水平发挥作用，与mRNA的稳定性无关 siRNA RNAi的活性形式，病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生（异常）转基因或病毒（外源）长dsRNA 双链，3端有2个非配对碱基，通常为UU 完全互补 较高，一个突变即引起RNAi 沉默效应的改变 RNAi途径 降解靶mRNA 抑制转座子活性和病毒感染 在转录后水平发挥作用，影 响mRNA的稳定性 miRNA与与siRNA的联系：的联系：n n均为均为DicerDicer的产物：长度均为的产物：长度均为22nt22nt左右左右 5 5端是磷酸基端是磷酸基 3 3端是羟基端是羟基n n均需均需ArgonauteArgonaute家族蛋白的存在家族蛋白的存在 同为同为RISCRISC的组分的组分n n二者进化关系上可能的两种推论：二者进化关系上可能的两种推论：siRNA siRNA是是miRNAmiRNA的补充的补充 miRNA miRNA在进化过程中替代了在进化过程中替代了siRNAsiRNA沉默机制有重叠miRNA的分析手段的分析手段 miRNA的表达检测技术近年来得到了迅速的发展，不仅包括传统的表达文库克隆、Northern blot和荧光定量PCR,还包括新近发展起来的基因芯片技术、克隆和测序法等，而最常用且有效的检测方法便是实时荧光定量PCR法。n n所谓实时荧光定量所谓实时荧光定量PCRPCR技术，是指在技术，是指在PCRPCR反应体系反应体系中加入荧光基团，利用荧光光信号积累实时监测中加入荧光基团，利用荧光光信号积累实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。行定量分析的方法。n n实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术于技术于19961996年由美国年由美国Applied Applied BiosystemsBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了公司推出，由于该技术不仅实现了PCRPCR从定性到定量的飞跃，而且与常规从定性到定量的飞跃，而且与常规PCRPCR相比。它相比。它具有特异性更强、有效解决具有特异性更强、有效解决PCRPCR污染问题、自动污染问题、自动化程度高等特点，相比于其他方法，此法在检测化程度高等特点，相比于其他方法，此法在检测miRNAmiRNA上更具优越性。所以实时荧光定量上更具优越性。所以实时荧光定量PCRPCR法法是目前应用最广泛最常用且有效的检测方法。是目前应用最广泛最常用且有效的检测方法。实时荧光定量实时荧光定量PCR检测检测miRNAn n 这是一项用于检测特异性这是一项用于检测特异性RNARNA的技术，的技术，RNARNA混合混合物首先按照它们的大小和相对分子量通过变性琼物首先按照它们的大小和相对分子量通过变性琼脂糖凝胶加以分离，凝胶分离后的脂糖凝胶加以分离，凝胶分离后的RNARNA通过通过southernsouthern印迹转移到尼龙膜或销酸纤维素膜上，再印迹转移到尼龙膜或销酸纤维素膜上，再与标记的探针进行杂交反应，通过杂交结果分析与标记的探针进行杂交反应，通过杂交结果分析可以对转录表达进行定量或定性。它是研究基因可以对转录表达进行定量或定性。它是研究基因表达的有效手段。表达的有效手段。n nNorthernNorthern分析的过程涉及大量人工操作，并且每分析的过程涉及大量人工操作，并且每次仅有一条次仅有一条miRNAmiRNA探针与一个探针与一个RNARNA印迹杂交，因印迹杂交，因此，它适用于不适用于大规模的筛选实验。此，它适用于不适用于大规模的筛选实验。Northern blot杂交检测杂交检测miRNA基于荧光标记的基因芯片技术检测基于荧光标记的基因芯片技术检测miRNAn n基因芯片基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)(Gene Chip,DNA Chip)，又称，又称DNADNA微阵列微阵列(DNA Micorarray)(DNA Micorarray)，的原理是一种杂交测序方法。即，的原理是一种杂交测序方法。即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法：在一块芯片表面固定了序列已知的核测定的方法：在一块芯片表面固定了序列已知的核苷酸的探针，当带有荧光标记的核酸序列苷酸的探针，当带有荧光标记的核酸序列microRNAmicroRNA，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，据此可重组出靶核酸的序列完全互补的探针序列，据此可重组出靶核酸的序列。序列。n n常用检测方式是将反义常用检测方式是将反义DNADNA探针固定在芯片上，通探针固定在芯片上，通过与过与5 5端标记有荧光分子的端标记有荧光分子的miRNAmiRNA杂交进行检测。杂交进行检测。n n此法在高通量检测上具有不可替代的作用，但是在此法在高通量检测上具有不可替代的作用，但是在灵敏度特异度等方面还是不及灵敏度特异度等方面还是不及RT-PCRRT-PCR。miRNA检测的临床应用检测的临床应用一、miRNA检测在肿瘤诊断中的应用n n癌症是威胁人类和动物健康与生命最严重的疾病之一，miRNA的表达在不同的癌症以及癌症的不同阶段表现出显著差异，在许多癌症的早期阶段和进展中起关键作用。n n研究表明，miRNA既作为抑癌基因参与控制恶性肿瘤的形成，又作为诱癌基因参与恶性肿瘤的发生和发育。miRNA检测在肿瘤诊断中的应用举例检测在肿瘤诊断中的应用举例n nbcl-2bcl-2是一个抗调亡基因，在白血病和淋巴瘤等多种肿瘤是一个抗调亡基因，在白血病和淋巴瘤等多种肿瘤中过量表达，中过量表达，miR-15amiR-15a和和miR-16-lmiR-16-l负调控负调控bcl-2bcl-2，如果这两，如果这两种种miRNAmiRNA缺失或下调，则会导致缺失或下调，则会导致bcl-2bcl-2表达升高，促进白表达升高，促进白血病和淋巴瘤的发生、发展。血病和淋巴瘤的发生、发展。n nmiR-143miR-143和和miR-145miR-145对肿瘤有抑制作用，在结肠癌、直肠对肿瘤有抑制作用，在结肠癌、直肠癌等细胞系中其表达量相对正常细胞明显下调；相反的，癌等细胞系中其表达量相对正常细胞明显下调；相反的，rniR-155rniR-155在霍奇金淋巴瘤和在霍奇金淋巴瘤和BurkittBurkitt淋巴瘤中均高表达，而淋巴瘤中均高表达，而在非霍奇金淋巴瘤中几乎没有发现它的表达；在非霍奇金淋巴瘤中几乎没有发现它的表达；n n另外，乳腺癌中另外，乳腺癌中miR-155miR-155和和miR-21miR-21的表达量显著上调。的表达量显著上调。n n因此可将因此可将miRNAmiRNA作为生物标记应用于肿瘤的前期诊断。作为生物标记应用于肿瘤的前期诊断。n nmiRNA检测在心血管系统诊断中的应用（略）n nmiRNA检测在神经系统疾病诊断中的应用（略）miRNA是基因表达和蛋白翻译过程中的调节是基因表达和蛋白翻译过程中的调节分子，在肿瘤的发生过程中起到调控的枢纽作用，分子，在肿瘤的发生过程中起到调控的枢纽作用，因此把因此把miRNA作为肿瘤生物治疗的靶分子将比作为肿瘤生物治疗的靶分子将比编码基因作为靶分子更加有效。编码基因作为靶分子更加有效。miRNA检测的临床应用（检测的临床应用（2）n nmiRNAmiRNA的检测可以血清为标本进行，具有无创伤、可重复、的检测可以血清为标本进行，具有无创伤、可重复、可于同一时间点进行检测多项指标等优点。可于同一时间点进行检测多项指标等优点。n nLawrieLawrie等首次对血清等首次对血清miRNAmiRNA作出研究，发现作出研究，发现miR-21miR-21在血清中在血清中表达，且其表达水平与弥散性表达，且其表达水平与弥散性B B细胞淋巴瘤患者的存活率密细胞淋巴瘤患者的存活率密切相关。切相关。n nMitchellMitchell等发现等发现miR-141miR-141在在2525例前列腺癌症患者血清中均高表例前列腺癌症患者血清中均高表达，且与前列腺特异性抗原（达，且与前列腺特异性抗原（PSA)PSA)的表达水平有一定的关系，的表达水平有一定的关系，并经实验证实血清中的并经实验证实血清中的miR-141miR-141来源于肿瘤，与细胞碎片无来源于肿瘤，与细胞碎片无关。关。n n另外，卵巢癌患者的血液中另外，卵巢癌患者的血液中miR-21miR-21、miR-92miR-92、miR-93miR-93、miR-miR-126126和和miR-29amiR-29a与正常人相比明显呈现高表达。与正常人相比明显呈现高表达。n n除血清外，其它体液也可用于除血清外，其它体液也可用于miRNAmiRNA的研究，发现利用定量的研究，发现利用定量逆转录逆转录-聚合酶链反应（聚合酶链反应（Qrt-PCR)Qrt-PCR)技术可以对尿液、唾液、羊技术可以对尿液、唾液、羊水及胸水中的水及胸水中的miRNAmiRNA进行定量，为研究进行定量，为研究miRNAmiRNA开辟了新的途开辟了新的途径。径。以血清为标本进行以血清为标本进行miRNA检测的意义检测的意义小结小结n n 从前述的诸多信息，我们可以得出一个结论，从前述的诸多信息，我们可以得出一个结论，那就是那就是RNARNA不再只是作为不再只是作为DNADNA与蛋白质之间的中与蛋白质之间的中介发挥作用，而是参与到了基因的表达调控、介发挥作用，而是参与到了基因的表达调控、RNARNA的定点修饰，以及染色体的结构组织等各个的定点修饰，以及染色体的结构组织等各个方面。方面。n n 短短几年内短短几年内miRNAmiRNA研究的迅速突破，不只是研究的迅速突破，不只是RNARNA研究的一个新突破，更是为人们提供了一种研究的一个新突破，更是为人们提供了一种全新的认识基因和基因表达调节本质的角度，同全新的认识基因和基因表达调节本质的角度，同时也使人们开始注意时也使人们开始注意miRNAmiRNA在疾病发生过程中所在疾病发生过程中所扮演角色。扮演角色。不同亚型肺癌患者组织及血浆中不同亚型肺癌患者组织及血浆中miRNA肿瘤标记物的发现及验证肿瘤标记物的发现及验证复旦大学附属肿瘤医院（博士生：卢韶华）研究生科研举例：研究生科研举例：第一部分：不同亚型肺癌患者组织第一部分：不同亚型肺癌患者组织及组织中及组织中miRNA肿瘤标记物的发现肿瘤标记物的发现一、标本及组织学分类 收集复旦大学附属中山医院2007-2009年期间存档的肺癌冰冻新鲜组织标本136例，包括肺不典型腺瘤样增生9例，支气管肺泡细胞癌11例，腺癌26例，鳞癌30例及小细胞癌20例，相应的正常肺组织44例(距离癌组织至少10cm)。二、组织制备及激光捕获显微切割(l)(l)手术离体组织切成约手术离体组织切成约1cm x 1cm x 0.5cm1cm x 1cm x 0.5cm大小的组织大小的组织块后，立即用块后，立即用OCTOCT包埋，用液氮快速冰冻，并存放包埋，用液氮快速冰冻，并存放入入-80-80冰箱以待用。冰箱以待用。(2)(2)每块组织连续切片，切片厚度为每块组织连续切片，切片厚度为10m10m，并置于膜，并置于膜片上。片上。(3)(3)VeritasVeritas显微切割仪（显微切割仪（显微切割仪（显微切割仪（LCM LCM）精确分离肺癌细胞精确分离肺癌细胞(功功率率30-70mw30-70mw，脉冲时间，脉冲时间2000ms)2000ms)，每个病例获取约，每个病例获取约l0 l05 5的细胞。的细胞。(4)(4)切割完毕，立即将切割完毕，立即将LCMLCM盖子盖于盛有盖子盖于盛有400L400L裂解液裂解液的的EPEP管中，倒置后充分振荡混匀，置于管中，倒置后充分振荡混匀，置于-80-80直至直至RNARNA抽提。微切割时都有与之相对应的抽提。微切割时都有与之相对应的HEHE连续切片连续切片做比对，以准确定位所需细胞。做比对，以准确定位所需细胞。Figure1.Laser capture microdissection of lung squamous-cell carcinoma eells.三、三、RNA抽提和质量监控抽提和质量监控n用mirVana miRNA isolation kit 抽提总RNA。n对RNA的质量监控则通过 RNA6000Pico Labchip kit由 2100 Bioanalyzer来完成。四、全基因组miRNA分析n n实验通过实验通过LCMLCM从从136136例不同类型组织例不同类型组织(包括肺不典包括肺不典型腺瘤样增生型腺瘤样增生9 9例，支气管肺泡细胞癌例，支气管肺泡细胞癌1111例，腺癌例，腺癌2626例，鳞癌例，鳞癌3030例、小细胞癌例、小细胞癌2020例，相应的正常肺例，相应的正常肺组织组织4444例例)中获取纯净目的细胞，分别用中获取纯净目的细胞，分别用AgilentAgilent最最新芯片技术进行全基因组新芯片技术进行全基因组miRNAmiRNA表达分析。该芯表达分析。该芯片阵列取自片阵列取自 Sanger v.10.1 Sanger v.10.1数据库，包含数据库，包含723723个人类个人类miRNAmiRNA的探针。的探针。n n每个样本只需每个样本只需l00ngl00ng上样量，用上样量，用Cy3Cy3标记后，并经标记后，并经 XDR Scan(PMT100XDR Scan(PMT100，PMTS)PMTS)扫描得到信号。标记和扫描得到信号。标记和杂交的操作方法均参照杂交的操作方法均参照AgilentAgilent芯片说明书。芯片说明书。五、数据统计分析1、miRNA差异性表达分析（1）芯片的图像信息通过 scanner Control Rev.7.0软件转换为点密度值。这些信号经背景消除后直接导入 Genespring GX10软件进行定量Quantile标准化，并由此得到正常组织和病变组织所表达的信号间比值。从生物性重复中获得的平均标准化数据用来做比较研究的分析。一、miRNA差异性表达分析（2）n n在 Agilent miRNA microarray所带的723个miRNA中，有291个基因显示有阳性信号并被用于进一步的数据分析。n n病变组织上皮细胞与相应的正常组织上皮细胞的miRNA表达相比较时，发现有161个miRNA的表达在不同类型肺癌组织和正常组织中存在着统计学的差异，其中包括31个己报道的miRNA及130个新的尚未见报道的miRNA。n n运用34个这些差异表达的miRNA可以分别区分正常肺组织和鳞癌/腺癌/小细胞癌(图4A)。运用17个差异表达的miRNA可以分别区分鳞癌/腺癌/小细胞癌(图4B)。Figure 4A Hierarehical combined tree Normal lung tissue and three Figure 4A Hierarehical combined tree Normal lung tissue and three types of lung cancers.types of lung cancers.Figure 4B Hierarchical combined tree Three types of lunge canser Figure 4B Hierarchical combined tree Three types of lunge canser tissues.tissues.实验结果实验结果(一一)正常肺泡上皮与肺腺癌细胞的正常肺泡上皮与肺腺癌细胞的miRNA差异性表达分析差异性表达分析n n在正常肺泡上皮与肺腺癌细胞的miRNA差异性表达分析中发现63个差异性表达miRNA，包括46个新的尚未见报道的miRNA(表IA),n n以及17个文献报道的miRNA(表1B)，其中15(88%)个miRNA表达与文献报道一致。(二二)正常肺泡上皮与肺鳞癌细胞的正常肺泡上皮与肺鳞癌细胞的miRNA差异性表达分析（略）差异性表达分析（略）在正常肺泡上皮与肺鳞癌细胞的miRNA差异性表达分析中发现119个差异性表达miRNA，包括95个新的尚未见报道的miRNA(表2A)及24个文献报道的miRNA(表2B)，其中19(79%)个miRNA表达与文献报道一致。(三)正常肺泡上皮与肺小细胞癌的miRNA差异性表达分析（略）在正常肺泡上皮与肺小细胞癌细胞的miRNA差异性表达分析中发现117个差异性表达miRNA,包括95个新的尚未见报道的miRNA(表3A)及22个文献报道的miRNA(表3B)，其中20(90%)个miRNA表达与文献报道一致。二、预测性分析二、预测性分析运用芯片预测分析方法(PAM 及 WEAK)对芯片数据进行预测性分析，并把两种数据综合起来得到以下结果:1)1)miRNA肿瘤标记物可以区分正常/肺癌组织;2)2)miRNA肿瘤标记物则可以区NSCLC/SCLC;3)3)miRNA肿瘤标记物则可以区分AC/SQ;4)4)miRNA肿瘤标记物则可以区分AC/SQ/SCLC.(一一)预测正常肺组织预测正常肺组织/肺癌组织的肿肺癌组织的肿瘤标记物瘤标记物1、PAM预测分析结果 PAM分析结果显示正常组与肺癌组比较，至少有4个miRNA可以组成一组有区分力的数据。PAM分数与上述miRNA区分正常/肺癌的预测力见表4A。十倍交叉验证分析结果表明该组miRNA预测的准确性为96.03%。2、WEAK方法预测分析结果方法预测分析结果 通过对正常肺泡上皮及肺癌上皮的WEAK分析，预测发现13个区分二者的miRNA(表4B)，该组miRNA的平均准确性为97.519%。3、两种预测性分析结果中、两种预测性分析结果中重复出现的重复出现的miRNA 将该水平分类组中的两种不同预测性分析所得的结果相比较，我们发现有7个miRNA至少出现在两种不同的预测方法结果中。这些miRNA的区分能力可能更强大，准确性也可能更高(表4C）(二二)预测非小细胞肺癌预测非小细胞肺癌(NSCLC)/小细小细胞肺癌胞肺癌(SCLC)的肿瘤标记物（略）的肿瘤标记物（略）(三三)预测肺腺癌预测肺腺癌(AC)/鳞癌鳞癌(SQ)的肿瘤标记物（略）的肿瘤标记物（略）4.实时荧光定量实时荧光定量RT-PCR验证验证 参照几参照几Taqman microRNA RTTaqman microRNA RT反应试剂盒说明书，反应试剂盒说明书，随机选取随机选取8 8个经个经LCMLCM获取的获取的RNARNA样本，依次验证样本，依次验证1616个个miRNAs(has-miR-106amiRNAs(has-miR-106a，has-miR-135bhas-miR-135b，has-miR-143has-miR-143，has-miR-145has-miR-145，has-miR-18ahas-miR-18a，has-miR-195has-miR-195，has-miR-has-miR-20a20a，has-miR-221has-miR-221，has-miR-375has-miR-375，has-miR-378has-miR-378，has-has-miR-423-3PmiR-423-3P，has-miR-497has-miR-497，has-miR-572has-miR-572，hsa-miR-638hsa-miR-638，has-miR-7 and haa-miR-96)has-miR-7 and haa-miR-96)的表达。同时进行的对的表达。同时进行的对小小 RNA U47 RNA U47表达的检测用来作为标准化的质量监控。表达的检测用来作为标准化的质量监控。每个实验至少重复三次。每个实验至少重复三次。结论结论n n7 7个个miRNAmiRNA可以区分正常肺组织及肺癌组织，准确可以区分正常肺组织及肺癌组织，准确率高达率高达98%;98%;n n1010个个miRNAmiRNA可以区分非小细胞肺癌及小细胞癌，可以区分非小细胞肺癌及小细胞癌，准确率高达准确率高达99.9%;99.9%;n n 2 2个个miRNAmiRNA可以区分例肺腺癌及肺鳞癌，准确率可以区分例肺腺癌及肺鳞癌，准确率高达高达93.5%;93.5%;n n1313个个miRNAmiRNA可以区分肺腺癌、鳞癌及小细胞癌，可以区分肺腺癌、鳞癌及小细胞癌，准确率高达准确率高达 95.5%95.5%。n n为肺癌分子分型及靶向治疗提供新的理论依据。为肺癌分子分型及靶向治疗提供新的理论依据。第二部分：不同亚型肺癌患者组织第二部分：不同亚型肺癌患者组织及血浆中及血浆中miRNA肿瘤标记物的验证肿瘤标记物的验证一、标本及组织学分类一、标本及组织学分类 收集复旦大学附属中山医院收集复旦大学附属中山医院2004-20072004-2007年期间存档年期间存档的结直肠石蜡组织标本的结直肠石蜡组织标本144144例例(肺鳞癌、腺癌及小肺鳞癌、腺癌及小细胞癌各细胞癌各4848例例)及及4848例相应正常对照肺组织。鳞癌例相应正常对照肺组织。鳞癌及腺癌患者均具有及腺癌患者均具有3-53-5年完整随访资料，小细胞癌年完整随访资料，小细胞癌生存期短，所有患者均具有生存期短，所有患者均具有2-52-5年完整随访资料。年完整随访资料。所有病人对参与科学研究都有知情同意。重新切所有病人对参与科学研究都有知情同意。重新切片和常规片和常规HEHE染色后，由两位经验丰富的病理医生染色后，由两位经验丰富的病理医生参照参照20032003年世界卫生组织肿瘤分类标准进行诊断年世界卫生组织肿瘤分类标准进行诊断和分类。和分类。二、方法二、方法1.RNA抽提和质量监控 每个组织块连续切片获取20mg石蜡组织。RecoverAllTM Total Nucleic Acid isolation kit抽提总RNA,NanoDrop 1000 Spectrophotometer测定RNA浓度。方法均参照其各自说明书。2.实时荧光定量RT PCR 参照Taqman microRNA RT反应试剂盒说明书，每个样本用100 ng上样。验证的对象是通过两种完全不同的芯片预测分析方法所获得的能区分鳞癌、腺癌及小细胞癌的7个miRNA肿瘤标记物，即hsa-miR-25,hsa-miR-205,hsa-miR-34a,hsa-miR-375,hsa-miR-29a,hsa-miR-29b,hsa-miR-27a.(一一)验证正常肺组织腺癌组织的肿瘤验证正常肺组织腺癌组织的肿瘤标记物标记物运用MedCalc软件进行受试者工作特征曲线(receive operating characteristic curve,ROC)及logistic regression分析，以评估候选miRNA肿瘤标志在分别区分正常肺组织与鳞癌、腺癌及小细胞癌的诊断价值。结果显示，候选的4个miRNA肿瘤标记物能在石蜡组织中鉴别正常肺组织与肺腺癌（p 0.05，表2)，其中hsa-miR-34a及has-miR-27a 组合能鉴别肺腺癌准确率达85%(AUC=0.898)。2、验证正常肺组织与肺鳞癌的肿瘤、验证正常肺组织与肺鳞癌的肿瘤标记物标记物结果显示，候选的4个miRNA肿瘤标记物能在石蜡组织中鉴别正常肺组织与肺腺癌（p0.05，表3)，其中has-miR-205能鉴别肺鳞癌准确率达90%(AUC=0.864)。3、验证正常肺组织与小细胞肺癌的、验证正常肺组织与小细胞肺癌的肿瘤标记物（略）肿瘤标记物（略）结果显示，候选的6个miRNA肿瘤标记物能在石蜡组织中鉴别正常肺组织与小细胞肺癌印0.05，表4)，其中has-miR-205能鉴别肺鳞癌准确率达90%(Aue=0.564)。其中has-msR-25a及has-miR-29a组合能鉴别小细胞肺癌准确率达99%(AUC=0.987)。n n验证肺腺癌与肺鳞癌的肿瘤标记物(略)n n验证肺腺癌与小细胞肺癌的肿瘤标记物(略)n n验证肺肺鳞癌与小细胞肺癌的肿瘤标记物(略)第三部分肺癌患者血浆第三部分肺癌患者血浆miRNA肿瘤肿瘤标记物的发现及初步验证标记物的发现及初步验证该实验可分成两个阶段该实验可分成两个阶段:第一阶段第一阶段 miRNA miRNA分子标志物的筛选分子标志物的筛选:19:19例腺癌、例腺癌、1010例鳞癌、例鳞癌、7 7例小细胞肺癌患者及例小细胞肺癌患者及2323例正常对照血浆。例正常对照血浆。所有血浆样本用所有血浆样本用mirVana miRNA isolation kitmirVana miRNA isolation kit抽提总抽提总RNARNA。用。用AgilentAgilent公司的最新公司的最新microRNAmicroRNA芯片平台芯片平台()()进行分析。进行分析。第二阶段第二阶段 miRNA miRNA分子标志物的验证分子标志物的验证:选出选出150150例已有例已有术后病理诊断结果的新病例，包括腺癌、鳞癌及术后病理诊断结果的新病例，包括腺癌、鳞癌及小细胞肺癌各小细胞肺癌各5050例，及例，及5050例正常对照患者血浆。例正常对照患者血浆。抽提术前血浆抽提术前血浆RNARNA，通过实时荧光定量，通过实时荧光定量RT-RT-PCR(Taqman)PCR(Taqman)方法验证候选的显著差异表达的方法验证候选的显著差异表达的miRNAmiRNA，最终确定肺腺癌、鳞癌、小细胞癌血浆，最终确定肺腺癌、鳞癌、小细胞癌血浆特异性的特异性的miRNAmiRNA及鉴别诊断的及鉴别诊断的miRNAmiRNA肿瘤标记物。肿瘤标记物。结论结论（1 1）通过全基因组）通过全基因组miRNAmiRNA差异表达分析，已筛选出差异表达分析，已筛选出在不同亚型肺癌患者血浆内新的尚未见报道的显在不同亚型肺癌患者血浆内新的尚未见报道的显著差异表达的著差异表达的miRNAmiRNA，己申请专利，己申请专利 (PCT/CNZOOg/075949)(PCT/CNZOOg/075949)。（2 2）初步验证肺癌患者血浆内显著差异表达的）初步验证肺癌患者血浆内显著差异表达的miRNAmiRNA，筛选出，筛选出1414个个m1RNAm1RNA可以区分鳞癌、腺癌可以区分鳞癌、腺癌及小细胞癌，尚需进一步大样本验证。及小细胞癌，尚需进一步大样本验证。（3 3）血浆内肺癌特异的）血浆内肺癌特异的miRNAmiRNA的发现为肺癌的筛查的发现为肺癌的筛查及早期诊断提供理论基础。及早期诊断提供理论基础。专利申请专利申请n n1.Compositions and Methods for microRNA expression profiling of lung cancer.57 claims.PCT/CN2009/075955.n n2.Compositions and Methods for microRNA expression profiling in plasma of lung cancer.32 claims.PCT/CN2009/075949.n n3.Compositions and Methods for microRNA expression profiling in plasma of hepatocellular cancer.16 claims.PCT/CN2009/075945.谢谢大家！结结 语语