生化工程自考总结10200.pdf

1/8 包埋法固定化酶：将酶包在凝胶微小格子内，或是将酶包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。微生物消耗比率:单位时间内菌体对培养基的消耗率.细胞回流的单级恒化器:在反应器的出口处安装细胞分离器,分离出一部分细胞进行浓缩后打回到反应器中的单级恒化器.微生物的生长速率：单位时间内单位体积发酵液中菌体的增量。反复分批补料培养法：在间歇培养的基础上，流加一种或几种底物或前体物进行培养，培养结束时不取出全部的发酵液，留下一部分发酵液作为种子，然后开始下一个补料培养过程的发酵方法。氧的满足度：溶解氧浓度与临界溶氧浓度之比。活塞流模型(PF):在反应器内与流体流向相垂直的横截面上的流速分布是均一的,即不存在返混。活活塞流反应器:完全不存在返混的理想反应器/CSTR 反应器:混合足够强烈,达到完全返混的理想反应器 稀释率:培养基体积流北与培养液体积之比 传氧速率:每单位界面上每小时的传氧量 连续式全混流型反应器（CFSTR）：反应器内的返混足够强烈，因而反应器内物料的浓度处处相等，如果温度均一，反应速度也处处相等不随时间而变。多级全混流釜模型（CFSTRin-series）高径比不大，搅拌不充分的一个反应器，可以想象内部既有全混流成分，又存在活塞流成分。等效 N 个 CFSTR 串连。扩散模型（Dispersion model）:高径比较大的反应器如短管或塔式反应器内的流体流动具不大的返混（活塞流和轴向扩散的叠加）阻截：细菌质量小，紧随空气流地流线而向前运动，当空气流线中所挟带地微粒由于和纤维相接触而被捕集称为阻截。扩散：微小的颗粒受到空气分子的碰撞，发生布朗运动，由于布朗运动，颗粒与介质碰撞而被捕集称为扩散。反应动力学：用数学模型定量描述生物反应过程各种环境因素与微生物代谢活动地相互作用随时间而变化地规律。为生物反应过程的控制，小型试验数据的放大，提高反应过程的产物的提纯等提供理论依据。比拟缩小：将现有的生产规模发酵罐比拟缩小至试验实规模。缩小原则：缩小的实验室规模反应器中所能提供的微生物代谢活动的环境条件，实现有大规模型反应器中能实现的。意义：比拟缩小的实验室规模装置不但可以为现有的生产规模装置提供有效的生产菌株选育的场所，也可以为其工艺条件的优化提供服务。比拟缩小放大的原理方法相同！限制性的步骤：外扩散（步骤）限制：当反应达到稳态时，传质速率与反应速率相等。内扩散（步骤）限制：在固定化酶、细胞的内部不存在流体流动，其传质完全依赖于扩散作用。在微生物反应过程中碳源主要消耗于：1、满足于微生物菌体生长的需要（S）G。2、维持微生物生存的消耗（S）m。3、生成代谢产物大的消耗（S）p。轴功率：即搅拌器输入搅拌液的功率，指搅拌器以既定转速回转时，以克服介质阻力所需用地功率。氧载体：为非连续相，在搅拌地气液介质中被分散成比气泡小得多的微滴。传氧速率指标：每溶解 1kg 氧所消耗的电能（kw*h/kg O2）（它与 kla 的大小是评价发酵液的重要指标。）临界溶氧浓度：维持好氧型细菌代谢活动稳定的最低溶氧浓度。混合时间：把少数具有与搅拌罐内的液体相同的物性的液体注入搅拌罐内，两者达到分子水平的均匀混合所需时间。Yo/x：单位菌体（干重）所耗用的溶氧重量。Yx/s：菌体得率：指生成细胞得质量与消耗基质质量之比。YATP:ATP 对菌体的得率,指碳源对菌体的得率与消耗 1MOL碳源由分解代谢产生 ATP 量之比/YC:碳对菌体得率,指么应过程中生成菌体中C的量与消耗基质中 C 的量之比 菌体理论得率：碳源被同化为菌体得观点，来看菌体的得率。连续培养：以一定速率不断地向混合均匀的发酵罐中供给新鲜培养基，同时等量地排除发酵液，维持发酵罐中液量一定地培养方法。比生长速率：单位菌体在单位时间的增值量。限制性低物：在培养微生物的培养物质中，对微生物生长起到限制作用的营养物。营养物质相对贫乏：指该物质的浓度在比生长速率达到最大比生长速率时低底物浓度 scrit 以下的情形。恒化器：指具有恒定化学环境的反应器，恒化指明了操作稳定的状态特征。载体结合法：将酶、细胞固定在非水溶性载体上。交联法：使酶、细胞带有两个或两个以上的官能团试剂进行交联反应。包埋法：将酶、细胞包埋在凝胶格子里或半透膜聚合物的超滤膜内。固定化死细胞：在固定化前或后对微生物细胞进行加热、冷冻、干燥、表面活性剂化学试剂等处理，使细胞处于死亡甚至是破碎状态的固定化细胞。固定化活细胞：固定化后细胞仍存活但并不增值，生长处于静止状态的固定化细胞。固定化增殖细胞：是在固定化后细胞不仅存活，而且在使用过程中还能增值，生长处于增值状态的固定化细胞。非理想反应器：反应器中流体处于非理想流动状态的反应器。半衰期：固定化酶、细胞在使用中活性降低一半所需的时间。活性淤泥法：通过微生物反应除去废水中的有机物质的一种方法。包埋法固定化酶：将酶包在凝胶微小格子内，或是将酶包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。2/8 微生物的生长速率：单位时间内单位体积发酵液中菌体的增量。反复分批补料培养法：在间歇培养的基础上，流加一种或几种底物或前体物进行培养，培养结束时不取出全部的发酵液，留下一部分发酵液作为种子，然后开始下一个补料培养过程的发酵方法。氧的满足度：溶解氧浓度与临界溶氧浓度之比。CRABTREE:效应:糖浓度偏高,即使提供足够的溶解氧,也不可避免地会进行酒精发酵导致酵母得率降低 生化工程:以化学工程原理和方法进行生物工业生产/容积系数:压缩机一次循环吸入气体体积(V1-V4)和活塞扫过体积(V1-V3)之比.绝热压缩过程:压缩过程中气体所放出的热量没有向外界付出气体温度升高/等温压缩过程:压缩过程中气体所放出的热量能全部排出外界使气体压缩前后的温度相等/全挡板条件:消除漩涡所以需的最少挡板数.营养物质想对缺乏:该物质的浓度在比生长速率 U 最毕生长速率 UM 的最低底物浓度 SAIT 以下时的情形,SAIT 为临界底物浓度 固定化细胞 酶是一种在空间运动上受到限制或部分限制的细胞,酶.能量生长偶联型,:当有大量合成菌体材料存在时,微生物生长取决于 ATP 的供能.能量生长非偶型:缺少材料或存在生长抑制物质,生长取决于合成菌体.,材料的供应的进程式这时多的 ATP 高能键被水解能量释放 真空 连续培养地运用：1、确定最佳培养条件，2、富集、选育特殊性状的菌种，3、连续发酵与产物的形成。连续培养的问题：1、染菌污染问题，2、变易问题 酶触反应的影响：温度，PH，抑制剂与活性剂，高浓度低物，产物抑制。1、发酵罐的比拟放大中，空气流量放大常采用的三个原则是 VVM 相等、空截面气速 Vs 相等和 Kla 相等。2、深层过滤器的设计中，最重要的设计参数是 滤层厚度。3、Monod 方程中动力学常数的求算常采用 双倒数作图或线性回归方法。4、丝状菌培养用的发酵罐比拟放大后，常需校核 搅拌叶轮尖端线速度 指标。5、流加式操作特别适合于有底物抑制 的培养过程。6、乳酸菌生长和乳酸生成之间的关系符合 混合生长偶联型。7、用 CSTR 反应器同时连续培养三种微生物 A、B、C，已知ABB，最后在反应器中存留的是微生物 A。8、用载体结合法固定化细胞是指把细胞通过共价键、离子键或吸附作用结合到水不溶性载体上的方法。9、固定化酶的半衰期是指固定化酶活力降低一半的使用时间。10、微生物代谢产物的生成速率与菌体生长速率之间存在三种不同类型的关联，它们是 生长偶联型 、混合生长偶联型 和非生长偶联型。11、发酵罐比拟放大时，搅拌功率及转数放大常采用的三个原则是 Po/V 相等、Pg/V 相等和 Kla 相等。微生物的比热死速率数由菌体抗热性能和灭菌温度两个回素决定。121 度时 A B C D 的比热死速率常数分别为 0.05 0.03 0.013.0.048 上 述 A B C D 受 热 死 容 易 程 度 为C.BDA 分批灭菌的过程包括 升温 保温 降温 评价好氧发酵最重要的两个指标是,Kla 传氧效率指标 发酵罐比拟放大一般遵守 几何相似 培养条件相同 微生物在反应器中的充分分散 策生物代谢产物的生成速率与菌体生长之间存在 生长偶联型 混合生长偶联型 非生长偶联型 固定化每的半衰期指桑骂槐 固定化每活性降低一半的使用时间 每的培养过程主要经济指标有两个,转化率 生物反应器的3/8 生产强度 深层液体发酵 染菌较少 发展快 规模大 深层液体的发酵 酵母生长速率高 醋酸生成降低 PH 影响杂菌增殖 生化工程产生的标致 通风搅拌会传质问题 美国 固定化酰化氨基酸水解酶光学拆分 D-L-氨基酸 固定化 G 异构酶将 G 异构为果糖 固定化细胞可处于 生长 静止或死亡 发酵过程中的丰质是,酶促反应 热灭菌法是最为简便,有效,经济的 微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应一级反应动力学 比热死速率常数K 决定于菌体的种类用存在方式,灭菌温度 纤维介质捕集效率的机理可分为,惯性冲击 阻截 扩散 重力沉降和静电除尘 新型过滤器分为,聚乙烯过滤器和折式过滤除菌器和高效烧结金属过滤器和绝对过滤 发酵罐中常用的机械搅拌器大至分为轴向和径向 前者如螺旋浆式,后者如涡轮式 搅拌器输入搅拌功率取决于,叶轮与罐的相对尺寸 转速 流体的物性附件的尺寸和数目 搅拌造成的平均剪应速率主要决定于叶轮转速与其它变数基本无关 KLA 的变化是由 菌体浓度 表面活性物质和耗氧量不恒定造成的 液体培养的操作方法有,间歇培养,连续培养,流加培养 缩短混合时间的最有效方法 是啬 反应器泣不同部位的进液点 11、发酵罐比拟放大时，搅拌功率及转数放大常采用的三个原则是 Po/V 相等、Pg/V 相等和 Kla 相等 1、微生物的比热死亡速率常数由微生物菌体的抗热性能和灭菌温度两个因素决定。2、传氧速率指标是指每溶解 1kg 溶氧消耗的电能。3、Monod 模型的数学表达式为=mS/（Ks+S）。4、微生物细胞的比耗氧速率 QO2（呼吸强度）是指单位重量的细胞在单位时间内消耗氧的量，单位是 molO2/kg 干细胞，QO2与溶氧浓度的关系为 QO2=（QO2）max C/（Ko+C）。5、动物细胞培养的反应器主要有悬浮培养反应器 、贴壁培养反应器 和 微载体悬浮培养反应器。6、经验和半经验的发酵罐比拟放大方法中，模型罐和生产罐一般以几何 相似原则为前提。7、用 CSTR 反应器同时连续培养两种微生物 A 和 B，已知AB，最后在反应器中存留的是微生物 A。8、用载体结合法固定化细胞是指把细胞通过共价键、离子键或吸附作用结合到水不溶性载体上的方法。判断 1、间歇培养微生物的减速生长期，微生物的比生长速率小于零。（）=2、亚硫酸盐氧化法可以用于测量真实发酵液的Kla。（）3、活塞流反应器中，沿径向的反应速度是常数。（）=4、连续反应器中物料的稀释速率用F/V 来计算。（）5、在微生物培养过程中有可能存在多种限制性底物。（）=6、返混是指不同停留时间物料之间的混合。（）7、间歇培养好氧微生物时，菌体耗氧速率是常数。（）8、对培养基进行热灭菌必须以霉菌的孢子为杀灭对象。（）=9、在一定温度下，各种不同微生物的比热死亡速率常数值相等。（）10、在有细胞回流的单级恒化器中，总的出口处菌体浓度与恒化器中的菌体浓度完全相等。（）=1、CSTR 反应器中物料的返混程度最小。（）=2、微生物的比生长速率是指单位时间内菌体的增量。（）3、限制性底物是指培养基中浓度最小的物质。（）4、控制好氧发酵的溶氧浓度一定小于微生物的临界溶氧值。（）=5、单级连续培养中，如果调整成 D（稀释速率）（比生长速率），最终将发生“冲出”现象。（）=6、一定温度下，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学。（）7、在活塞流反应器中进行恒温热灭菌，沿物料流动方向菌体热死灭速率逐渐下降。（）=8、单级恒化器的稀释速率可以任意调整大小。（）9、任何微生物培养过程的 YATP均等于 10g/mol 左右。（）=10、连续培养反应器中物料的平均停留时间和稀释速率互为倒数。（）问答 新型过滤器的种类及制备特点和优缺点：1，聚乙烯醇（PVA）：乙酰化并以耐热树脂涂敷，制成片式过滤器。PVA 过滤器的显微摄影呈现致密的纤维结构，PVA的过滤器能承受蒸汽反复灭菌。优点，PVA 除菌效率达99.9999 以上，压力降在 1.5Kpa 一下，使用可以达 1 年以上，杀菌及干燥时间短，更换方便，占地面积小。超小型的空气除菌装置滤过线速度高达 80cm/s.2，折式过滤除菌器：采用超细玻璃纤维折成波纹型，并用支撑材料加固，纸端用树脂粘结密封，然后粘封于过滤盒中，形成折式过滤器。（纸端密封齐为环氧树脂 100g，滑石粉 5565g，邻苯二甲酸二丁脂 15g 固化齐为间苯二胺（或乙二胺）15g 纸端粘结后固化温度为 120130 度。时间为 1h。使用红光超细玻璃纤维纸三层制造的过滤器，除尘效率达99.99%以上，这是一种高效空气过滤器，有点是：结构简单，制造方便，过滤面积大，占地面积小，压力降低小，费用低。缺点：强度较低，不耐气流冲击，容易穿孔。4/8 3，高效烧结金属过滤器：将金属（蒙乃尔合金，青铜等）粉末烧结成板或管状，微孔直径微 2030um,过滤效率较高。如 JLS 型等过滤器，优点：过滤效率为 99.999压力降为10Kpa，能耐高温 200260 度，机械强度可靠，耐压小于等于 1Mpa 可以反吹再生，寿命 36 个月，安装更换方便。4，绝对过滤器：由于医疗特种发酵需要 Millipore 薄膜微孔过滤器已推广，微孔直径约为 0.2-0.45um 小于菌体，因而微生物不能通过，称为绝对过滤器，过滤效率接近 100过滤器中滤层分成两层，外层采用超细玻璃纤维纸作为预过滤，内层采用过滤膜，以避免膜的微孔堵塞。要评价一种过滤介质是否优越，要看过滤效率，但它是 K 和 L的函数。K 值（阻拦因数）越大，L 则越小，同时P 越小越好，因而把 KL/P 值作为综合性能指标来评价。比较理想的空气除菌流程应具以下特点：1)高空采风，吸气风管设置在工厂的上风向高 2030m处，以减少吸入的细菌含量。2)装设前过滤器，以减轻总过滤器的负担。3)采用无油润滑压缩机，减少压缩后的空气油雾污染。4)压缩机后采用冷却型的空气贮罐可降低空气的温度，同时出去部分润滑油。5)采用二级冷却二级旋风分离器，使油水分离较完全。6)采用旋风金属丝网除雾器，除去空气中的雾滴。7)采用蒸汽加热器将空气加热至约 50 度，使空气的相对湿度小于 60，再进入总过滤器，以保证总过滤器处于干燥状态。8)空气经总过滤器后进入分过滤器，再进入发酵罐，空气的除菌程度达到 99.999%9)空气除菌设备均采用蒸汽彻底灭菌，并能定期排除油水，能检测各阶段的空气温度以及净化程度。10)必须防止冷凝水倒流入总过滤器 11)设备应尽量简单 连续灭菌器的流体模型：一，活塞流模型(PF):在反应器内与流体流向相垂直的横截面上的流速分布是均一的（不存在返混）长径比很大的管式反应器接近于这种。二，连续式全混流型反应器（CFSTR）：设定反应器内的返混足够强烈，因而反应器内物料的浓度处处相等，如果温度均一，反应速度也处处相等不随时间而变。搅拌强烈（机械搅拌，气流或液流搅拌等）的实际连续反应器，可以接近于 CFSTR 特性。三，多级全混流釜模型（CFSTRin-series）高径比不大，搅拌不充分的一个反应器，可以想象内部既有全混流成分，又存在活塞流成分。等效 N 个 CFSTR 串连。四，扩散模型（Dispersion model）:高径比较大的反应器如短管或塔式反应器内的流体流动具不大的返混（活塞流和轴向扩散的叠加）搅拌器型式及流型：1 螺旋桨式搅拌器：把液体向下或向上推进，形成轴向的螺旋流动，其混合效果尚好，单产生的剪率较低，对气泡的分散效果不好。（常用的螺旋桨叶数为 3 片，螺距等于搅拌器直径，最大叶端速度不超过 25m/s）2 圆盘平直叶涡轮搅拌器：与无圆盘的搅拌特性相似，圆盘可使上升的空气的气泡受阻，避免大的起泡从轴部叶片空隙上升，保证气泡更好地分散。圆盘平直叶涡轮搅拌器具有很大地循环输送量和功率输出，实用于各种流体地搅拌混合（包括粘性液体及非牛顿流体）(Di:di:L:B=20:15:5:4)3圆盘弯叶涡轮搅拌器：搅拌流型与圆盘平直叶搅拌流型相似，前者造成的液体径向流动较为强烈。因此在相同的搅拌速度时前者的较好，输出功率较后者为小，因此在混合困难而溶氧速率要求相对较低的情况下，可用此(Di:di:L:B=20:15:5:4)4 圆盘箭叶涡轮搅拌器：与 2，3 搅拌流型相似，但轴向流较为强烈，在同样的转速下它造成的剪率低，输出的功率叶较低，但混合效果较好。(Di:di:L:B：C=20:15:5:4：2)功率消耗：平直叶弯叶箭叶 搅拌流型：搅拌器在罐内造成的液流型式，对气、固、液相的混合，氧气的溶解以及热量的传递等有重大的影响，这种液流型式不仅决定于搅拌器本身，还受罐内附件如挡板、拉力筒及其安装位置的影响。1.罐中轴装垂直螺旋桨搅拌器的搅拌流型：无挡板，在轴中心形成凹陷的漩涡。安装垂直挡板多块，液体的螺旋状流受到挡板拆流，被迫流向轴心，使漩涡消失。消除漩涡必须的最少挡板数为全挡板数 2.涡轮搅拌器的搅拌流型：各在涡轮平面的上下两侧造成向上和向下的翻腾。挡板可以部分冷却蛇管排所代替。3.装有拉力筒时的搅拌流型：在罐内与垂直的搅拌器同轴线安装套筒，可以大大地加强循环输送效果，并能将液面地泡沫从套筒的上部入口轴吸道液体之中，具有自消泡能力（伍氏发酵罐）双膜理论-双膜理论的基本前提：1 气泡与包围气泡的液体之间存在着界面，界面的气泡一侧存在着一层气膜，在界面的液体一侧存在一层液膜。气膜内的气体分子与液膜中的液体分子都处于层理状态，分子间无对流运动，氧的分子只能以扩散方式，即籍浓度差推动而穿过双膜进入液相主流。（主流气体：气泡内除开气膜以外的气体分子处于对流状态。主流中任意一点氧分子的浓度相等。液体主流液是如此）2 在双膜之间的两相界面上，氧的分压强与溶于界面液膜中的氧浓度处于平衡关系。3 传质过程处于稳定状态，传质途径上各点的氧浓度不随时间而变 在稳定的传质过程中，通过气、液膜的传氧数率应相等。H 为亨利定律常数，随气体及溶剂及温度而异，它表示气体溶于溶剂的难易。氧难溶于水，H 值很大 提高 Kla 的途径：1 增加搅拌转速 N，以提高 Pg，可以有效提高 Kla。5/8 2 增大通气量 Q，以提高 Vs。（在通气量不是很高时）3 为了提高 Nv，除了提高 Kla 之外，提高 C*也是可行的方法之一。通入纯氧，或在可能的条件下提高罐内操作压力，均可提高 C*4 丝状菌的繁殖导致发酵液粘度的急剧上升和 Kla 的急剧下降。在不能提高转速的情况下可重复地放出一部分发酵液，补充新鲜灭菌等体积培养基这样可以使 Kla 大幅度回升。5 发酵液中添加少量的水不容性另一液相，氧在这一液相中具有比在水中高很多的溶解度。七、说明动态法测量 Kla 的原理和方法（8）动态法测量 Kla 是利用溶氧电极进行的，测量的是真实发酵液的 Kla 值。原理：利用非稳态时，溶氧浓度的变化速率等于溶入的氧浓度和耗氧浓度之差，即：dc/dt=Kla（C*-C）-QO2 X 重排列上式：C=-1/Kla（dc/dt+QO2 X）+C 将非稳态时溶氧浓度 C 对（dc/dt+QO2 X）作图，可得一直线，此直线的斜率值即为-1/Kla。（5 分）采用的方法是：A：停止通气，使发酵罐中的溶氧浓度下降。B：恢复通气（在溶氧浓度降到临界溶氧浓度之前恢复通气）。固定化方法：载体结合法（共价结合法：将非水溶性载体和酶、细胞以共价键的型式固定在一起。离子结合法：是通过离子效应，将酶、细胞固定到具有离子交换基团的非水容性载体上。物理吸附法：将酶、细胞吸附到不溶于水的载体上而使酶、细胞固定的方法）交联法（靠化学结合的方法使酶、细胞固定化，区别仅在于是否使用载体。交联法是利用带有两个或两个以上的官能团试剂与酶、细胞之间发生分子间的交联而把酶、细胞固定化。）包埋法：（格子型：将酶、细胞包埋在聚合物的凝胶格子里中，使之处在不脱离状态下，达到固定酶、细胞的目的。微胶囊型：将酶、细胞包裹在凝胶的微小格子。）其它固定方法（内固定法：对微生物的热处理，物理射线照射或化学试剂处理使所需要的酶固定在细胞体内同时固定化菌体。自固定法：通过培养条件的选择使所培养的微生物菌体絮凝。凝聚法：添加絮凝剂絮凝菌体）固定法酶、细胞的性质：固定化后活性大都降低（因为酶的活性中心的重要氨基酸与水不容性载体相结合，结构发生了变化，虽不失活，但酶与低物的相互作用受到空间位阻。）提高固定化酶的活力：可在固定的同时加入酶活性中心保护剂（低物、产物或其结果类似物）稳定性增加（因酶分子的结构或细胞被约束，可能降低其对外部恶劣环境的敏感，使其稳定性（对热、对各种化学试剂、对不易被蛋白酶类的分解）增加。催化特性；（低物专一性、反应的最适 PH 值、反应的最适温度、米氏常数（反应了酶和低物的亲和能力）、最大反应速度）固定化酶、细胞利用领域：化学品制造（ATP、医疗（癌症）、分析与诊断（酶试剂）、亲和层析(乙型肝炎抗原)、固定化细胞器（H2）。Monod 方程建立的几点假设是什么？Monod 方程与米氏方程主要区别是什么？：Monod 提出了在特定温度、pH 值、营养物类型、营养浓度等条件下，微生物细胞的比生长速度与限制性营养物质的浓度之间存在关系式：=mS/(Ks+S)m-最大的比生长速度 S-限制性营养物的浓度 Ks-饱和常数 区别：Monod 方程与酶催化反应的米氏方程形式上是一样的，因为微生物的生长可看作酶反应的粗略代表。但所不同的是，米氏方程是应用酶反应理论推导得到的，而 Monod 方程却是完全经验得到的。连续培养优缺点 优点：1）提供了一个微生物在恒定状态下告诉生长的环境，便于进行微生物的代谢、生理、生化和遗传特性的研究；2）在工业上可减少分批培养中每次清洗、装料、灭菌、接种、放罐等的操作时间，提高生产效率。3）产物质量比较稳定；4）所需设备和投资较少，便于实现自动化。缺点：1）在长时间的培养过程中，微生物菌种容易发生变异，发酵过程易染菌；2）新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合，影响培养和营养物质的利用 连续培养中的主要问题(1)稳定性问题 连续培养系统要求处于稳定状态，首先要求确保菌种的稳定，但大规模连续培养过程中常出现菌种变异和退化的现象，尤其是带有营养缺陷、抗反馈突变等遗传标记 的生产菌。可采用半连续发酵。(2)无菌度问题 连续培养周期长、保持设备的密闭性以及培养液和空气的无菌度更为严格。可在发酵掖中加入抗菌的药物。(3)匀态问题 所谓匀态是指连续培养要求菌体、基质和产物都要混合均匀作为前提。对于高黏度和非牛顿醪液，更难混匀。(4)控制问题 连续培养要求各参数稳定，整个系统要在最佳化的条件下进行，才能获得最高的产率和最大的生产能力。有些连续培养的最佳点与最坏点相当接近。可见连续培养要求精确的控制技术。(5)放大问题 生化反应器的特点 生化反应与一般化学反应的不同主要在于其反应皆由生物催化剂-酶来催化的。决定了酶反应必须在比较温和的条件下6/8 进行，也就是在接近中性的 pH、较低的温度及近似细胞生理条件下进行。生物的酶系是非常复杂的，在活细胞中它们是相互协调而处于最优化的状态，故活细胞常被用来合成一些代谢产物如多糖及蛋白质等。由于反应的环境会随着时间的进程而改变，就产生了一个如何控制反应过程使其最优化的问题。对生长细胞来说，要考虑到如何维持发酵的最佳条件，主要包括细胞营养、代谢的调控以及反应产物的干扰。由于酶作用对底物的高度特异性，它可以定向的产生一些用一般化学方法难以甚至无法得到的产品。大多数生化反应都在水相中进行，相对来说产物浓度较低，这就产生了一个产物回收工艺及成本的问题 生物反应器的比拟放大，到底以什么为基准呢？首先要从大量的试验材料中把握和找出影响生产过程的主要矛盾，在着重解决主要矛盾的同时，不要使次要矛盾激化。例如，单纯按照 kLa 相等为准则放大的生物反应器，液体剪切力可能会上升到剪切敏感系统不可接受的程度，投入生产，就可使生产失败，必须注意不使这类情况出现，为此往往或多或少地牺牲几何相似的原则。微生物反应过程的特点:1.微生物反应是生物化学反应，通常是在常温、常压下进行。2.反应中参与反应的培养基成分多，反应途径复杂，因而在微生物生长的同时往往还伴随着生成代谢产物反应。3.微生物反应还受到众多外界环境因素的影响 1、与通用式机械搅拌罐相比，塔式生物反应器的优点是什么？A：省去了轴封，从根本上排除了因轴封造成的污染。（1 分）B：反应器结构简单。（2 分）C：功率消耗小。（1 分）D：减少了剪切作用对细胞的损害。（1 分）2、动植物细胞培养与微生物细胞培养的主要区别是什么？A：大多数动物细胞需附壁生长（1 分）。B：动物细胞对培养基的营养要求相当苛刻，要求含有多种氨基酸、维生素、无机盐、血清等物质。（1 分）C：因动物细胞没有细胞壁保护，对剪切力非常敏感。（1 分）D：生长缓慢。（1 分）E：易染菌。（1 分）3、写出对培养基进行湿热灭菌时微生物营养细胞的热死灭动力学方程，说明方程中各符号的意义。-dN/dt=KN （2 分）N：培养基中任意时刻的活微生物浓度（个/升），（1 分）t：灭菌时间，（1 分）K：菌体的比热死亡速率常数，1/min，（1 分）-dN/dt：菌体死亡速率。4、酶和细胞的固定化有哪几种方法，举出两个应用实例。酶和细胞的固定化有载体结合法、交联法和包埋法。（3 分）DL-氨基酸的光学拆分是工业化应用固定化酶的成功例子。利用固定化的氨基酰化酶实现 DL-氨基酸的不对称水解，利用D-型和 L-型氨基酸的溶解度不同和外削旋化反应来生产 L-氨基酸。（1 分）酶电极是利用固定化酶的成功例子。酶电极主要由电化学传感器和固定化酶两部分组成。（1 分）5、主要有哪几种测量 Kla 的方法，说明它们的适用场合。主要有亚硫酸盐氧化法、溶氧电极法和氧的衡算法（2 分）亚硫酸盐氧化法不能用于测定真实发酵液的 Kla，但具有参比价值。（1 分）溶氧电极法用于测量真实发酵液的 Kla，大、小反应器均可用该法测量 Kla。（1 分）氧的衡算法适合体积大的反应器 Kla 的测定。（1 分）6、图示分析培养基间歇灭菌过程和连续灭菌过程的温度变化情况，写出间歇灭菌过程中各阶段对灭菌的贡献。回答要点：A：画出间歇灭菌和连续灭菌的温度变化曲线。（3分）B：主要贡献在保温阶段。（2 分）7、有细胞回流的单级连续培养是怎样的操作方式？与单级恒化器相比有什么优点？进行单级连续培养时，把从反应器流出的培养液进行分离，经浓缩的细胞悬浮液被送回反应器中，即成为细胞回流的连续培养。（3 分）这种连续培养的优点是反应器可以在稀释速率大于最大比生长速率的情况下操作，反应器中的细胞浓度较高。（2 分）8、双膜理论的基本论点是什么？什么是液膜控制？什么是气膜控制？A：在气液两个流体相间存在界面，在界面两侧各有一层稳定的薄膜，即气膜与液膜，这两层稳定的薄膜在任何流体力学条件下均呈滞流状态。（2 分）B：界面上不存在传递阻力，两相的浓度总是相互平衡的。（2分）C：传递阻力都集中在气膜和液膜之中。（1 分）9、微生物代谢产物的生成和菌体的生长之间通常有几种类型的关联，分别说明。共有三种类型的关联，分别是生长偶联型、混合生长偶联型和非生长偶联型。生长偶联型：伴随着菌体生长，代谢产物生成，菌体停止静生长，代谢产物的生成也停止。（2 分）混合生长偶联型：伴随着菌体生长，代谢产物生成，菌体停止静生长，代谢产物仍然生成。（2 分）非生长偶联型：菌体生长停止后，代谢产物开始生成。（1 分）2 生物反应器开发的趋势和方向。A：开发比活力高和选择性高的生物催化剂将继续占重要地位。（2 分）B：改进生物反应器热量和质量传递的方法。（2 分）C：生物反应器正向大型化和自动化方向发展。（1 分）4、与单级连续培养相比，多级连续培养的优点是什么？A：有利于解决不同生产阶段有不同生产要求的矛盾 ，如菌体生长和产物生成的温度不一至。（3 分）7/8 B：有利于解决快速生长和营养物充分利用之间的矛盾。（2 分）5 缩短微生物间歇培养延迟期常采用的方法是什么？A：接种的微生物应尽可能是高活力的（用对数期的微生物作种子）。（2 分）B：用于种子培养的介质和条件应尽可能接近生产上使用的发酵液组成和培养条件。（2 分）C：在一定 X 围内，采用大接种量。（1 分）6、提高发酵液中氧传递速率的主要途径是什么？从提高 Kla 的角度可采用：A：增加搅拌转数 N，以提高 Pg。（1 分）B：增大通气量 Q，以提高空截面气速 Vs。（1 分）C：N 和 Q 同时增加。（1 分）从提高传质推动力角度可采用：E：提高罐压（1 分）F：通入纯氧（1 分）7 反应器的重要操作参数有那些？分别说明。A：空间时间：表示反应物在连续操作反应器内停留（或平均停留）的时间。（1 分）B：转化率：表示加入反应器中底物的转化率，用（So-St）/So来计算。（2 分）C：生产率（生产能力）：指反应器单位体积单位时间内的产物生成量。（1 分）D：选择率：指实际转化成目的产物量与全部底物可生成产物的理论量之比。（1 分）8微生物间歇培养过程各阶段的比生长速率如何变化？以图表示。A：迟缓期：=0。（1 分）B：加速生长期：增加，2大于1。（1 分）C：对数生长期：达到最大值，为常数。（1 分）D：减速生长期：减小，2小于1。（1 分）E：平衡期：=0。（1 分）五、当发酵液为非牛顿性流体时，说明发酵罐搅拌功率的计算方法。（15）A：确定发酵罐的几何尺寸和搅拌转数N。（2 分）B：用（dw/dr）平均=KN 计算（dw/dr）平均。（2 分）C：测定一定温度下，菌体生长最旺盛时的液体流变性特征曲线，查即定转数时的显示粘度。（2 分）D：取小罐实验数据绘制 NpRem 曲线。（2 分）E：对与小罐几何相似的大罐，按牛顿流体方法计算 Po，再计算 Pg。（1 分）只要避开 Rem=10300 区间，可以用牛顿流体的NpRem 曲线代替拟塑性流体的 NpRem 曲线。（1 分）六、什么是好氧微生物培养的临界溶氧浓度？如何测定？是否所有的好氧微生物培养过程都必需控制溶氧浓度在临界溶氧浓度以上？举例说明。（10 分）微生物的比耗氧速率随溶氧浓度的增加而升高，当溶解氧增加到一定值时，比耗氧速率不再增加，这时的溶氧浓度称为临界溶氧浓度。（3 分）测法：将供氧充分的微生物培养体系停止通风，检测培养系统的溶氧浓度变化情况，首先是溶氧浓度呈直线下降趋势，下降到一定程度后，开始呈缓慢下降趋势，溶氧浓度曲线拐点处的溶氧浓度值即为该微生物的临界溶氧浓度。（3 分）并非所有的好氧培养过程都需要控制溶氧浓度在临界溶氧浓度以上，比如以丙酮酸为前体的苯丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸的发酵生产就应控制溶氧浓度在临界溶氧浓度以下。（4 分）1带圆盘的涡轮式搅拌与不带圆盘的涡轮式搅拌器相比有什么优点/答，A 贺盘可以使上升的气泡受阻避免大的气泡以轴部叶空隙中上升保证气泡更好的分散 B 具有很大的循环输送量的功率输出 C 适用于各种流体的搅拌混合包括粘性流体和非流动性。2 空气除菌的方法有 A 加热灭菌 B 辐射灭菌 C 化学灭菌 D 静电除尘，E 介质过滤 3 温度 T 对 K 的影响，A 活化能越高 K 越低，热死速率越慢，BK 并不是唯一决定活化能的，尚不能肯定是活化能越低的孢子热死速率一定比活化能高的快，C 计算活化能，D K 是活化能和温度的函数，活化能越高，温度的变化对K 的影响越大，4 固定化酶，和细胞在实际应用中的特点 A 容易实现连续培养 B 获得产物纯度高，C 酶和细胞可重复用，E 易实现自控，3、固定化酶和固定化细胞使用期间活性下降的主要原因是什么？A：酶变性，细胞自消化（自溶）。（1 分）B：固定化酶或细胞吸附了抑制物。（1 分）C：染菌。（1 分）D：酶、细胞流失。（1 分）E：载体崩解。（1 分）6、提高发酵液中氧传递速率的主要途径是什么？从提高 Kla 的角度可采用：A：增加搅拌转数 N，以提高 Pg。（1 分）B：增大通气量 Q，以提高空截面气速 Vs。（1 分）C：N 和 Q 同时增加。（1 分）从提高传质推动力角度可采用：E：提高罐压（1 分）F：通入纯氧（1 分）生物反应器的设计和操作的限因素有那些，设计目标是什么 目标是，力求设计出质量高，成本低，节能的，限因素有，KLa Kd Pa/v 空气流量 vs vvm 叶轮尖端线速度，混合时间，搅拌液流循环量Q，附加指标 Q/H 固定化酶和固定化细胞使用期间活性下降的主要原因是：1 酶变性，细胞自消化 2 固定化酶或细胞吸附抑制物，3 染菌，4 酶细胞流失 5 载体崩解/固定化酶或细胞在实际应用中的显著特点：A 可连续稳定生 B反应产物的纯度高质量好 C 生成的副产物少 D 反就在的动力学常数，反应的最佳 PH 和反应温度有可能会调 E 固定化酶和细胞在使用时可以再生或回收，可重复使用。F 容易实行连续8/8 自动控制节约劳动力，能提高酶或细胞的生产能力。生物反应器高计和操作的限制因素有那些？A 生物催化的浓度和比活力B 反应器的传质和传热能力，生物反应器的发展方向。A 开发此活力高和选择性高的生物催化剂将会点重要的位置，B改进生物反应器热量和质量的传递方法C生物反应器正向大型化和自动化发展 练习题:1、求青霉素连续发酵的稳定状态下最大菌体生成速度(DX)max 及此时的稀释率 Dmax，菌体浓度 Xmax 和基质浓度 S。已知（菌体可用 Monod 方程表达）S0=30g/L，YX/S=0.45，max=0.18h-1，Ks=1.0g/L。可知，So,Yx/s Um Ks 属 莫 诺 方，所 以 生 产 强 度 最 大 时 的 稀 释 率Dm=Um1-(ks/Ks+So)2/1=0.15 X=Yx/s(So-Ks*D/Um-D)=11.25 因为 X=Yx/s(So-s)所以 S=So-x/Yx/s=5g/L 例：某有机废水 BOD 物质浓度为 800（g/m3)，要求处理后BOD 下降 90%。a=0.5kg/kg，b=0.3kg/kg.d。废水处理量为 8360（m3/d），曝气池有效容积为 6000m3，曝气池内悬浮物质浓度为 3000mgMLSS/L，求该曝气池的耗氧浓度和曝气池的体积溶氧系数 kLa。曝气池液体的饱和氧浓度 c*=7(mg/L)，运行时实际维持的氧浓度 cL 为 1(mg/L)解：耗氧浓度:V(dO2/dt)=a.F(S0-Se)+b.V.X=350kg/h 在稳定状态下，呼吸耗氧速度等于溶氧速度：kL a(c*-cL)=dO2/dt=350/V=58.3mg/L.h kLa=58.3/(7-1)=9.67(1/h)例：用葡萄糖为唯一碳源，在通风提供足够溶解氧的情况下连续培养 Azotobacter vinelandii 的结果并根据上面推导的关系求得该微生物的理论得率 YG、维持常数 m 和不同情况下葡萄糖消耗对菌体生长的得率 YX/S(mol/g.h)(10-2):0.22,0.31,0.35,0.49,0.50,0.53,0.74(h-1):0.06,0.098,0.121,0.200,0.246,0.300,0.350 解：以为纵坐标，以为横坐标做直线，根据直线在纵坐标的截距和它的斜率的倒数分别为：m=0.9 10-3 mol/(g.h)YG=54 g/mol YX/S=YG/(m.YG+)g/mol YX/S:31.3,36.1,38.5,43.1,45.1,46.5,47.4 可以看出微生物生长比速愈大或碳源消耗比速愈大（这是由于碳源作为限制性基质，其浓度增加的结果），YX/S 与 YG 愈接近，可以推得 YG是 YX/S 的极限。例：乙醇为基质，耗氧培养酵母，反应方程为：C2H5OH+aO2+bNH3=c(CH1.75N0.15O0.5)+dCO2+eH2O 呼吸商 RQ=0.6。求各系数 a、b、c、d、e 解：C:2