土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

一、课题背景一、课题背景尿素是怎样被植物吸收的？尿素尿素 CO(NHCO(NH2 2)2 2只能被分解为NH3才能被植物吸收利用CO(NHCO(NH2 2)2 2+H+H2 2O COO CO2 2+2NH+2NH3 3细菌脲酶细菌脲酶产生脲酶的细菌即为能分解尿素的细菌任务1：怎么从土壤中分离出它们呢？二、研究思路二、研究思路 阅读课本P21，感悟科学家寻找耐高温的DNA聚合酶给你的启示。（一）筛选菌株方法：方法：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。根据这一思路，你能否将土壤中分解尿素的细菌分离出来，说说你的思路。利用以尿素为唯一氮源的培养基进行筛选。能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。此培养基能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？KH2PO4 1.4gNa2HPO4 2.1gMgSO47H2O 0.2g葡萄糖 10.0g尿素 1.0g琼脂 15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。（1）将土壤中的固氮菌分离出来（2）将土壤中自养微生物分离出来举一反三（3）筛选出抗青霉素的微生物（4）筛选出耐高浓度食盐的微生物（一）筛选菌株1、利用选择培养基筛选 选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。1、利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物只是一种细菌吗？都是能分解尿素的微生物吗？思考：思考：不是，有多种。芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。因此，还需借助生物化学方法对分离的细菌作进一步的鉴定。2、请你提供一种方法，判断分解尿素的细菌确实能将尿素分解成氨。思考：思考：方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚酞指示剂,接种培养该细菌，若指示剂变红，说明该种菌分解了尿素。3、要验证以尿素为唯一氮源的培养基对土壤中的细菌确实具有选择作用，你该如何设计实验。思考：思考：思路：制备牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基为实验组，接种等量的从同一土壤中采集的细菌，培养、计数并比较两组培养基上的菌落数。任务2：统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌？计数法显微镜直接计数法稀释涂布平板法膜过滤法1、显微镜直接计数利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点2.稀释涂布平板法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。（2）计算：每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。讨论讨论对同一细菌培养液样品分别用显微镜直接计数法和稀释涂布平板法测定其菌体数量，你认为两种方法所测数据有何差异？（1 1）操作方法：）操作方法：稀释涂布平板法稀释涂布平板法（2 2）原理：）原理：1 1个菌落个菌落1 1个活菌个活菌（3 3）注意事项）注意事项（二）统计菌落数目真是这样吗？注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到 三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养 计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般 以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的 平均菌落数在50个左右为最好。例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。设置对照实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基倍稀释的培养基中筛选出大约中筛选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样的个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约稀释度下只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。三、实验的具体操作.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要 在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板 三三 样品的稀释样品的稀释为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿尿素素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌数约为菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供选择培养的条件。供选择培养的条件。.取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。质地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。质地等等，都是区分细菌的重要手段。四、结果分析与评价四、结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030300300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。