生物技术综合实验二.ppt

生物技生物技术综合合实验二二理理论内容部分内容部分一、超氧化物歧化一、超氧化物歧化酶简称：SOD.是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。它们以铜和锌、或锰、铁、或镍作为辅因子超氧化物歧化酶的来源超氧化物歧化超氧化物歧化酶的来源有很多途径，可以根据当地的原料的来源有很多途径，可以根据当地的原料来源，成本需求，技来源，成本需求，技术要求来要求来选取不同的提取途径。取不同的提取途径。其中根据不同的分其中根据不同的分类有以下几个途径有以下几个途径获取取该酶。1、植物提取、植物提取2、动物提取物提取3、微生物的生、微生物的生产发酵酵4、人工合成、人工合成发展历史超氧化物歧化超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,EC1.15.1.1,SOD）是）是1938年年Marn等人首次从牛等人首次从牛红血血球中分离得到超氧化物歧化球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人开始算起，人们对SOD的的研究己有七十多年的研究己有七十多年的历史。史。1969年年McCord等重新等重新发现这种蛋白，并且种蛋白，并且发现了它了它们的生物活性，弄清了它催化的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子氧阴离子发生歧化反生歧化反应的性的性质，所以正式将其命名，所以正式将其命名为超氧化物歧化超氧化物歧化酶。超氧化物歧化超氧化物歧化酶的作用机理的作用机理氧气在有机体内代氧气在有机体内代谢还原，提供了生物能量，原，提供了生物能量，最后生成水，共接受最后生成水，共接受4个个电子。在子。在这还原原过程程中，每接受一个中，每接受一个电子就生成一个氧自由基或活子就生成一个氧自由基或活性氧。但氧自由基，能引起性氧。但氧自由基，能引起细胞胞损伤，导致疾致疾病病发生。生。O2+eO2O2+2e+2H+H2O2O2+3e+3H+H2O+OHO2+4e+4H+2H2O而而SOD是体内是体内专一清除超氧阴离子自由基的一一清除超氧阴离子自由基的一个抗氧化个抗氧化酶。SOD的催化的催化过程如下：程如下：O2-+O2-+2H+H2O2+O2SOD将将O2-歧化生成双氧水。国内外歧化生成双氧水。国内外对SOD的的毒性毒性进行了广泛的研究，大量行了广泛的研究，大量资料表明料表明SOD无无毒、无副作用。毒、无副作用。二、二、SOD用途及前景用途及前景1 1、抗氧化、抗氧化2 2、抗衰老、抗衰老3 3、预防慢性病及其并发症、预防慢性病及其并发症4 4、抗疲劳、抗疲劳5 5、化疗副作用的消除剂、化疗副作用的消除剂6 6、避免手术的二次伤害、避免手术的二次伤害手术会引起大量自由基，故建议手术前后口服手术会引起大量自由基，故建议手术前后口服抗氧化剂来迅速恢复体力加速伤口复原。抗氧化剂来迅速恢复体力加速伤口复原。超氧化物歧化酶的应用 健康上的应用健康上的应用 SOD SOD是人体内最主要的抗氧化物质，是氧自由基的克星和是人体内最主要的抗氧化物质，是氧自由基的克星和专一清除剂；它清除人体内一些自由基。它保护细胞对抗专一清除剂；它清除人体内一些自由基。它保护细胞对抗毒性，调节毒性，调节H H2 2O O2 2的浓度，对付微生物的侵害，并且增强抗的浓度，对付微生物的侵害，并且增强抗氧化酶的活性，迅速清除过剩的自由基，保持身体健康，氧化酶的活性，迅速清除过剩的自由基，保持身体健康，体力充沛，面容体态年轻。全球体力充沛，面容体态年轻。全球118118位科学家发表联合声位科学家发表联合声明：自由基是百病之源，明：自由基是百病之源，SODSOD是健康之本。体内的是健康之本。体内的SODSOD活性活性越高，寿命就越长。越高，寿命就越长。药物物类主要集中在炎症病患者，尤其治主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关湿关节炎、慢性多炎、慢性多发性关性关节炎、心肌梗塞、心血管病、炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放射性治瘤患者以及放射性治疗炎症病患者；炎症病患者；用于生化制用于生化制药作作为一种生化一种生化酶制制剂，广泛，广泛应用于用于临床和科研上，具有极床和科研上，具有极强的抗衰老，抗的抗衰老，抗肿瘤、瘤、调节人体内分泌系人体内分泌系统作用；作用；用于化用于化妆品品类可添加在化妆品中，具有抗氧化抗腐蚀的优良性能。有减少皱纹、祛斑的功效以 SOD为主要成份的产品风靡世界，引发了化 妆品历史上的一场革命，使人类永葆青春美丽梦想成真；用作保健食品、用作保健食品、饮料料如SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常畅销!在饮料、糖果、糕点等食品中加入SOD既可利用其抗腐蚀性延长保质期，又可调节人体内分泌系统总之，超氧化物歧化之，超氧化物歧化酶可以清除体内可以清除体内过量的自由量的自由基，提高人体免疫力，延基，提高人体免疫力，延缓衰老；有效降低血脂、衰老；有效降低血脂、胆固醇、血胆固醇、血压；抗疲抗疲劳，增，增强肝肝肾功能；抗功能；抗辐射；射；对糖尿病有明糖尿病有明显的恢复作用；的恢复作用；调节女性生理女性生理周期，推周期，推迟更年期更年期。应用前景SOD是一种新型的抗炎症是一种新型的抗炎症药,尤其尤其对关关节炎和炎和类风湿关湿关节炎有明炎有明显疗效效,根据根据SOD作用机制和毒性作用机制和毒性试验,它它对治治疗因因O2引起的各种疾病都有一定的引起的各种疾病都有一定的疗效效。为此此,SOD可作可作为抗抗衰老、抗炎症、自身免疫疾病患者广泛衰老、抗炎症、自身免疫疾病患者广泛应用的医用的医药品。此品。此外外,SOD对治治疗贝切特氏症、心肌梗塞等血虚性心切特氏症、心肌梗塞等血虚性心脏病、病、胶原病、新生儿呼吸困胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射性合症、防御放射性伤害等也可害等也可望有效。近年来美望有效。近年来美、日、德、英国等、日、德、英国等对对SOD作作为药品开品开发应用用进行了一系列研究和行了一系列研究和临床床试验并得到广泛并得到广泛应用。用。可以可以预言言,随着人随着人们对SOD更广泛深入的研究更广泛深入的研究,不不同同类型型SOD、SOD修修饰物及人工有机合成物及人工有机合成SOD模模拟酶将在医将在医疗、保健、食品、保健、食品、农业增增产等方面等方面发挥出更大的作用出更大的作用.三、三、SOD提取方法提取方法实验部分部分(P40-70）一、基本内容：一、基本内容：1.1.细胞破碎及胞破碎及酶的抽提。的抽提。2.2.两种蛋白两种蛋白质含量含量测定方法及定方法及酶的活力的活力测定。；定。；3.3.离子交离子交换柱分离操作及分析。柱分离操作及分析。4.4.SDS-PAGESDS-PAGE电泳泳测定蛋白定蛋白质分子量。分子量。5.5.固定化固定化酶的制的制备技技术。6.6.酶的柱的柱层析分离操作，包括装柱，恒流析分离操作，包括装柱，恒流泵及部分收及部分收集器的集器的试调，上，上样，洗脱等。，洗脱等。7 7.IEFIEF测蛋白蛋白质PIPI；1.1.8 8.PODPOD同工同工酶分析；分析；9.9.细胞器的分离及其胞器的分离及其标志物（志物（酶）的）的测定定 二二.目的要求目的要求 学学习提提取取分分离离纯化化超超氧氧化化物物歧歧化化酶的的方方法法，掌掌握握酶分分离离纯化化的的基基本本操操作作技技术。包括以下内容：。包括以下内容：1 1细胞破碎及胞破碎及酶的抽提；的抽提；2 2酶的柱的柱层析分离操作；析分离操作；3 3酶的活力的活力测定。定。三三.基本原理基本原理 超氧化物歧化超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD,EC1.15.1.1)是一是一种歧化超氧种歧化超氧负离子自由基离子自由基O2生成生成H2O2和和O2的金属蛋白，的金属蛋白，为胞内胞内酶，在生物体内具有延在生物体内具有延缓机体衰老，机体衰老，对肿瘤瘤、自身自身免疫性疾病和免疫性疾病和辐射射损伤具有重要的防御作用，具有重要的防御作用，是一种重要的是一种重要的药用用酶。根据所含的金属离子，。根据所含的金属离子，SOD可分可分为三三类：Cu、ZnSOD、MnSOD和和FeSOD。SOD在生物界中分布极广，原核在生物界中分布极广，原核生物和真核生物中都有存在。生物和真核生物中都有存在。本本实验从从血血中中提提取取SOD，提提取取液液经葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶柱柱上上层析析，分分离离出出SOD，然然后后用用邻苯苯三三酚酚法法测定定其其酶活活力力。邻苯苯三三酚酚在在自自氧氧化化过程程中中产生生有有色色中中间物物（红桔桔酚酚）和和O2-,使使溶溶液液颜色色变褐褐加加深深。加加入入SOD能能歧歧化化O2-阻阻止止中中间物物（红桔桔酚酚）的的积累累，通通过分分光光光光度度计比比色色分分析析反反应液液的的颜色色而而测定定其其酶活力。活力。超氧化物歧化酶的工艺流程动物血液材料中制备超氧化物歧化酶分离纯化工艺分为三个主要步骤：原材料的预处理原材料的预处理乙醇乙醇-氯仿除去血红蛋白氯仿除去血红蛋白粗酶粗酶液的制备液的制备有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 离子交换离子交换柱层析精制柱层析精制 SODSOD成品成品原材料的预处理原材料的预处理材料材料材料试剂：材料试剂：3.8%柠檬酸柠檬酸三钠，三钠，0.9%氯化钠，氯化钠，95%乙醇，氯仿，牛乙醇，氯仿，牛血。血。器材：恒温水浴，离心机，器材：恒温水浴，离心机，布氏漏斗，抽虑瓶，布氏漏斗，抽虑瓶，烧杯，量筒，搅棒烧杯，量筒，搅棒实验步骤实验步骤收集：取新鲜牛血，加入到收集：取新鲜牛血，加入到3.8%柠柠檬酸三钠液中，新鲜猪血与抗凝檬酸三钠液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为液的比例为3:1,轻轻搅拌均匀，轻轻搅拌均匀，4000r/min,离心离心20min,收集红细收集红细胞。胞。浮选：红细胞用浮选：红细胞用3倍体积生理盐水洗倍体积生理盐水洗涤，涤，4000r/min离心离心20min,重复重复3次。次。溶血：向洗净的红细胞加入溶血：向洗净的红细胞加入11.1倍倍体积去离子水，在体积去离子水，在5下搅拌下搅拌30min,得到溶血物。得到溶血物。注意：注意：收集完新收集完新鲜血液后，血液后，应尽快加抗凝尽快加抗凝剂去除血去除血红蛋白蛋白过程中，程中，搅拌要均匀拌要均匀去血红蛋白去血红蛋白向溶血液中分别缓慢加入向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷倍体积的预冷95%乙醇和乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置左右，静置1h,然后然后4000r/min离心离心20min，除去变性血红蛋白沉淀，取清夜，过，除去变性血红蛋白沉淀，取清夜，过滤，收集滤液滤，收集滤液。1.1.热变性热变性 原材料的预处理中获得的上清液加热原材料的预处理中获得的上清液加热到到6565，保温，保温10min10min，然后迅速冷却到室温，然后迅速冷却到室温，3000r/min3000r/min离心离心20min20min，弃去沉淀物，收集上，弃去沉淀物，收集上清液。清液。2.2.沉淀沉淀 清夜在冰浴中冷却，然后在清夜在冰浴中冷却，然后在-5-5一下一下的操作温度下，加入的操作温度下，加入1.51.5倍量预冷丙酮，边倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置23min23min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水溶解，沉淀物用少量蒸馏水溶解，4000r/min4000r/min离心离心20min20min，除去不溶物，用，除去不溶物，用pH7.6pH7.6的的2.5mmol/LK2HPO4-KH2PO42.5mmol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得缓冲液透析，即得粗粗SODSOD溶液溶液注意迅速冷却至注意迅速冷却至室温室温沉淀沉淀过程保持程保持低温哦低温哦三材料器具三材料器具 1.1.材料：材料：动物新物新鲜血液；血液；SephadexG75凝胶。凝胶。2.2.仪器器：高高速速组织捣碎碎机机；高高速速冷冷冻离离心心机机；层析析柱柱（140cm）；自自动部部分分收收集集器器；恒恒流流泵；进样器器和微量和微量进样器；可器；可见/紫外分光光度紫外分光光度计。3.3.试剂：（1 1）pH7.8,5mmol/L磷磷酸酸缓冲冲液液（内内含含1mmol/LEDTA）；（2 2）考考马斯斯亮亮蓝溶溶液液：称称取取100mg考考马斯斯亮亮蓝G250于于50ml95%乙乙醇醇中中，摇动，待待溶溶解解后后，加加入入100ml85%磷磷酸酸，反反复复震震动后后加加蒸蒸馏水水定定容容至至1000ml,过滤待待用用；（3 3）pH8.2,50mmol/LTris-HCl缓冲冲液液；（4 4）5050mmol/L邻苯苯三酚溶液；三酚溶液；（5 5）10mmol/LHCl溶液溶液4.试剂的配法的配法（1 1）pH8.2pH8.2、50mmol/LTris-HCl 50mmol/LTris-HCl 称取称取Tris0.61gTris0.61g，EDTA-2Na0.037gEDTA-2Na0.037g，用双蒸水溶解至用双蒸水溶解至80mL80mL左右，用左右，用HClHCl调节pH=8.20pH=8.20（用（用pHpH计校正），最后定容至校正），最后定容至100mL100mL。（2 2）10mmol/LHCl 10mmol/LHCl（3 3）50mmol/L50mmol/L邻苯三酚苯三酚 称取称取邻苯三酚苯三酚0.063g0.063g，用，用10mmol/LHCl10mmol/LHCl溶液溶液溶解，定容至溶解，定容至10mL10mL，避光保存。，避光保存。（4 4）SODSOD样液液 四四.实验操作实验操作(一一)SOD的提取的提取1.取取新新鲜血液血液,冷水浸泡冷水浸泡24h24h,沥干，加冰干，加冰冻的的pH7.8,5mmol/L磷酸磷酸缓冲液适量，用高速冲液适量，用高速组织捣碎机碎机捣碎。碎。2.2.用高速冷用高速冷冻离心机以离心机以8000rpm离心除去固离心除去固型物（需型物（需45次，每次次，每次15min）,上清液即上清液即SOD酶液。液。（二）（二）SOD的凝胶的凝胶层析分离析分离纯化化 1.凝胶的准凝胶的准备：（1）称取称取SephadexG75干凝胶干凝胶2g，加适量洗脱液沸水浴溶，加适量洗脱液沸水浴溶胀2小小时（也可室温（也可室温溶溶胀24小小时）。）。（2）用）用倾斜法斜法倾去表面去表面悬浮的浮的细小小颗粒，室温粒，室温储存于磷酸存于磷酸缓冲液中冲液中备用。用。2 2装柱：装柱：（1 1）将）将层析柱析柱竖直固定于支架上直固定于支架上,连接好恒流接好恒流泵、部、部分收集器分收集器,调节洗脱液的操作洗脱液的操作压60cm。（2）先向）先向层析柱中加入析柱中加入1/3高度的高度的pH7.8,5mmol/L磷磷酸酸缓冲液冲液,然后用大口然后用大口进样器吸取上述准器吸取上述准备好的凝胶徐好的凝胶徐徐注入柱中徐注入柱中缓冲液内冲液内,让其自然沉降，沉降好的柱床其自然沉降，沉降好的柱床顶部离管口部离管口12cm为宜。若高度不宜。若高度不够，可放去部分，可放去部分缓冲冲液，液，搅起管中凝胶界面，起管中凝胶界面，继续添加凝胶。添加凝胶。（3）装）装毕，用，用23个床体个床体积的洗脱液洗脱，以使床柱的洗脱液洗脱，以使床柱稳定。定。3 3上上样：（1 1）放去床表面上的）放去床表面上的缓冲液至与凝胶界面平冲液至与凝胶界面平齐。（2 2）用用进样器器吸吸取取酶液液0.5ml，加加样时将将进样器器尖尖端端接接触触柱柱内内壁壁并并在在离离床床表表面面数数毫毫米米处随随加加随随沿沿内内壁壁转动一一周周，使使样品品尽尽快快分分布布于于全全表表面面。然然后后打打开开恒恒流流泵，待待样品品液液面面与与床床柱柱表表面面平平齐时，关关闭恒恒流流泵，以以少少许（0.10.11ml）缓冲冲液液冲冲洗洗内内壁壁数数次次，在在打打开开恒恒流流泵，放放至至液液面面与与床床柱柱表表面面平平齐。（3 3）先先用用进样器器加加1cm高高度度的的缓冲冲液液覆覆盖盖样品品，然然后后加加足足缓冲液，冲液，连接好接好进液管。液管。4洗脱：洗脱：开启部分收集器和恒流开启部分收集器和恒流泵，以，以pH7.8,5mmol/L磷酸磷酸缓冲液冲液进行洗脱。行洗脱。调节流速，控制流速，控制每管收集洗脱液每管收集洗脱液1ml，每管按收集，每管按收集顺序做好序做好标记。5 5洗脱液洗脱液酶蛋白含量的蛋白含量的测定：定：（1 1）取取洁净试管管数数支支，分分别加加入入考考马斯斯亮亮蓝溶溶液液3ml,摇匀匀，将将其其中中一一支支试管管不不加加任任何何试液液作作为对照照管管，其其余余的的分分别加加入入从从第第五五收收集集管管起起的的洗洗脱脱收收集集液液50l,反反复复摇匀。匀。（2 2）以）以对照管照管为调零液，用零液，用1cm比色杯在比色杯在595nm波波长下下测定各管的定各管的OD595nm值。（3 3）合合并并OD595nm值高高的的原原收收集集液液，此此即即纯化化的的SOD酶液。保留液。保留测酶活力。活力。（4）测定完定完毕，先用乙醇洗去比色杯的，先用乙醇洗去比色杯的颜色，再用色，再用蒸蒸馏水水荡洗，用擦洗，用擦镜纸拭干水珠，倒扣在培养皿内。拭干水珠，倒扣在培养皿内。（5）清理干）清理干净工作台，在工作台，在仪器使用登器使用登记本上登本上登记使使用情况。用情况。（三）（三）SOD酶活力活力测定定在一般情况下，在一般情况下，SOD活性活性测定只能定只能应用用间接活性接活性测定法定法。其其测定定方法很多，常方法很多，常见的有的有化学法化学法、免疫法、免疫法和等和等电点聚焦法。其中化学法点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会程中会产生有生有色中色中间物和物和O2-，利用，利用SOD分解而分解而间接推算接推算酶活力。活力。在化学方法中，最常用的有黄在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化呤氧化酶法，法，邻苯三酚法，化学苯三酚法，化学发光法，光法，肾上腺素法，上腺素法，NBT-还原法，原法，光化学光化学扩增法，增法，Cyte还原法等。其中改良的原法等。其中改良的邻苯三酚苯三酚自氧化法自氧化法简单易行易行较为实用。本用。本实验采用采用邻苯三酚自苯三酚自氧化方法氧化方法。邻苯三酚自氧化法苯三酚自氧化法原理原理：邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出放出O2-（超氧阴离子自由基），生成（超氧阴离子自由基），生成带色的中色的中间产物（物（红桔桔酚），反酚），反应开始后反开始后反应液先液先变成黄棕色，成黄棕色，几分几分钟后后转绿，几小几小时后又后又转变成黄色，成黄色，这是因是因为生成的中生成的中间物物不断氧化的不断氧化的结果。本果。本实验中中测定的是定的是邻苯三酚自氧化苯三酚自氧化过程中的程中的初始初始阶段段，中，中间物的物的积累在滞留累在滞留3045s后，后，与与时间成成线性关系，一般性关系，一般线性性时间维持在持在4min的范的范围内，中内，中间物在物在325nm波波长出有出有强烈光吸收。当有烈光吸收。当有SOD存在存在时，由于它能催化，由于它能催化O2-与与H+结合生成合生成O2和和H2O2，从而阻止了中从而阻止了中间有色有色产物的物的积累，累，导致吸光致吸光值下降因下降因此，通此，通过测定它定它们在特定波在特定波长下得光吸收下得光吸收变化速率化速率计算出算出SOD的的酶活性活性。邻苯三酚 O2-+红桔酚（自氧化：有色物（自氧化：有色物质积累，吸光累，吸光值增加）增加）O2-+O2-+2H+H202+O2（SOD催化：阻止中催化：阻止中间产物物积累，吸光累，吸光值降低）降低）pH=8.2SOD实验步步骤：1 1测定定邻苯苯三三酚酚溶溶液液自自氧氧化化速率速率：取取两两支支试管管按按右右表表加加入入25预热过的的缓冲冲液液,然然后后加加入入预热过的的邻苯苯三三酚酚（空空白白管管用用10mmol/LHCl代代替替邻苯苯三三酚酚），迅迅速速摇匀匀，立立即即倾入入1cm比比色色杯杯中中，在在325nm波波长处测定定光光吸吸收收值，每每隔隔30s读数数一一次次，测定定4min内内每每分分钟光光吸吸收收值的的变化化。要要求求自自氧氧化化速速率率控控制制在在每每分分钟的的光光吸吸收收值为0.070士0.002（可可增增减减邻苯苯三三酚酚的的加加入入量量，以以控控制光吸收制光吸收值）。）。2.2.SOD样液活力液活力测定：定：样品品管管取取代代自自氧氧化化管管。样品品管管测定定时先先加加入入预热的的待待测酶液液，在在25水水浴浴锅中中保保温温10min，再再加加入入预热的的邻苯三酚。其余步苯三酚。其余步骤同同邻苯三酚自氧化速率的苯三酚自氧化速率的测定定。3.数据数据处理理 3.1 3.1 加入加入SODSOD酶前后前后邻苯三酚自氧化速率的苯三酚自氧化速率的计算算 3.2 3.2 SOD酶活力活力计算：算：(酶活力活力单位定位定义:在一定条件下在一定条件下,每每1mL反反应液中每液中每分分钟抑制抑制邻苯三酚自氧化速率达苯三酚自氧化速率达50%时的的酶量定量定义为一一个活力个活力单位。位。)SDS-PAGE技技术及原理及原理酶固定化技固定化技术酶固定化技固定化技术邻苯三酚的自氧化曲苯三酚的自氧化曲线(25 pH8.2Tris-HCL缓冲液4.5mL 45mL邻苯三酚溶液0.01mL)BackSOD酶对邻苯三酚自氧化的抑制苯三酚自氧化的抑制酶活力活力测定曲定曲线Back清清场1.各各组将将实验台清理好，台清理好，实验用具用具清洗干清洗干净，恢复，恢复实验开始开始时的状的状态。2.派人清派人清扫实验室。室。色谱法色谱法纯化超氧化物歧化酶纯化超氧化物歧化酶 操作步骤操作步骤 1 1、DEAE-DEAE-纤维素的预处理：纤维素的预处理：DEAE-纤维素2 2、装柱、装柱 （1 1）层析柱用洗涤液洗清洁，柱）层析柱用洗涤液洗清洁，柱的下端联接塑料管，装上螺旋夹。的下端联接塑料管，装上螺旋夹。关上螺旋夹，柱内装入缓冲液关上螺旋夹，柱内装入缓冲液I I，微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出，微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出，赶走死区及塑料管中的气泡，柱赶走死区及塑料管中的气泡，柱中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。（2 2）将基本平衡好的）将基本平衡好的DEAE-DEAE-纤维素纤维素浆液（约有浆液（约有1 1倍体积的缓冲液倍体积的缓冲液I I）放在抽滤瓶中减压除尽气泡，然放在抽滤瓶中减压除尽气泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高约高约1cm1cm高度时，部分旋松螺旋夹，高度时，部分旋松螺旋夹，让溶液缓慢流出去，注意此时的让溶液缓慢流出去，注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢，流速要比正常洗脱时的流速慢，陆续加入较多的浆液，直至达到陆续加入较多的浆液，直至达到高高10cm10cm以上的柱床体积。以上的柱床体积。层析柱3、平衡平衡 当全部交换剂装入柱中后，用上柱起始当全部交换剂装入柱中后，用上柱起始缓缓 冲液进行平衡。流速可维持在冲液进行平衡。流速可维持在4mL/15min4mL/15min，直至流出液的，直至流出液的pHpH与上柱缓冲液与上柱缓冲液完全相同。（一般要平衡完全相同。（一般要平衡8h8h以上或过夜。）以上或过夜。）4、层析 用毛细吸管小心吸去交换剂上面大部分液体，打开出口使缓冲液恰流到表面，关闭出口。用毛细吸管小心地沿柱壁四周缓缓加入SOD粗酶液，打开出口，使样品溶液进入纤维素内，至几乎露出床面时，柱壁用少量缓冲液小心洗涤23次，然后装入缓冲液，使液面高出创面23 cm左右。5、洗脱、洗脱（1）按图）按图8-9将梯度洗脱器和将梯度洗脱器和层析柱连接好。层析柱连接好。（2）在洗脱瓶）在洗脱瓶A（贮存器）和（贮存器）和洗脱瓶洗脱瓶B（混合器）内各装入（混合器）内各装入100mL缓冲液缓冲液和缓冲液和缓冲液，注，注意两洗脱瓶，特别是液面应处于意两洗脱瓶，特别是液面应处于同一水平面，同时应排除连接管同一水平面，同时应排除连接管内气泡。内气泡。（3）开动电磁搅拌器开关，调）开动电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混合器内缓冲液节搅拌速度，以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。旋转而无明显旋涡为宜。（4）将两瓶和柱上下连接管道）将两瓶和柱上下连接管道打开，开始收集洗脱流出液，控打开，开始收集洗脱流出液，控制流速在制流速在1.5mLmin。收集液收集液测定蛋白质浓度和酶活性。测定蛋白质浓度和酶活性。（5）收集合并具有）收集合并具有SOD活性部活性部分的洗脱液，透析浓缩后冷冻干分的洗脱液，透析浓缩后冷冻干燥即得纯化燥即得纯化SOD（淡蓝绿色产品）（淡蓝绿色产品）。1.SOD等电点的测定（一）SOD等电点的测定（1）取同样规格的试管4支，加入各试剂，然后混匀。此时 4个管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。（2）各加SOD的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。（二）蛋白质的沉淀及变性1、蛋白质的盐析 蛋白质的盐析:无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。盐溶:由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。于试管中加入蛋白质溶液5mL，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。此时析出沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。点样点样加加样样品迁品迁移方向移方向电泳泳过程中分子迁移的程中分子迁移的规律，小分子走在前律，小分子走在前头，大分，大分子滞后。子滞后。电泳凝胶相当于凝胶泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个中的一个带孔胶粒。孔胶粒。混合混合样品品带孔胶孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向泳方向 电泳泳 小分子小分子大分子大分子谢谢大家！