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应重视儿童脑胶质瘤的分子病理诊断 摘要 胶质瘤是儿童常见的中枢神经系统肿瘤之一。越来越多的研究显示与成人相比，有些肿瘤尽管在形态学上与成人表现相似，诊断名称也一样，但却具有独特的分子遗传学特征及完全不同的生物学行为，因此儿童的脑胶质瘤绝非成人的“微缩版”。2021 年末发布的第 5 版世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类中，相当重要的修订之一就是将儿童常见的一些弥漫性胶质瘤单独区分开来，并进一步分成了儿童型弥漫性低级别胶质瘤和儿童型弥漫性高级别胶质瘤两大类。而分类的依据除了组织学形态和临床特点，更多地包含了分子特征。因此医师在临床实践中，一定要重视分子病理诊断对儿童胶质瘤诊治的重要意义。中枢神经系统肿瘤是儿童常见的实体肿瘤类型，约占所有儿童肿瘤的 1/4，也是仅次于白血病的第二位儿童恶性肿瘤1，而胶质瘤是儿童常见的中枢神经系统肿瘤之一。由于其特殊的发病部位，以及目前仍然有限的治疗手段，儿童的胶质瘤即便是生物学行为良性，仍然会存在较高的致死率，或者是由于治疗的不良反应严重而影响儿童的生长发育和生存质量。自 2016 年的世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类（WHO classification of tumours of the central nervous system，CNS WHO）第 4 版修订版颁布以来，近些年对胶质瘤分子生物学的研究日渐深入，而越来越多的研究结果也显示与成人相比，发生在儿童的胶质瘤具有其独特的分子遗传学特征，有些肿瘤即便是形态学上与成人表现相似，诊断名称也一样，但却可能具有完全不同的分子通路及生物学行为，因此儿童脑胶质瘤绝非成人的“微缩版”。认识到这一点不仅能保证精准的病理诊断，也能为今后精准个体化治疗儿童胶质瘤开辟新的思路。2021 年末发布的第 5 版CNS WHO 肿瘤分类，最重要的修订之一就是将儿童常见的一些弥漫性胶质瘤单独区分开来，分为了儿童型弥漫性低级别胶质瘤和儿童型弥漫性高级别胶质瘤两大类2。而分类的依据除了病理形态和临床特点，更多地包含了分子特征。因此医师在临床实践中一定要重视分子病理诊断对儿童胶质瘤诊治的重要意义。一、儿童胶质瘤的病理诊断原则 发生在儿童的胶质瘤具有自身的一些明确特点，即便是一些组织学形态和成人相似、按照既往的分类也同成人诊断一样的胶质瘤，由于其年龄、生长方式、部位的不同，其背后的分子机制也可能大相径庭，而相应的生物学行为和预后也不能一概而论。总的来讲，对于儿童胶质瘤的病理诊断有以下几点需要注意。1.关注生长方式：儿童常见的胶质瘤可以分为弥漫性生长和局限性生长两大类。在第 5 版分类中，局限性星形细胞胶质瘤（circumscribed astrocytic gliomas）作为单独一大类列出，其中包括了 6 种肿瘤类型，虽然并不是所有的类型都常见于儿童，但相当一部分类型好发于儿童和青少年，如毛细胞星形细胞瘤（pilocytic astrocytoma，PA）、星形母细胞瘤（astroblastoma）、多形性黄色星形细胞瘤（pleomorphic xanthoastrocytoma，PXA）等。这些肿瘤在影像上界限清楚，可伴有囊性变和显著的强化，但这并不是恶性的指征。镜下肿瘤组织与周围界限也比较清晰。弥漫性生长的儿童胶质瘤又分成低级别和高级别，可以发生在半球或中线结构，与周围界限不清，镜下往往见到软脑膜下弥漫生长、沿着血管间隙生长、沿着神经束生长等继发结构。需要注意的是生长方式与预后是密切相关的，有些显微镜下相似的形态，如果是界限清楚的局限性生长，理论上可以完整切除，预后就会较好，而弥漫性生长则更加容易复发。2.关注肿瘤的部位：相对于成年人，更多的儿童胶质瘤好发于中线和幕下，部位的不同也会导致预后的明显差异，如一些发生在中线的弥漫性胶质瘤，无论组织学级别如何，由于具有特定的分子改变，常常表现为4 级肿瘤的恶性生物学行为。3.关注组织学级别：儿童胶质瘤同样按照 WHO 的组织学分级标准分为 14 级。同样的组织学分级指标在不同的肿瘤类型中所提示的级别不同，如在室管膜瘤中出现坏死和血管增生，应该被诊断为室管膜瘤 3 级而不是胶质母细胞瘤 4 级。4.关注年龄的相关性：即便均属于儿童型的胶质瘤，一些发生在婴儿（1 岁以内）的肿瘤和发生在儿童、青少年的同样形态肿瘤的预后也会有显著不同。而这些现象背后原因的揭示，也得益于近些年来分子病理学的迅速发展。目前来看，相比于组织学特点，儿童胶质瘤临床上的特点往往和肿瘤的分子特征相关性更为显著。二、常见儿童胶质瘤的分子病理学进展 按照第 5 版 CNS WHO 肿瘤分类，儿童常见的胶质瘤包括了儿童型弥漫性低级别胶质瘤、儿童型弥漫性高级别胶质瘤、一部分局限性星形细胞胶质瘤和室管膜瘤。脉络丛肿瘤也是儿童常见的类型，以往认为也属于胶质瘤的范畴，但新版分类里因其具有显著的上皮分化，不再将其放在胶质瘤的范围内，而是单独作为一类。（一）儿童型弥漫性低级别胶质瘤（pediatric-type diffuse low-grade gliomas）儿童最常见的胶质瘤类型是毛细胞星形细胞瘤，在第 5版 CNS WHO 肿瘤新分类中将其放入局限性星形细胞胶质瘤大类中，与之相比，儿童的弥漫性低级别胶质瘤并不常见。其在形态上，与成人的弥漫性胶质瘤和 PA 均有重叠和交叉，不存在IDH和H3基因的突变，更多的是MAPK信号通路和PI3K信号通路的激活。新分类中儿童型弥漫性低级别胶质瘤包括了 4 种肿瘤类型。1.弥漫性星形细胞瘤 MYB/MYBL1 改变（diffuse astrocytoma，MYB-or MYBL1-altered）：是比较罕见的一类儿童低级别胶质瘤3，好发于大脑半球靠近皮质的部位，常常和癫痫发作相关；镜下形态较单一的肿瘤性星形细胞弥漫分布，细胞形态温和、核分裂罕见，没有微血管增生和坏死；通常 oligo-2、SOX-10 阴性表达，不表达 CD34。特征性分子改变是 MYB/MYB L1 基因家族的结构变异，MYB/MYB L1可以和一些伴侣基因发生融合，最常见的基因包括 PCDHGA1、MMP16、MAML2 等4。基因的重排导致了其编码蛋白的 C 端抑制结构域发生了截断，从而导致蛋白过表达，造成肿瘤的增殖和分化抑制。该类肿瘤通常显示出良性的临床生物学行为，WHO 分级 1 级4-5。2.血管中心型胶质瘤（angiocentric glioma）：在上一版分类中归属于其他胶质瘤类型，由于最常见于儿童和青少年，第 5 版新分类中归入儿童型弥漫性低级别胶质瘤。该类肿瘤好发于脑表皮层，癫痫起病多见；组织学上的显著特征是形态单一的双极细胞以及血管中心的生长方式；具有室管膜细胞分化的免疫表型：GFAP+，EMA 点状+，oligo-2-；分子层面，几乎所有病例具有 MYB-QKI 基因融合5-6，或者极少数具有 MYB 的扩增或缺失等改变7（图 1）。该类肿瘤生长缓慢，多数仅通过手术切除可以治愈，WHO 1 级。图 1 血管中心型胶质瘤典型病例病理图 患者女，19 岁，右侧颞叶占位 1A：形态单一的双极细胞以及血管中心的生长方式 HE 染色 中倍放大；1B：肿瘤细胞dot-like样表达EMA EnVision法 高倍放大；1C：荧光原位杂交检测MYB基因分离阳性 FISH法 高倍放大 3.青少年多形性低级别神经上皮肿瘤（polymorphous low-grade neuroepithelial tumour of the young）：青少年好发，最多见于颞叶；镜下常常表现出胞质透明、核周空晕的少突胶质细胞瘤样形态，但也可以出现星形细胞瘤样的区域，甚至出现形态上的多形性，但缺乏坏死或微血管增生；广泛钙化是另一个常见特征；免疫组化往往弥漫或片状表达 CD34，提示其发生可能和异常调节的神经前体细胞有关（图 2）。分子特征主要是 MAPK 通路相关分子异常，主要涉及 FGFR2、FGFR3 或 BRAF 基因等，其中 BRAF V600E 突变占30%40%，FGFR2/3 基因融合占 30%40%8，最近也有检测到 QKI-NTRK2 等融合的报道9。多数研究提示该类肿瘤预后较好（WHO 1 级），但目前也有个别报道如果同时伴有其他基因突变，如 TP53、ATRX、PTEN、TEK，可能与其恶性转化有关10。图 2 青少年多形性低级别神经上皮肿瘤典型病例病理图及基因检测图 患者男，16 岁，左颞叶占位 2A：肿瘤细胞核圆形、胞质空亮，呈少突胶质细胞瘤样结构，伴有散在钙化 HE 染色 中倍放大；2B：肿瘤细胞弥漫表达 CD34 EnVision 法 中倍放大；2C：检测出 FGFR3-TACC3 基因融合 二代测序（NGS）法 4.弥漫性低级别胶质瘤，MAPK 途径改变（diffuse low-grade glioma，MAPK pathway-altered）：很罕见的肿瘤类型，主要发生在儿童，形态上的特点是比较模糊的，主要是低级别的星形细胞瘤或少突胶质细胞瘤形态，在临床和影像上都无特殊表现。定义该类肿瘤的关键是检测到具有MAPK 信号通路相关基因的改变3，11。其中最常见的是 FGFR1的酪氨酸激酶结构域（tyrosine kinase domain，TKD）的内部串联重复（internal tandem duplication，ITD）或突变，或 BRAFV600E 突变。该组肿瘤是否属于明确的一类肿瘤实体还不确定，因此目前 WHO 尚未定级，但普遍认为其预后较好，但也有报道提示存在 BRAFV600E 突变或 CDKN2A 的纯合性缺失与肿瘤进展有关12。最近，还有一些好发于儿童的特殊分子特征的胶质瘤被文献报道，如在中脑顶盖区的胶质瘤中发现较高比例的 KRAS突变（尤其是 G12R 位点突变）以及 BRAF（包括 KIAA1549-BRAF、V600E 或 T599dup）改变，且甲基化分析显示其具有独特的甲基化谱特征13。（二）儿童型弥漫性高级别胶质瘤（pediatric-type diffuse high-grade gliomas）包括了一组组织学 34 级的弥漫性胶质瘤，这组肿瘤形态上的特征并不显著，但其生物学行为和部位却显著相关，且其常常伴有明确的与成人不同的分子特征。在新分类中儿童型弥漫性高级别胶质瘤包含了以下 4 种肿瘤类型。1.弥漫中线胶质瘤 H3K27 变异型（diffuse midline glioma，H3 K27-altered）：发生在脊髓、脑干、丘脑等中线部位的一组浸润性生长的弥漫性胶质瘤，最初认为其关键的分子改变是 H3K27M 的突变，导致组蛋白 3 第 27 位赖氨酸被甲硫氨酸替换，但随后更多的研究显示，除了 H3K27M 的突变，还存在一些其他的类似机制并最终导致 H3K27 位点的三甲基化修饰受到抑制，并表现为 H3K27me3 蛋白的表达缺失14。根据机制的不同15-16，目前分为 4 个亚型：H3.3 p.K28M（K27M）突变；（2）H3.1 或 3.2 p.K28M（K27M）突变；（3）H3 野生型伴 EZHIP 过表达；（4）EGFR 突变。2.弥漫半球胶质瘤 H3G34 突变（diffuse hemispheric glioma，H3 G34-mutant）型：主要发生在青少年的一组半球胶质瘤，呈现高级别胶质瘤的形态，并可伴有原始神经元成分，且常常存在弥漫性生长方式（图 3）。该类肿瘤的关键分子改变是 H3F3A 基因突变导致组蛋白 3 第 34 位甘氨酸突变为精氨酸或缬氨酸（G34R/V）17。这类肿瘤中 oligo-2的基因座处于高甲基化状态，因此 oligo-2 蛋白常阴性表达。整体预后稍好于弥漫中线胶质瘤。图 3 弥漫半球胶质瘤 H3G34 突变型典型病例病理图 患者男，15 岁，左额占位 3A：肿瘤细胞异型性明显、密度增高，呈高级别胶质瘤形态 HE 染色 高倍放大；3B：肿瘤细胞oligo-2阴性表达 EnVision法 高倍放大；3C：肿瘤细胞核阳性表达 H3G34R 突变蛋白抗体 EnVision 法 高倍放大 3.弥漫儿童型高级别胶质瘤，H3 和 IDH 野生型（diffuse pediatric-type high-grade glioma，H3-wildtype and IDH-wildtype）：这类肿瘤的发生部位和临床表现均没有明确的特征性，组织学上表现为高级别胶质瘤形态，典型胶质母细胞瘤样或原始未分化的结构均可见到，免疫表型不同程度表达胶质细胞标记物，或者神经元标记物。基本的分子特征是 H3 和 IDH 野生型，同时可以伴有其他一些分子改变，包括：PDGFRA 扩增/突变、TP53 突变、NF1 改变、EGFR 扩增/突变或 MYCN 扩增等。目前根据特征性甲基化谱分为 pHGG RTK1、pHGG RTK2、pHGG MYCN 三型18-19。pHGG RTK1 型中最常见 PDGFRA 的扩增；pHGG RTK2 型最常见 EGFR 扩增和 TERT启动子的突变；pHGG MYCN 型常见 MYCN 扩增。该类型鉴别诊断广泛，基本要排除其他一些特定分子特征的高级别胶质瘤，明确诊断需要甲基化谱分析或二代测序（next-generation sequencing，NGS）的检测。4.婴儿型半球胶质瘤（infant-type hemispheric glioma）：最近的研究发现，60%80%发生在婴儿半球的高级别胶质瘤可以特征性地检测到多个融合基因，这些基因多与 RTK 信号通路相关，包括了 ALK、ROS1、NTRK 和 MET 基因融合20。发生在婴儿的高级别胶质瘤虽然形态上可能显示较强的异型性，但与儿童和青少年相比，预后要更好一些，5 年存活率 40%50%，且常是单个基因驱动，适合靶向治疗21。（三）儿童常见的局限性星形细胞胶质瘤（circumscribed astrocytic gliomas）该类肿瘤在影像上表现为局限性的生长，显微镜下肿瘤组织与周围正常脑组织界限也比较清楚，因此理论上通过外科手术的完整切除可以达到治愈。分子水平上均为 IDH 野生型，且常有特定的分子特征。PA 是儿童最常见的局限性星形细胞胶质瘤，也是最常见的儿童胶质瘤类型，预后很好，10年存活率超过 90%。PA 具有独特的形态特征，包括双相生长方式、Rosenthal 纤维、嗜酸性颗粒小体、微血管增生及一些退行性改变。分子改变主要是 MAPK 通路相关，最常见的是 BRAF-KIAA1549 的融合22，其他涉及的基因还包括 NF1的胚系突变（最常见于神经纤维瘤病型）、BRAF 突变、K-RAS突变、FGFR1 的突变或融合等，还有 NTRK 和 RAF1 融合的报道23。研究还发现不同部位的 PA 分子特征和甲基化表型均有所不同，如 BRAF-KIAA1549 最常见于小脑半球，BRAFV600E突变则最常见于幕上，FGFR1 的改变可见于多种解剖部位24-25。值得一提的是 PA 的分子改变和一些儿童型低级别弥漫性胶质瘤是可以有交叉重叠的，因此，单纯的依靠某一个分子特征来诊断是非常不可取的，生长方式和形态学表现在鉴别诊断时也极为重要。另外一个常见于儿童的局限性胶质瘤是星形母细胞瘤伴 MN1 改变（astroblastoma，MN1-altered），在上一版分类中星形母细胞瘤归于“其他胶质瘤”一组，近期研究发现其特征性的 MN1 改变，因此新版定义中增加分子特征。星形母细胞瘤形态上具有围血管生长方式、血管周围无核区、假菊形团结构、间质玻璃样变等特点（图 4），需要和室管膜瘤、上皮样胶质母细胞瘤、PXA 等鉴别，但其独特的分子特征可以有助于诊断。位于 22q12.1 的 MN1 基因改变主要是和 Xp22.13 的 BEND2 基因发生融合26，但也有和其他一些配体基因融合的报道。该类肿瘤目前没有给予 WHO分级，但有限的资料显示具有 MN1 改变的星形母细胞瘤虽然可以出现复发，但总体预后仍然较好27。图 4 星形母细胞瘤伴 MN1 改变典型病例病理图 患者女，10 岁，右额颞占位 4A：肿瘤细胞围血管周围放射状排列呈菊形团样结构 HE 染色 高倍放大；4B：部分肿瘤细胞胞膜和胞质阳性表达 EMA EnVision 法 高倍放大；4C：荧光原位杂交检测提示 MN1 基因分离阳性 FISH 法 高倍放大（四）室管膜瘤（ependymoma）室管膜瘤可以发生在任何年龄，但儿童好发，在儿童常见脑肿瘤中排第三位，儿童的室管膜瘤最常见于幕下，70%发生在后颅凹。传统的室管膜瘤根据细胞密度、核分裂、血管增生和坏死等指标划分为级（间变性室管膜瘤），但多年的临床实践已经证实，组织学的分级对临床预后方面的指导作用甚微。2016 年的 WHO 室管膜肿瘤分类中虽然仍然保留了以往的分级，但已经提出了一种结合了发病年龄、解剖部位和 DNA 甲基化谱分析的九分类分子分型28。第 5 版的 WHO 分类中将室管膜肿瘤分为 10 个类型，其中对于室管膜下瘤和黏液乳头型室管膜瘤，目前的研究提示其形态学和甲基化谱分类、临床相关性之间的关系均不明确，也不确定分子表型是否优于形态学分类，因此对于这两种肿瘤仍然按照形态学分别列为两种类型。室管膜瘤首先按解剖部位分为3 组：幕上（supratentorial，ST）、后颅窝（posterior fossa，PF）及脊髓（spinal cord，SC）。幕上室管膜瘤中存在两个高频的融合基因，ZFTA（C11orf95）-RELA 融合基因和YAP1-MAMLD1 融合基因29，这两组幕上室管膜瘤在临床特征上存在差异，前者儿童、青少年和成人均可发生，预后较差；后者多见于幼儿（3 岁以下），预后相对较好，因此分出ST-ZFTA 与 ST-YAP1 两种亚型。后颅窝室管膜瘤中没有发现特异的基因改变，但通过甲基化谱可将其分为 PFA 和 PFB 两种类型。PFA 型室管膜瘤好发于婴儿和幼童，而 PFB 型常见于大龄儿童和成人。多数研究显示 PFA 型室管膜瘤预后相对较差，通过免疫组化检测到 H3K27me3 的表达缺失可以协助区分30-31。脊髓室管膜瘤更多见于成年人，其中存在一组伴MYCN 扩增且预后不良，因此作为一个独立的类型列出32。综上可以看出，发生在儿童的胶质瘤虽然在组织学形态上与成人相比没有明显的不同，但是却具有非常复杂、截然不同的分子遗传学的改变，且这些改变常常和肿瘤的部位和年龄具有相关性，并产生不同的生物学预后。因此在临床工作中一定要重视儿童胶质瘤的分子病理检测，加强相关分子检测平台的建设，从而对这类儿童的脑肿瘤做到更加精准的诊治。