血红蛋白的提取与分离..ppt

课题课题3 血红蛋白的提取血红蛋白的提取和分离和分离(一）蛋白质一）蛋白质占细胞干重的占细胞干重的5050以上，细胞中含量最多的以上，细胞中含量最多的有机物有机物2 2、组成元素、组成元素C C、HH、OO、N N一、基础知识一、基础知识1 1、含量、含量3 3、相对分子质量、相对分子质量高分子化合物高分子化合物4 4、基本组成单位、基本组成单位氨基酸氨基酸5 5、氨基酸通式、氨基酸通式R RHHC CCOOHCOOHNHNH2 26 6、氨基酸连接方式、氨基酸连接方式脱水缩合脱水缩合8 8、分子结构、分子结构7 7、肽键、肽键COCONHNH氨基酸氨基酸肽链肽链蛋白质蛋白质脱水缩合脱水缩合盘曲折叠盘曲折叠（一条或者多条）一条或者多条）1010、生理功能、生理功能细细胞胞和和生生物物体体的的结结构构物物质质，是是人人体体发发育育和和组组织织更更新新的的主主要要原原料料，具具有有运运输输、调调节节、免免疫疫、催化等作用，是一切生催化等作用，是一切生命活动的主要承担者命活动的主要承担者氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别序变化多端；多肽链的空间结构千差万别9 9、蛋白质结构的多样性、蛋白质结构的多样性氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计基，另一端只有一个羧基（不计R R基上的氨基和基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个基和羧基都是一个若有个若有个n n氨基酸分子缩和成氨基酸分子缩和成mm条肽链条肽链,则可形成则可形成n-mn-m个肽键个肽键,脱去个脱去个n-mn-m个水分子，至有氨基个水分子，至有氨基和和 羧基各羧基各mm个个1111、相关计算、相关计算蛋白质可以含有一条或蛋白质可以含有一条或n n条肽链、肽链通过化条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构构关于蛋白质相对分子量的计算：关于蛋白质相对分子量的计算：n n 个氨基酸形个氨基酸形成成mm条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,a,那么那么由此形成的蛋白质的相对分子量为由此形成的蛋白质的相对分子量为n a-(n-m)n a-(n-m)18181 1、分离生物大分子的基本思路、分离生物大分子的基本思路选用选用一定的物理或化学一定的物理或化学的方法分离具有的方法分离具有不同不同物理或化学性质物理或化学性质的生物大分子的生物大分子2 2、蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理根据蛋白质各种特性的差异，如根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可等等，可以用来分离不同蛋白质以用来分离不同蛋白质(二）蛋白质的提取二）蛋白质的提取3 3、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构变性、变性、空间结构4 4、人们用鸡的红细胞提取、人们用鸡的红细胞提取DNADNA，用人的红细用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于进便于进行行DNADNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白（三）（三）凝胶色谱法凝胶色谱法实例：实例：葡聚糖、琼脂糖葡聚糖、琼脂糖3 3、凝胶、凝胶1 1、别名：、别名：分配色谱法分配色谱法性质：一些性质：一些微小多孔微小多孔的球体，内含许多的球体，内含许多贯穿贯穿的通道的通道2 2、概念：根据被分离物质的概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子蛋白质相对分子质量的大小，质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的利用具有网状结构的凝胶的分子分子筛作用，筛作用，来进行分离来进行分离大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道的通道4 4、凝胶色谱法的原理、凝胶色谱法的原理分子筛效应分子筛效应分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离得以分离当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢长，移动速度较慢5 5、具体过程、具体过程蛋白质分子量的大小蛋白质分子量的大小4 4、依据的特性、依据的特性（四）缓冲溶液（四）缓冲溶液 1 1、概念、概念在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液稍加稀释不引起溶液PHPH发生明显变化的作用叫做发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液能够抵制外界的酸或碱的对溶液的能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PHPH值的影响，值的影响，维持维持PHPH基本不变基本不变2 2、作用、作用4 4、缓冲溶液的组分分类、缓冲溶液的组分分类弱酸和弱酸盐组合弱酸和弱酸盐组合 H H2 2COCO3 3 NaHCO NaHCO3 3 CHCH3 3COOH CHCOOH CH3 3COONaCOONa3 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由通常由1 12 2种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。调溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在不同就可以制得在不同PHPH范围范围内使用的缓冲液内使用的缓冲液弱碱和弱碱盐弱碱和弱碱盐 NHNH4 4OH NHOH NH4 4CLCL多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐 NaHNaH2 2POPO4 4 Na Na2 2HPOHPO4 4 KH KH2 2POPO4 4 K K2 2HPOHPO4 4思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的胞内的PHPH环境，保证血红蛋白的正常结构和功环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察能，便于观察(红色红色)和科学研究和科学研究(活性活性)（五）电泳：（五）电泳：1 1、概念、概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2 2、原理、原理在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动所带电荷相反的电极移动许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些基下，这些基团会带上正电或负电团会带上正电或负电电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离子的分离3 3、类型、类型琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳4 4、实例、实例由单体丙烯酰胺和交联剂由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺在在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成三维网的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶状结构的凝胶十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDSSDS）聚丙稀酰胺凝聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量胶电泳测定蛋白质分子量应用应用聚丙稀酰胺凝胶聚丙稀酰胺凝胶蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带所带静电荷的多少静电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素等因素原理原理 SDSSDS作用作用为了消除为了消除静电荷对迁移率的影响静电荷对迁移率的影响可以在凝胶可以在凝胶中加入中加入SDSSDSSDSSDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在成的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会解聚成单的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。量。SDSSDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDSSDS复合物，复合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小大小 SDSSDS作用机理作用机理讨论：如何测定蛋白质的分子量？讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售标准蛋白试剂出售.二、实验操作二、实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定1 1、样品处理、样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤(1)(1)血液组成血液组成（二）操作过程（二）操作过程血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白（9090）两个两个a a肽链肽链两个两个 一一肽链肽链四个亚铁红四个亚铁红素基团素基团成分成分每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可此基团可携带携带一分子氧或一分子二氧化碳，一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因血红蛋白因含有含有血红素血红素而呈红色而呈红色组成及作用组成及作用本课题可选用猪、牛、羊或其他本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物脊椎动物的血的血液来分离血红蛋白液来分离血红蛋白选材选材(2)(2)红细胞的洗涤红细胞的洗涤洗涤红细胞目的洗涤红细胞目的除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少分离纯化，不可洗涤次数过少洗涤操作洗涤操作A A、采集血样采集血样B B、低速短时间离心低速短时间离心（速度越高和时间越长会（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果）效果）C C、吸取血浆：上层透明的黄色血浆吸取血浆：上层透明的黄色血浆D D、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.90.9的氯化钠溶液洗涤的氯化钠溶液洗涤E E、低速离心（低速短时间）低速离心（低速短时间）F F、重复重复4 4、5 5步骤三次，直至上步骤三次，直至上清液中已没清液中已没有黄色，表明洗涤干净有黄色，表明洗涤干净(3)(3)血红蛋白的释放血红蛋白的释放加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积，原血液体积，再加再加4040体积的体积的甲甲苯苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌置于磁力搅拌器上充分搅拌1010分钟分钟（加（加速细胞破裂）速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白细胞破裂释放出血红蛋白(4)(4)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液过程过程将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 min10 min第第1 1层（最上层）：层（最上层）：甲苯层（无色透明）甲苯层（无色透明）第第2 2层（中上层）：层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）薄层固体）第第3 3层（中下层）：层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）色透明液体）第第4 4层（最下层）：层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次试管中溶液层次用用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体中静置片刻后，分出下层的红色透明液体分离分离取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷磷酸缓冲液酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时小时(5)(5)透析透析除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质过程过程透析目的透析目的2 2、凝胶色谱、凝胶色谱（1 1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，两端厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平需用砂纸磨平底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼覆盖尼龙网，再用龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的目尼龙纱包好，插到玻璃管的一一端端底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底体残留，蛋白质分离不彻底注意事项：注意事项：安装其他附属结构安装其他附属结构顶塞的制作顶塞的制作打孔打孔 安装玻璃管安装玻璃管组装组装将上述三者按相应位置组装成一个整体将上述三者按相应位置组装成一个整体（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择凝胶的选择A A、材料材料“G”G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围离范围7575表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水水7.57.5克克B B、代表意义：代表意义：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶凝胶浸泡于浸泡于蒸馏水或洗脱液蒸馏水或洗脱液中充分溶胀中充分溶胀后，配成后，配成凝胶悬浮液凝胶悬浮液凝胶的前处理凝胶的前处理凝胶色谱柱的装填方法凝胶色谱柱的装填方法A A、固定固定B B、装填装填将色谱柱处置固定在支架上将色谱柱处置固定在支架上将凝胶悬浮液将凝胶悬浮液一次性的一次性的装填入色谱柱内，装填入色谱柱内，装填时装填时轻轻敲动色谱柱，轻轻敲动色谱柱，使使凝胶填装均匀凝胶填装均匀注意：注意：2 2、装填凝胶柱时不得气泡存在：、装填凝胶柱时不得气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果低分离效果1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙的空隙1 1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果子物质的分离效果 注意：注意：2 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的高的操作压下，用操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸磷酸缓冲液缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡1212小时小时洗涤平衡洗涤平衡（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱调节缓冲液面调节缓冲液面滴加透析样品滴加透析样品吸管吸吸管吸1 1mlml样品加到色谱柱的顶端，样品加到色谱柱的顶端，滴加样品滴加样品时，时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面意不要破坏凝胶面打开打开下端出口，下端出口，使柱内使柱内缓冲液缓冲液缓慢下降到与缓慢下降到与凝凝胶面平齐胶面平齐关闭出口关闭出口样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床洗脱洗脱加样后加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口小心加入小心加入pHpH为为7 7的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液到适到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱洗脱收集：收集：待待红色的蛋白质红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每流出液，每5 5mlml一试管，连续收集一试管，连续收集（在分离过程（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）制作成功）讨论：讨论：答：让血红蛋白处在稳定的答：让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持范围内，维持结构和功能结构和功能注意：正确的加样操作注意：正确的加样操作1 1、不要触及破坏凝胶面不要触及破坏凝胶面2 2、贴壁加样贴壁加样3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动、使吸管管口沿管壁环绕移动1 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？液处理的目的是什么？2 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。大大简化了实验操作。血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定3 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？（三）三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳2 2、试剂的配制、试剂的配制丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺:用去离子用去离子水配制水配制29%29%（29 g/100 29 g/100 mLmL，下同）的丙烯下同）的丙烯酰胺和酰胺和1%1%的的N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液甲叉双丙烯酰胺的贮存液十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）:用去离子水配成用去离子水配成10%10%的贮存液，于室温保存的贮存液，于室温保存鉴定血红蛋白纯度鉴定血红蛋白纯度1 1、目的、目的用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的TrisTris缓冲液缓冲液 TEMED TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合用去离子水配制用去离子水配制10%10%过硫酸铵：作用提供过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液由基。此溶液须配制新鲜液TrisTris甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 25 25 mmolmmol/L/L TrisTris，250 250 mmolmmol/L/L 甘氨酸甘氨酸 (pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS样品处理液样品处理液 50 50 mmolmmol/L/L TrisTrisHCl(pHHCl(pH 6.8)6.8)，100 100 mmolmmol/L DTT(/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用或用5%5%的巯基乙醇，的巯基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘油的甘油脱色液脱色液 10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰醋酸的冰醋酸染色液染色液 0.1%0.1%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲醇，的甲醇，10%10%的冰醋酸的冰醋酸1 1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行操作必须在通风橱内或通风处进行注意事项：注意事项：2 2、TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命3 3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套骤完成。操作时要戴好一次性手套 SDS-SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备聚丙烯酰胺分离胶制备（1 1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板（2 2）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶制备聚丙烯酰胺凝胶制备用去离子水用去离子水4.6 4.6 mLmL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺2.7 2.7 mLmL，1.5mol1.5mol、pH 8.8pH 8.8的的TrisTris缓冲液缓冲液2.5 2.5 mLmL，10%10%的的SDS 0.1 SDS 0.1 mLmL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.1 0.1 mLmL，TEMED 0.006mLTEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间空间(梳子的齿长再加梳子的齿长再加0.5 cm)0.5 cm)，再在胶液面上再在胶液面上小心注入一层水（约高小心注入一层水（约高23 mm23 mm），），以阻止氧以阻止氧气进入凝胶溶液气进入凝胶溶液3 3、电泳方法步骤、电泳方法步骤用去离子水用去离子水2.7 2.7 mLmL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺0.67 0.67 mLmL，1.0 mol1.0 mol、pH 6.8pH 6.8的的TrisTris缓冲液缓冲液0.5 0.5 mLmL，10%10%的的SDS0.041 SDS0.041 mLmL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.04 0.04 mLmL，TEMED 0.004 TEMED 0.004 mLmL，混合均匀，直接灌混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合合分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约30 min30 min），），倾出覆盖倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水水层，再用滤纸吸净残留水（3 3）样品处理）样品处理配制配制SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液（5 5）加样）加样在电泳样品中按在电泳样品中按1111体积比加入样品处理液，体积比加入样品处理液，在在100 100 温度下加热温度下加热3 min3 min，以使蛋白质变性以使蛋白质变性按顺序加样，加样量通常为按顺序加样，加样量通常为1025 L1025 L。样品可样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进即进行凝胶色谱分离之前行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品和凝胶色谱分离之后的样品的样品（4 4）浓缩胶聚合完全后（）浓缩胶聚合完全后（30 min30 min），），小心移出小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入TrisTris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。部两玻璃板之间的气泡。将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 8 V/cmV/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到到15 V/cm15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约底部上方约1 cm1 cm处，关闭电源处，关闭电源（6 6）电泳）电泳（7 7）剥胶）剥胶从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位角，以标注凝胶的方位（8 8）染色）染色将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h1-2 h染色完毕，倾出染色液染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色换脱色液脱色3-10 3-10 h h，其间需多次更换脱色液至背景清楚其间需多次更换脱色液至背景清楚（9 9）脱色）脱色（1010）观察结果）观察结果SDSSDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与是样品制备过程中蛋白质与SDSSDS的结合程度的结合程度观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见（见教科书图教科书图5-185-18），），如果分层不明显，可能是如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？描述处理后的样品发生了哪些变化吗？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。胶是否装填得均匀。此外，还可以此外，还可以加入大分子加入大分子的有色物质，的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色或红色葡聚糖，葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。消除气泡，消除不了时要重新装柱。2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？据此判断分离效果？