流式细胞仪原理及应用.ppt

致：致：流式细胞术概述流式细胞术概述流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念=流式细胞术（流式细胞术（Flow Flow CytometryCytometry,简称简称FCMFCM）是一种可以快速、是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态流动状态中的中的单单个个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选同时可以对特定群体加以分选=研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等球等=研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围 细胞结构细胞结构细胞大小细胞大小细胞颗粒度细胞颗粒度细胞表面积细胞表面积核浆比例核浆比例DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期RNARNA含量含量蛋白质含量蛋白质含量 细胞功能细胞功能细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的特异性抗原核的特异性抗原细胞活性细胞活性细胞内细胞内/外的细胞因子外的细胞因子激素结合位点、细胞受体激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化蛋白磷酸化pHpH值值钙离子浓度钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位细胞膜电位、线粒体膜电位 流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。鞘液流向废液桶。光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号电子系统：荧光信号和散射光信号经二极管和电子系统：荧光信号和散射光信号经二极管和PMT接收后接收后可转换为电信号，再通过模可转换为电信号，再通过模/数转换器转换为可被计算机识数转换器转换为可被计算机识别的数字信号，以图形的形式呈现给操作者别的数字信号，以图形的形式呈现给操作者散射光信号散射光信号FALS SensorLaser散射光信号散射光信号Right Angle Light Right Angle Light Detector Detector Cell Complexity Cell ComplexitySSCSSCForward Light Detector Forward Light Detector Cell Surface Area Cell Surface Area FSCFSCIncident Incident Light Light SourceSource=前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSC,Side ScatterSSC,Side Scatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）（红细胞溶解后）GranulocytesMonocytesLymphocytes流式细胞仪的检测信号流式细胞仪的检测信号荧光信号荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号荧光信号双色直接染色双色直接染色数据存储数据存储FCS2.0格式格式常以列表模式（常以列表模式（LISTMODE)：将每个细胞的每个检测参：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储量依次排列顺序存储FITC/PE双染样本双染样本数据显示数据显示直方图（直方图（Histogram）二维点图（二维点图（DotPlot）等高线图（等高线图（ContourPlot）密度图（密度图（Density）三维图（三维图（3DPlot）等）等单参数直方图分析单参数直方图分析数据分析数据分析=直方图分析直方图分析多参数散点图分析多参数散点图分析数据分析数据分析=等高图和密度图分析等高图和密度图分析数据分析数据分析=三维图分析三维图分析流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用=HIVHIV免疫分型，免疫分型，CD4CD4绝对计数绝对计数=淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=肿瘤的细胞周期和倍体分析肿瘤的细胞周期和倍体分析=网织红细胞计数网织红细胞计数=细胞移植的免疫状态监测细胞移植的免疫状态监测=干细胞计数干细胞计数=阵发性血红蛋白尿阵发性血红蛋白尿=HLA-B27HLA-B27检查检查=血小板功能及相关疾病血小板功能及相关疾病流式细胞仪的科研应用流式细胞仪的科研应用=免疫功能研究免疫功能研究=血小板分析（心脑血管疾病）血小板分析（心脑血管疾病）=细胞周期和倍体分析细胞周期和倍体分析=细胞凋亡细胞凋亡=干细胞研究干细胞研究=树突细胞研究树突细胞研究=肿瘤相关基因表达的研究肿瘤相关基因表达的研究=抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究=放疗放疗/化疗疗效的研究化疗疗效的研究淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原（原（CDCD分子）的表达，可以将淋巴细胞亚群区分分子）的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析开，进行定性分析各淋巴细胞亚群的百分含量各淋巴细胞亚群的百分含量淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为B B淋巴细胞（淋巴细胞（CD19+CD19+），），与体液免疫有关与体液免疫有关T T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+CD3+），），与细胞免疫有关与细胞免疫有关总总T T和总和总B B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NKNK细胞（细胞（CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+），），行使免疫监控功能，行使免疫监控功能，能能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。用。淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析根据根据CD4CD4、CD8CD8表达，表达，T T淋巴细胞又分为淋巴细胞又分为T T辅助辅助/诱导细胞（诱导细胞（CD3+CD4+CD3+CD4+）T T抑制抑制/细胞毒性细胞（细胞毒性细胞（CD3+CD8+CD3+CD8+）Th/Ts Th/Ts 评价那些自身免疫失调、被怀疑是免疫失调评价那些自身免疫失调、被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无r球蛋白血症）或继发性球蛋白血症）或继发性免疫缺陷病（如免疫缺陷病（如AIDS）造血干细胞移植后免疫重建（造血干细胞移植后免疫重建（6个月个月NK；9个月个月T、B）Th/TsTh/Ts：机体免疫功能亢进机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如：自身免疫性疾病，如SLESLE、类风、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）Th/TsTh/Ts：机体免疫功能低下机体免疫功能低下：AIDSAIDS、病毒感染、慢性活动性、病毒感染、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等移植后动态免疫监测：移植后动态免疫监测：急排临床症状出现前急排临床症状出现前1-51-5天，活化天，活化T T和和Th/TsTh/Ts持续持续，1.21.2预示急排；预示急排；Th/TsTh/Ts持续持续 表明可能感染，比值表明可能感染，比值1.081.08，可能性大，可能性大，0.20.2应停用免疫抑应停用免疫抑制剂；制剂；实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察治疗前常伴治疗前常伴T T 、Th/TsTh/Ts，放，放/化疗有效可恢复；化疗有效可恢复；淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好；淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好；探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）临床意义临床意义判断病人的机体免疫状态判断病人的机体免疫状态常见疾病的常见疾病的T 淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化：CD4+CD8+CD4+/CD8+类风湿性关类风湿性关节炎节炎 （活动期）（活动期）系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮 -或或 （活动期）（活动期）多发性硬化症多发性硬化症 重症肌无力重症肌无力 膜型肾小球肾炎膜型肾小球肾炎 胰岛素依赖性糖尿病胰岛素依赖性糖尿病 乙型肝炎乙型肝炎 自身溶血性贫血自身溶血性贫血 上呼吸道感染上呼吸道感染 常见疾病的常见疾病的T 淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化 CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+肿瘤肿瘤 再障及粒细胞减少症再障及粒细胞减少症 巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染 血小板减少血小板减少 活动性特应性皮炎活动性特应性皮炎 过敏性皮炎过敏性皮炎 淋巴细胞亚群双色分析淋巴细胞亚群双色分析12%76%49%26%11%AIDS 病人病人T亚群分析亚群分析27-51%15-44%50-84%先天性无先天性无 r 球蛋白血症球蛋白血症5-18%乳腺癌患者乳腺癌患者T淋巴细胞亚群变化淋巴细胞亚群变化TriTEST/MultiTestTriTEST/MultiTest与与T T淋巴细胞绝对计数淋巴细胞绝对计数使用三色试剂或四色免洗试剂使用三色试剂或四色免洗试剂样本使用样本使用EDTAEDTA抗凝全血，用血量抗凝全血，用血量5050uLuL免洗操作，减少细胞丢失免洗操作，减少细胞丢失绝对计数绝对计数TruCOUNTTruCOUNT管预先加有已知数量微球，在流式细管预先加有已知数量微球，在流式细胞仪上直接得到胞仪上直接得到T T淋巴细胞亚群的绝对含量，提高工作效淋巴细胞亚群的绝对含量，提高工作效率和计数的精确度率和计数的精确度单平台计数单平台计数报告报告T T淋巴细胞及淋巴细胞及THTH、TSTS百分含量、绝对含量和百分含量、绝对含量和H/SH/S比值比值TriTEST CD4/CD8/CD3TriTEST CD4/CD8/CD3分析分析与与T T淋巴细胞绝对计数淋巴细胞绝对计数h%T LymphCD3+Abs CnthCD3+CD4+%T LymphCD3+CD4+Abs CnthCD3+CD8+%T LymphCD3+CD8+Abs CnthT H/S RatioMultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19淋巴细胞淋巴细胞活化功能研究活化功能研究T淋巴细胞活化淋巴细胞活化细胞数目增殖细胞数目增殖细胞表面表达细胞表面表达活化标记活化标记分泌细胞因子分泌细胞因子CFSE示踪原理羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料，CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。体内、体外实验均可以应用Dilution of CFSE with cell divisionLyons and Parish,1994JIM,171;131Divisions:3 2 1 0CFSEFL-1(Log)Divisions:3 2 1 0葡萄球菌肠毒素刺激牛时间变化示意图，T淋巴细胞活化淋巴细胞活化细胞数目增殖细胞数目增殖细胞表面表达细胞表面表达活化标记活化标记分泌细胞因子分泌细胞因子T细胞激活抗原表达的动力学曲线细胞激活抗原表达的动力学曲线FastImmune Assay System快速全面检测淋巴细胞功能快速全面检测淋巴细胞功能 BDFastImmuneActivationSystem快速免疫活化检测系统快速免疫活化检测系统lymphocyte Activation4hStain15minLyse/Fix15minAcqusitionerythrocytestimulus优点优点快速快速全程全程单单核核细细胞胞成成熟熟粒粒细细胞胞原原幼幼细细胞胞，在在红红细细胞胞中中不不表表达达；SSC是是侧侧向向角角参参数数，反反应应细细胞胞的的颗颗粒粒度度（成成熟熟粒粒细细胞胞单单核核细细胞胞原原幼幼细细胞胞淋淋巴巴细细胞胞）。目前，国际上采用CD45SSC设设门门（Gating），可非常轻松地将白血病细胞与正常细胞分开，增加白血病免疫分型的准确性CD45的临床应用的临床应用用用CD45-SSC设设门门寻寻找找异异常常细细胞胞，将将细细胞胞分分为为5个个群群体体，当幼稚细胞达70-80%时，即可大致估计AL的类型。骨髓成分复杂，各种大小和分化程度的细胞均有，若不用CD45-SSC设门，我们检测到的阳性细胞的百分率是以总细胞为分母来计算，当时以阳性细胞大于20%为界线，现在以CD45-SSC设门，排除了正常细胞的干扰，阳性细胞的百分率是以幼稚细胞为分母，因此再以阳性细胞20%作界线则不太合适了，所以，用CD45-SSC设门寻找异常细胞时，以定性比定量更重要。正常人血液白细胞免疫表型散点图正常人血液白细胞免疫表型散点图正常人血液细胞免疫表型正常人血液细胞免疫表型T淋淋 巴巴 细细 胞胞：CD45+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD5+/CD7+，部部分分细细胞胞CD（16+56）+，无无CD4+CD8+双双阳性细胞阳性细胞B淋淋巴巴细细胞胞：CD45+、CD10-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13-NK细胞：细胞：CD45+、CD（16+56）+/CD3-单核细胞：单核细胞：CD45+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+中中性性粒粒细细胞胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比比CD33表达更高表达更高嗜嗜 酸酸 性性 粒粒 细细 胞胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比比CD33表达更高表达更高正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图正常人骨髓细胞免疫表型正常人骨髓细胞免疫表型淋巴细胞:CD45+、CD34-/CD38+、CD5+/CD7+（T淋巴细胞）；CD10-/CD19（B淋巴细胞）单核细胞:CD45+,CD34-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA-粒系细胞:原粒细胞CD45+、CD34+/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR+/CD13+早幼粒细胞及其以下各阶段中性粒细胞：CD45+、CD34-/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR-/CD13+，与原粒细胞或更幼稚细胞的表型有明显差异巨核细胞：CD45+、CD41+/CD61+幼红细胞：CD45-、CD36+/GlyA+B-ALLB-ALL免疫表型免疫表型 HLHLA A-DRDR CD19CD19 CD10CD10 CD20CD20 CD22CD22 CD79CD79a a 其它其它 早期前早期前B B-ALLALL +-C C+/M M-+34/3834/38+普通型普通型ALLALL +-C C-/M M +34/3834/38 前前 B B-ALLALL +B B-ALLALL +-+KappaKappa+/LambdaLambda+*CD10CD10+的的 ALLALL 疗效好，有疗效好，有 CD34CD34+病人往往合并病人往往合并 t(9,22),t(9,22),需强化治疗需强化治疗 成熟成熟AMLAML免疫表型免疫表型急性急性T T淋巴细胞白血病（淋巴细胞白血病（T-ALLT-ALL）骨髓细胞免疫分型散点图骨髓细胞免疫分型散点图急性早幼粒细胞白血病（急性早幼粒细胞白血病（AML-M3AML-M3）骨髓细胞免疫分型散点图骨髓细胞免疫分型散点图FCMFCM在临床血液学中的应用在临床血液学中的应用能正确区别AML和ALL，并能进一步区别ALL中的T系和B系及亚型能正确鉴别AML中难于鉴别的M0、M6、M7诊断双系或双表型白血病发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病诊断少见疑难白血病（如HCL）免疫分型免疫分型 对下列情况具有重要意义对下列情况具有重要意义 用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。形形态态学学为为急急性性淋淋巴巴细细胞胞白白血血病病（ALLALL）或或急急性性未未分分化化白白血病（血病（AULAUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。混合性白血病。混合性白血病。部部分分髓髓系系白白血血病病。目目前前，免免疫疫分分型型对对粒粒-单单核核细细胞胞和和单单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。慢性淋巴细胞白血病。慢性淋巴细胞白血病。微小残留白血病。微小残留白血病。阵发性血红蛋白尿阵发性血红蛋白尿PNH=阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜的获得性缺陷，对激活阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜的获得性缺陷，对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血补体异常敏感的一种慢性血管内溶血=患者体内红细胞呈不均一性患者体内红细胞呈不均一性=利用流式细胞术和利用流式细胞术和CD55CD55和和CD59CD59单克隆抗体，对单克隆抗体，对PNHPNH患者红细患者红细胞、粒细胞和血小板进行分析，证实存在膜蛋白表达缺陷胞、粒细胞和血小板进行分析，证实存在膜蛋白表达缺陷的血细胞，并计算缺陷细胞在全血中所占比例的血细胞，并计算缺陷细胞在全血中所占比例阵发性血红蛋白尿阵发性血红蛋白尿PNH=正常人红细胞、粒细胞和血小板正常人红细胞、粒细胞和血小板CD59表达完全阳性表达完全阳性=PNH患者血细胞分为三型：患者血细胞分为三型：型：型：CD59表达完全阳性，荧光强度与正常人阳性峰荧光表达完全阳性，荧光强度与正常人阳性峰荧光强度接近强度接近型：型：CD59表达部分阳性，荧光强度介于表达部分阳性，荧光强度介于型与型与型之间型之间 型：型：CD59表达完全阴性表达完全阴性=分析分析PNH患者各型细胞所占百分比，评估疾病的严重程度患者各型细胞所占百分比，评估疾病的严重程度红细胞红细胞 PNH分析分析 A 正常人正常人B D 病人病人网织红细胞计数网织红细胞计数Retic-COUNT=操作快速、简便操作快速、简便=计数精确计数精确=低水平网织红细胞检测低水平网织红细胞检测=网织红细胞成熟指数网织红细胞成熟指数IRF临床应用：临床应用：=预测骨髓移植效果预测骨髓移植效果=判断贫血发病原因判断贫血发病原因=评价生物制剂的疗效评价生物制剂的疗效网织血小板的检测人们最先于1969年指出网织血小板是一类能被新亚甲蓝深染的血小板。如网织红细胞一样它们是代表了新生的血小板。以后的二十年中，人们发现网织血小板为骨髓新释放的未成熟成分，含有大量的RNA，因此，外周血中网织血小板的多少，可以间接反映骨髓巨核系造血的活跃程度。并能用常规的检测网织红细胞的噻唑橙（TO）等核酸染料染色。在流式细胞仪上方便、准确地检测。临床应用临床应用正常人网织红细胞正常人网织红细胞1.07%1.07%缺铁性贫血（缺铁性贫血（IDA)4.78%IDA)4.78%临床应用临床应用再障（再障（AA)0.03%AA)0.03%溶血性贫血（溶血性贫血（HA)29.33%HA)29.33%造血干细胞计数造血干细胞计数 造血干细胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血细造血干细胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血细胞。胞。造血干细胞的特征是：造血干细胞的特征是：大小（大小（FSCFSC）和颗粒度（和颗粒度（SSCSSC）介于成熟淋巴细胞、大淋巴介于成熟淋巴细胞、大淋巴细胞相似细胞相似 细胞内含有较多核酸物质细胞内含有较多核酸物质 CD34 CD34表达弱阳性或强阳性表达弱阳性或强阳性 CD45 CD45表达弱阳性表达弱阳性 在干细胞移植时需要做造血干细胞绝对计数在干细胞移植时需要做造血干细胞绝对计数造血干细胞计数造血干细胞计数干细胞移植应用干细胞移植应用血液系统病症血液系统病症:L&L,L&L,再生障碍想贫血再生障碍想贫血恶性肿瘤恶性肿瘤:乳腺癌、儿童神经母细胞瘤、卵巢癌乳腺癌、儿童神经母细胞瘤、卵巢癌遗传性异常病变遗传性异常病变免疫缺陷免疫缺陷:血红蛋白病血红蛋白病血小板检测血小板检测=血小板膜糖蛋白复合物诊断血小板缺陷性疾病血小板膜糖蛋白复合物诊断血小板缺陷性疾病CD41-CD61复合物：血小板无力症复合物：血小板无力症CD42a-CD42b 复合物：巨大血小板症复合物：巨大血小板症=血小板活化的相关检查血小板活化的相关检查血小板颗粒膜糖蛋白，如血小板颗粒膜糖蛋白，如CD62，CD63血小板膜糖蛋白活化表位，如血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1=血小板减少性疾病血小板减少性疾病血小板自身抗体检测血小板自身抗体检测网织血小板的检测网织血小板的检测=血小板脱落微粒的检测血小板脱落微粒的检测血小板活化血小板活化IIb/IIIa复合物（复合物（CD41/CD61）在所有静止和活在所有静止和活化的血小板上都有表达化的血小板上都有表达血小板活化时发生的改变血小板活化时发生的改变IIb/IIIa复合物发生变构，表达复合物发生变构，表达PAC-1血小板内颗粒释放，分泌促进凝血反应的物质，这血小板内颗粒释放，分泌促进凝血反应的物质，这时表达时表达CD62PCD61CD61圈血小板门圈血小板门PAC-1/PAC-1/1 1：阴性对照，阴性对照，静止的血小板静止的血小板PAC-1/CD62PPAC-1/CD62P：试验管，试验管，ADPADP刺激下活化的血小刺激下活化的血小板，报告血小板活化板，报告血小板活化百分含量百分含量血小板活化血小板活化血小板活化血小板活化直接测量循环血小板活化状态与反应性直接测量循环血小板活化状态与反应性可直接测定凝血酶等诱导剂活化的血小板可直接测定凝血酶等诱导剂活化的血小板血小板活化与临床的关系：监测血小板活化相关疾病过程，血小板活化与临床的关系：监测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性缺血性脑血管病与血小板活化有关缺血性脑血管病与血小板活化有关子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加抗血小板治疗疗效监测抗血小板治疗疗效监测脑栓塞病人血小板活化检测脑栓塞病人血小板活化检测A CD61-SSC设分析门设分析门B 阴性对照阴性对照C 治疗前治疗前 PAC-I 27.74%CD62P 15.86%D 溶栓后溶栓后 PAC-I 9.13%CD62P 4.12%血小板无力症（血小板无力症（CD41缺陷，缺陷，PAC-I下调）下调）巨血小板症巨血小板症蓝蓝阴性对照阴性对照绿绿正常人正常人红红病人病人CD41表达上调表达上调CD42a/CD42b缺失缺失血小板自身抗体血小板自身抗体 ITP病人病人DNA细胞周期分析细胞周期分析细胞周期细胞周期G2MGG0 0GG1 1s0 200 400 600 8001000GG0 0GG1 1sG2MDNADNA分析分析分析分析DNA含量含量细细胞胞数数量量2N2N4N4NDNA细胞周期分析参数细胞周期分析参数=DNA倍体性倍体性Ploidy细胞内染色体细胞内染色体DNA含量含量=二倍体二倍体Diploid正常体细胞内染色体正常体细胞内染色体DNA含量含量=DNA指数（指数（DI）测定标本的测定标本的G0/G1期细胞期细胞DNA含量含量与同种系正常细胞的与同种系正常细胞的G0/G1期细胞期细胞DNA含量的比值，表示细胞倍体性含量的比值，表示细胞倍体性=S期含量期含量SPFS期细胞占总周期细胞的比例期细胞占总周期细胞的比例=增殖指数增殖指数PI增殖细胞占总周期细胞的比例增殖细胞占总周期细胞的比例=CVG0/G1期细胞期细胞DNA含量变异系数含量变异系数DNADNA分析的临床意义分析的临床意义DNADNA分析诊断肿瘤分析诊断肿瘤DNADNA非整倍体细胞峰或突出的四倍体细胞峰非整倍体细胞峰或突出的四倍体细胞峰S S期细胞含量期细胞含量10-15%10-15%DNADNA倍体分析：倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，提高治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、随访和早期治疗，提高治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液、灌洗液脱落细胞的分析，意义尤为重要。体液、组织液、灌洗液脱落细胞的分析，意义尤为重要。研究各期细胞比率与肿瘤组织分级的关系。研究各期细胞比率与肿瘤组织分级的关系。提示肿瘤患者预后。提示肿瘤患者预后。增殖状态分析：增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性，判断临床治疗方法的疗效或用于探反映了肿瘤的生长速度和侵袭性，判断临床治疗方法的疗效或用于探讨新药新方法的作用机理和疗效。讨新药新方法的作用机理和疗效。FCMFCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志个重要标志在淋巴瘤（在淋巴瘤（L&L）病理形态学不能做出诊断前可提供确病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息切诊断信息DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待非整倍体的交界瘤应按恶性对待形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标FCM参数的预后意义参数的预后意义DNA及倍体分析在某些肿瘤有预后价值：及倍体分析在某些肿瘤有预后价值：膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、皮肤黑色素瘤膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、皮肤黑色素瘤S期比率与肿瘤组织学分级密切相关：期比率与肿瘤组织学分级密切相关：肺癌、乳腺癌、肺癌、乳腺癌、Hodgkin、卵巢癌、直肠癌、甲状腺癌、睾丸癌、脑卵巢癌、直肠癌、甲状腺癌、睾丸癌、脑型星形细胞瘤型星形细胞瘤细胞凋亡细胞凋亡PI分析分析PI-Fluorescence#Events凋亡细胞凋亡细胞正常正常G0/G1期细胞期细胞正常正常DNA倍体分析倍体分析0 200 400 600 8001000PI Fluorescence2N2N4N4N1280 200 400 600 8001000PI FluorescenceAneuploid peakAneuploid peakDNA index 1.21DNA index 1.21DNA异倍体异倍体129秋水仙素处理秋水仙素处理罗田甜柿罗田甜柿获得获得12 倍体再生倍体再生植株植株正常人骨髓细胞正常人骨髓细胞DNADNA周期分析（周期分析（ModFITModFIT）肿瘤细胞肿瘤细胞SPF(S期含量期含量)肿瘤细胞肿瘤细胞(单克隆单克隆)(14.18%)(14.18%)正常骨髓细胞正常骨髓细胞(2.93%)(2.93%)肿瘤细胞肿瘤细胞(多克隆多克隆)(28.52%)(28.52%)132乳腺癌及乳腺良性病变的乳腺癌及乳腺良性病变的流式检测对比分析流式检测对比分析细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡的分析细胞凋亡的分析细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的主要检查手段细胞凋亡的主要检查手段形态学检查形态学检查DNALadders实验实验流式细胞仪检查流式细胞仪检查与凋亡相关的病理过程（与凋亡相关的病理过程（HIV、自身免疫性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤）肿瘤）研究凋亡调控因素如癌基因、细胞因子及药物等对研究凋亡调控因素如癌基因、细胞因子及药物等对凋亡的影响凋亡的影响凋亡检测凋亡检测-每一步都有检测试剂盒每一步都有检测试剂盒细胞凋亡检测细胞凋亡检测凋亡相关细胞膜变化的检测凋亡相关线粒体变化的检测凋亡相关酶活性的检测凋亡相关DNA片段的检测凋亡相关基因蛋白的检测细胞膜变化的检测细胞膜变化的检测早期凋亡早期凋亡v磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，DNA不断裂v线粒体膜电位变化的检测v细胞内氧化还原状态改变的检测细胞膜变化的检测细胞膜变化的检测磷脂酰丝氨酸（PS）的检测早期凋亡早期凋亡早期凋亡PS检测及结果判断检测及结果判断早期凋亡特征磷脂膜（PS）外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI染色为阴性DNA没有发生断裂 结果判定早期凋亡：AnnexinV+/PI-死亡或者晚期凋亡：AnnexinV+/PI+正常的活细胞：AnnexinV-/PI-ANNEXIN-V/PI检测检测ANNEXIN-V/PI检测检测control处理处理16h后后处理处理24h后后142线粒体水平检测相关产品线粒体水平检测相关产品线粒体膜电位的检测线粒体膜电位的检测BD Mitoscreen（JC-1）Cat#551302 25tests原理：荧光染料JC-1在活细胞中以聚体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光，在凋亡细胞中，以单体形式存在不与线粒体结合而产生绿色荧光。操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测JC-1 检测结果流式图检测结果流式图凋亡相关酶活性的检测凋亡相关酶活性的检测背景知识背景知识细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞的组分裂解 Caspase 3激活=细胞凋亡检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的caspase活性。CBA分析凋亡信号通路分析凋亡信号通路 YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYDETECTORANTIBODYLYSATE ORSUPERNATANTBEADSYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYWashRead on Flow CytometerActive Caspase-3Bcl-2Cleaved PARP一系列荧光强度不同的微球一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与包被有特异性捕获抗体，与待测样本和检测抗体孵育后，待测样本和检测抗体孵育后，形成形成“三明治三明治”复合物复合物Active Caspase-3Bcl-2Cleaved PARPBcl-2、Caspase-3、PARP构成的凋亡调控通道主要蛋白，对于构成的凋亡调控通道主要蛋白，对于凋亡研究具有特殊的意义凋亡研究具有特殊的意义(CBAHumanapoptosiskit557816)流式检测活性流式检测活性Caspase-3相关产品：相关产品：相关产品：相关产品：Active Caspase-3 Apoptosis kit（550914），包含了 固定破膜液，洗涤液和PE标记抗体；特点：特点：特点：特点：细胞需要固定破膜，然后才能染色化疗前后胃癌活检标本中化疗前后胃癌活检标本中Caspase-3+细胞细胞化疗前化疗前(3.49%)化疗后化疗后(94.86%)149DNA水平的凋亡检测水平的凋亡检测-晚期检测晚期检测凋亡晚期DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成185bp为基数的有序片段检测方法Tunel流式法，通过在核酸片段末端标记，跟传统相比优点在于可以计算凋亡百分比DNA Ladder分析，但凋亡细胞太少时作不到TUNEL简介简介n n通过通过DNADNA末端转移酶将带末端转移酶将带标记的标记的 dNTPdNTP （多为多为dUTPdUTP）接到接到DNADNA片段的片段的3-3-OHOH端，再通过荧光检测定端，再通过荧光检测定量分析结果。量分析结果。TUNEL（Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnick-end-labeling）DNA断裂点检测断裂点检测152TUNEL法流式分析凋亡结果法流式分析凋亡结果BrdU-FITC/PI检测检测S期期154凋亡检测总结凋亡检测总结检测水平检测水平 细胞细胞 核酸核酸 细胞膜细胞膜 胞内通路胞内通路 线粒体线粒体 检测方法检测方法 免疫荧光免疫荧光 TUNEL法法 Annexin V/PI Caspase通路通路 线粒体染料线粒体染料 微生物微生物 微生物细菌的计数检测与鉴定（CBA)血清血诊断(CBA)抗生素敏感性实验细胞活力检测（细菌活力）图 流式细胞术分析GFP转染效率和表达量调节性调节性T T细胞细胞研究进展研究进展免疫耐受机制免疫耐受机制以往研究认为：（以往研究认为：（“被动被动”方式）方式）胸腺细胞及前胸腺细胞及前B（pre-B）细胞在中枢免疫器官）细胞在中枢免疫器官中的克隆清除中的克隆清除 进入外周的成熟淋巴细胞表达针对自身抗原的识进入外周的成熟淋巴细胞表达针对自身抗原的识别受体被诱导进入免疫无能状态而不表现任何自别受体被诱导进入免疫无能状态而不表现任何自身反应性身反应性 部分淋巴细胞对自身抗原的免疫忽视部分淋巴细胞对自身抗原的免疫忽视 免疫耐受机制近年研究表明：（“主动”方式）调节性调节性T T（TrTr）细胞以）细胞以“主动主动”的方式维持自身免的方式维持自身免疫耐受疫耐受 这一发现将改变我们对自身免疫耐受及免疫调节这一发现将改变我们对自身免疫耐受及免疫调节机制的认识，并将对免疫学基本理论的发展产生重大机制的认识，并将对免疫学基本理论的发展产生重大影响。影响。调节性T细胞的特异性标志 FOXP3（Forkhead box protein P3）是一个50kD的转录因子，也称为Scurfin、JM2、IPEX。它是一个主要调节基因。CD4+/CD25-细胞上FOXP3的转录表达可以诱导GITR、CD103和CTLA4的表达，并且促使调节性T细胞表型形成。FOXP3在X连锁自身免疫过敏失调综合征（XLAAD或IPEX）患者中发生突变。FOXP3过度表达会引起机体的免疫应答下降，表明它是一个调节T细胞活性的主要转录因子。FOXP3表达于细胞内 调节性T细胞分类根据来源、特异性及效应机制可分为天然调节性T细胞和获得性调节性T细胞天然性调节性T细胞：在正常人和小鼠的外周血及脾脏组织的CD4+T细胞中约有510的细胞持续高表达CD25分子，该群细胞从胸腺中发育，组成性表达foxp3，在体内外发挥免疫调节功能获得性调节性T细胞：是由外周T细胞在特定的条件下分化出来，通过分泌高水平的IL-10和 TGF-而发挥其抑制功能而发挥其抑制功能.Regulatory T Cells Background:its DevelopmentThymusPeripheryTcellprecursorTr1Th3FoxP3-?iDC and/or in thePresence of IL-10And/or