医学专题—细胞培养基本知识基本技术28285.ppt

细胞培养的基本知识、细胞培养的基本知识、基本基本(j(j b b n)n)技术技术医学院医学院中心中心(zhngxn)(zhngxn)实验室实验室谷景义谷景义第一页，共六十八页。主要(zhyo)内容：1、细胞培养基本知识2、培养细胞(xbo)生长的条件3、细胞培养的基本技术第二页，共六十八页。一、一、细胞培养细胞培养把取得的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定(ydng)的结构和功能特性。第三页，共六十八页。培养细胞的特性培养细胞的特性1-1-生长方式生长方式(fngsh)(fngsh)(fngsh)(fngsh)及类型及类型贴附型、悬浮(xunf)型第四页，共六十八页。培养培养(piyng)(piyng)(piyng)(piyng)细胞的特性细胞的特性2-2-增殖特点增殖特点体外培养的细胞(xbo)既保持了一定的体内细胞(xbo)的基本特性，但也具有本身的一些特点。贴附-伸展接触抑制-增殖的密度抑制第五页，共六十八页。贴附贴附-伸展伸展(sh(sh(sh(sh nzhnzhnzhnzh n)n)n)n)第六页，共六十八页。接触抑制当一个细胞被其他细胞围绕导致无处可去而保持接触时，细胞不再移动，在接触区域的细胞膜活动将停止(tngzh)。因此，一般正常细胞并不相互重叠于其上生长。第七页，共六十八页。细胞增殖密度(md)抑制当细胞生长汇合形成单层时，细胞变得比较拥挤，这时其分裂停止，这种细胞可在静止(jngzh)状态下维持存活一段时间，但不会继续分裂生殖。转化细胞或恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，他们的接触抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以增殖至较高的终末细胞密度。第八页，共六十八页。培养细胞培养细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)的特性的特性3-3-生长过程生长过程单个细胞单个细胞(xbo)(xbo)增殖：增殖：细胞周期细胞周期第九页，共六十八页。高等高等(godng)生物体，细胞周期时间的长短变生物体，细胞周期时间的长短变化主要集中在化主要集中在G1期，期，S，G2和和M期基本保期基本保持稳定。持稳定。Hela 8-16h 5-9h 2-8h 20-28h第十页，共六十八页。一群细胞的增殖一群细胞的增殖(zngzh)(zngzh)：细胞生长曲线细胞生长曲线接种后，每天进行检测计数，以细胞数为纵坐标，接种后，每天进行检测计数，以细胞数为纵坐标，以时间为横坐标，绘制成曲线。以时间为横坐标，绘制成曲线。测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。饱和密度(md)：在特定条件下，培养器皿内能在特定条件下，培养器皿内能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止繁殖。止繁殖。第十一页，共六十八页。潜伏期/滞留期指数增长期平台(pngti)期/停滞期退化或死亡第十二页，共六十八页。细胞系的生长过程细胞系的生长过程细胞系：原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞系，可泛指一般可以传代的细胞。系，可泛指一般可以传代的细胞。系，可泛指一般可以传代的细胞。系，可泛指一般可以传代的细胞。细胞株：通过筛选通过筛选通过筛选通过筛选(shixun)(shixun)(shixun)(shixun)或克隆化，或克隆化，或克隆化，或克隆化，从原代细胞或细从原代细胞或细胞系中获得具有胞系中获得具有特殊性质或标志物特殊性质或标志物的细胞。的细胞。细胞系亚系：由某一细胞系分离出来，在性状上与由某一细胞系分离出来，在性状上与由某一细胞系分离出来，在性状上与由某一细胞系分离出来，在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系第十三页，共六十八页。有限细胞系：如果不能如果不能继续传代或传代有限，可称继续传代或传代有限，可称为有限细胞系。为有限细胞系。连续细胞系：能够连续能够连续传代的细胞叫做传代的细胞叫做“连续细连续细胞系或无限细胞系。可培胞系或无限细胞系。可培养养50代以上并无限培养下代以上并无限培养下去。去。大多数的二倍体细胞为有大多数的二倍体细胞为有限细胞系。无限细胞系大限细胞系。无限细胞系大多已发生多已发生(fshng)(fshng)变异。变异。第十四页，共六十八页。原代细胞：从机体取得组织材料，在体外培养从机体取得组织材料，在体外培养生长，到第一次传代生长，到第一次传代(chun di)(chun di)前。前。传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段时间，当原代细胞持续生长繁殖一段时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。达到一定的细胞密度后传代的细胞。第十五页，共六十八页。培养培养(piyng)(piyng)(piyng)(piyng)瓶培养瓶培养(piyng)(piyng)(piyng)(piyng)法法方法：方法：将培养将培养(piyng)对象直接接种于培养对象直接接种于培养(piyng)瓶瓶内，再放入培养内，再放入培养(piyng)箱进行培养箱进行培养(piyng)。优点：优点：1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响。响。2、可以方便地进行显微镜观察、染色、可以方便地进行显微镜观察、染色(rns)等操作，以等操作，以及永久保存。及永久保存。3、增加了培养瓶的培养面积。、增加了培养瓶的培养面积。第十六页，共六十八页。培养培养(piyng)(piyng)(piyng)(piyng)板培养板培养(piyng)(piyng)(piyng)(piyng)法法方法：将培养方法：将培养(piyng)细胞接种在培细胞接种在培养养(piyng)板的孔内，然后在板的孔内，然后在CO2培培养箱内培养。应培养量较小也称为养箱内培养。应培养量较小也称为微量培养。微量培养。第十七页，共六十八页。悬滴培养悬滴培养(piyng)(piyng)(piyng)(piyng)法法也称植块悬滴培养法，是最早也称植块悬滴培养法，是最早建立的体外培养技术建立的体外培养技术基本要点基本要点(yodin)：将组织或器官植块接种在一张盖玻将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂在盖玻片下，再放置于一凹形载片之上，最养液悬挂在盖玻片下，再放置于一凹形载片之上，最后用溶蜡密封后放入培养箱中培养。后用溶蜡密封后放入培养箱中培养。第十八页，共六十八页。1907 1907 年年 -Harrison用细胞培养解决一个难题用细胞培养解决一个难题盖玻片覆盖盖玻片覆盖(fgi)(fgi)凹型载玻片悬滴培养法凹型载玻片悬滴培养法第十九页，共六十八页。悬滴培养法基本悬滴培养法基本(jbn)步骤步骤1、在盖玻片上滴加胚胎、在盖玻片上滴加胚胎(piti)提取液、血浆和植提取液、血浆和植块，混匀。培养基凝固后将植块包埋。块，混匀。培养基凝固后将植块包埋。2、在凹载片周围、在凹载片周围(zhuwi)涂凡士林。将凹载片向涂凡士林。将凹载片向下压向盖玻片下压向盖玻片3、将凹载片反转，盖玻片周围涂溶蜡。放入、将凹载片反转，盖玻片周围涂溶蜡。放入培养箱培养培养箱培养第二十页，共六十八页。1910至至 1923年年 Carrel和早期和早期(zoq)(zoq)的组织的组织培养培养卡氏瓶培养法第二十一页，共六十八页。1943年年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培养等创建单层细胞培养(piyng)(piyng)法，首建长期传代的法，首建长期传代的L-细胞系。细胞系。1951年年Gey首建人肿瘤细胞首建人肿瘤细胞Hela细胞系。细胞系。从从50年代末开始，组织培养技术应用进入了年代末开始，组织培养技术应用进入了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和医一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和医学研究各个领域。学研究各个领域。第二十二页，共六十八页。无血清无血清(xuq(xuq ng)ng)培养培养无血清培养基无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在体外是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加组分两大白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。部分。观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种(zhn)生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。往往针对性很强，价格偏高。第二十三页，共六十八页。三维细胞培养技术三维细胞培养技术(jsh)(jsh)将将具具有有三三维维结结构构不不同同材材料料的的载载体体(z z i it t)与与各各种种不不同同种种类类的的细细胞胞在在体体外外共共同同培培养养,使使细细胞胞能能够够在在载载体体的的三三维维立立体体空空间间结结构构中中迁迁移移、生生长长,构构成成三三维维的的细细胞胞-载载体体复复合合物物。第二十四页，共六十八页。普普通通的的细细胞胞培培养养由由于于细细胞胞在在体体外外改改变变(g g i ib bi i n n)的的环环境境下下增增生生逐逐渐渐丧丧失失了了原原有有的的性性状状，往往往往和和体体内内情情况况不不相相符符，而而动动物物实实验验完完全全在在体体内内进进行行,但但由由于于体体内内的的多多种种因因素素制制约约以以及及体体内内和和外外界界环环境境相相互互影影响响而而变变得得复复杂杂化化,难难以以研研究究单单一一过过程程，且且难难以以研研究究中中间间过过程程。三三维维细细胞胞培培养养技技术术是是介介于于单单层层细细胞胞培培养养与与动动物物实实验验之之间间的的一一种种技技术术，既既能能最最大大程程度度的的模模拟拟体体内内环环境境，又又能能展展现现细细胞胞培培养养的的直直观观性性及及条条件件可可控控性性的的优优势势。应应用用：软软骨骨和和骨骨组组织织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨）循循环环系系统统和和心心脏脏（有目的地改变血管形成）第二十五页，共六十八页。目目前前常常用用(c ch h n n y y n n)的的三三维维培培养养模模型型：基质覆盖培养 旋转烧瓶培养 微载体培养 预置支架培养 旋转细胞培养系统 自发性细胞聚集第二十六页，共六十八页。细胞培养技术的特点细胞培养技术的特点(tdi(tdi(tdi(tdi n)n)n)n)及应用及应用优点：优点：1）研究的条件可以人为控制）研究的条件可以人为控制2）研究的样本均一）研究的样本均一3）研究内容方便观察、检测、记录）研究内容方便观察、检测、记录4）研究的费用相对）研究的费用相对(xingdu)于经济于经济缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体内的缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体内的细胞。细胞。第二十七页，共六十八页。应用应用(yngyng)(yngyng)(yngyng)(yngyng)病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体遗传学：染色体分析肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物分化及发育：刺激使细胞群体发生改变细胞毒实验：药效测试临床医学及生物技术：干细胞培养定向(dn xin)诱导分化后移植；组织工程软骨损伤修复；试管婴儿第二十八页，共六十八页。营营养养(yngyng)需需要要环环环环 境境境境 要要要要 求求求求无毒及无污染无毒及无污染二、培养细胞二、培养细胞(xb(xb(xb(xb o)o)o)o)生长的条件生长的条件第二十九页，共六十八页。1 1、细胞、细胞(xb(xb(xb(xb o)o)o)o)的营养需求的营养需求（1）氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子）氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子(lz)(lz)（2）促生长因子等）促生长因子等 完全培养基的组成：完全培养基的组成：基础培养基基础培养基 80一一95 血清血清 5一一20 碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0g/L 青、链霉素青、链霉素 各各100单位毫单位毫升升第三十页，共六十八页。基础(jch)培养基的选择参考：参考：(1(1）建立某种细胞株所用的培养基应是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅）建立某种细胞株所用的培养基应是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。参考文献，或在购买细胞株时咨询。(2)(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。(3)(3)用多种培养基培养目的细胞，观察用多种培养基培养目的细胞，观察(gunch)(gunch)其生长状态，可以用生其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。这是最客观的方法，但比较繁琐。常用的培养基种类常用的培养基种类RPMI-1640RPMI-1640（标准型）、（标准型）、DMEM-DMEM-高糖（标准型）、高糖（标准型）、DMEM-DMEM-低糖（标准型）、低糖（标准型）、DMEM-F12 DMEM-F12 等等第三十一页，共六十八页。血清(xuqng)热灭活：热灭活：56,30 56,30 分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清(目前少用）目前少用）热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。热处理造成血清沉淀物增多，影响血清热处理造成血清沉淀物增多，影响血清质量。甚至严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁质量。甚至严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。率降低。血清中的沉淀物血清中的沉淀物絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5 3000rpm,5 分钟去除，也可分钟去除，也可不用不用(byng)(byng)处理处理显微镜下显微镜下“小黑点小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点小黑点”，常误认为血清受污染。一，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清应立即停止使用，更换另一批号的血清第三十二页，共六十八页。血清血清(xuqng)(xuqng)质量好坏是实验成败的关键。质量好坏是实验成败的关键。常用血清：常用血清：胎牛血清、小牛血清胎牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，以、兔血清、马血清等，以胎牛血清质量最好。胎牛血清质量最好。优质血清的标准：优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。病毒污染。第三十三页，共六十八页。pH 调整(tiozhng)(tiozhng)液NaHCO3 NaHCO3 溶液（碱）溶液（碱）常用浓度为常用浓度为常用浓度为常用浓度为7.5%7.5%7.5%7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，分装，分装，分装，4444保存保存保存保存HEPESHEPES（分子量（分子量238.31238.31）溶液）溶液一种一种弱酸弱酸，羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞，羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞(xbo)(xbo)无毒性无毒性主要作用主要作用:防止培养基防止培养基pHpH迅速变动。迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO25%CO2的环境，的环境，CO2CO2气体迅速逸出，气体迅速逸出，pHpH迅速升高，若加了迅速升高，若加了HEPESHEPES，此时可以维持，此时可以维持pH7.0pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPESHEPES 使用终浓度一般为使用终浓度一般为使用终浓度一般为使用终浓度一般为10-5010-5010-5010-50mmol/Lmmol/L 常配成常配成常配成常配成1M 1M 1M 1M 储存液：用储存液：用储存液：用储存液：用20ml 20ml 20ml 20ml 双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解4.764.764.764.76克克克克HEPESHEPESHEPESHEPES，过滤除菌，过滤除菌，过滤除菌，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，或高压灭菌，分装小瓶，或高压灭菌，分装小瓶，或高压灭菌，分装小瓶，4444保存。保存。保存。保存。使用时可向使用时可向100ml100ml培养液中加培养液中加入入2ml 2ml HEPESHEPESHEPESHEPES浓缩液，终浓度为浓缩液，终浓度为20mmol/L 20mmol/L 第三十四页，共六十八页。抗菌素的使用：抗菌素的使用：在培养液配制在培养液配制(pizh)(pizh)后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。通常是青霉素和链霉素联合使用。最终使用浓度为每毫升最终使用浓度为每毫升100单位。单位。第三十五页，共六十八页。制备(zhbi)(zhbi)1000ml RPMI1640培养基RPMI1640干粉培养基干粉培养基10.4g（1包）包）超纯水超纯水400ml 磁力搅拌至完全溶解磁力搅拌至完全溶解 加超纯水定容至加超纯水定容至1000ml在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有 0.22m孔径孔径(kngjng)(kngjng)滤膜的过滤器除菌，滤膜的过滤器除菌，分装分装200ml/瓶，瓶，-20保存备用。保存备用。用前取一瓶溶解，每用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活培养液加灭活的小牛血清至终浓度为的小牛血清至终浓度为10%，即加，即加22ml。加青霉素。加青霉素和链霉素至终浓度各为和链霉素至终浓度各为100U/ml。第三十六页，共六十八页。消化液消化液分离组织和分散细胞(xbo)常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二钠(EDTA)单独或混合使用第三十七页，共六十八页。胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液：胰胰蛋蛋白白酶酶作作用用于于与与赖赖氨氨酸酸或或精精氨氨酸酸相相连连接接的的肽肽健健，除除去去细细胞胞间间粘粘蛋蛋白白及及糖糖蛋蛋白白，影影响响细胞骨架，从而使细胞分离。细胞骨架，从而使细胞分离。胰胰蛋蛋白白酶酶液液浓浓度度越越高高，作作用用越越强强，但但超超过一定限度过一定限度(xind)(xind)会损伤细胞。会损伤细胞。胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：2-102-10分钟。分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 第三十八页，共六十八页。胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks D-Hanks 平衡平衡盐盐溶液调成糊状，再补足溶液调成糊状，再补足D-Hanks D-Hanks 平衡盐溶液平衡盐溶液（常用浓度为常用浓度为0.25%0.25%）搅拌混匀，置室温）搅拌混匀，置室温 4 4 小小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡时或冰箱过夜，不断搅拌振荡次日，先用滤纸次日，先用滤纸(lzh)(lzh)(lzh)(lzh)粗滤，再进行过滤除菌，分粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，装入瓶中，-20-20保存备用保存备用（以免分解失效），（以免分解失效），胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调调 pH pH 至至7.2 7.2 左右左右胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液(rngy)(rngy)配制配制第三十九页，共六十八页。EDTA4Na 溶液(rngy)(rngy)一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为常用工作液浓度为0.02%0.02%。注意：使用注意：使用EDTA EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净洗干净(gnjng)(gnjng)(gnjng)(gnjng)，因残留的，因残留的EDTA EDTA 会影响细胞生长会影响细胞生长第四十页，共六十八页。D-HanksD-HanksD-HanksD-Hanks 平衡平衡平衡平衡(pnghng)(pnghng)(pnghng)(pnghng)盐溶液盐溶液盐溶液盐溶液(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)KClKCl0.40g0.40gKH2PO4KH2PO40.06g0.06gNaClNaCl8.00g8.00gNaCO3NaCO3 0.35g 0.35gNa2HPO4Na2HPO40.048g0.048gD-GlucoseD-Glucose1.00g1.00gPhenol RedPhenol Red0.01g0.01g第四十一页，共六十八页。2 2、环境环境(hunjng)(hunjng)要求要求细胞培养必须具备细胞生存并繁殖的生细胞培养必须具备细胞生存并繁殖的生理学能接受限度内的物理化学特性理学能接受限度内的物理化学特性(txng)(txng)（1）温度）温度（2）气相）气相（3）PH第四十二页，共六十八页。温度温度(w(w nd)nd)体外培养(piyng)的细胞需要在保持一定恒温的环境中才能生长。在达到最适温度（37）前，一般细胞繁殖率因温度的升高而增加，但是，温度逐步升高并超过最适温度时，繁殖会被抑制。当温度在25-35，细胞的生长速度很慢，但能够生存；细胞在4也能存活数天；只要温度不低于0，细胞都能生存；加了保护剂还能放到液氮中保存。当高温时，在41-42中培养1h，细胞损伤严重，43以上，则多数细胞死亡。高温比低温对细胞的影响更为明显。第四十三页，共六十八页。气相和气相和PHPH5%CO2+95%空气混合气体（O2）。CO2既是细胞生长所需，同时(tngsh)又是细胞代谢的产物，并与维持培养基的PH有关。最适PH 7.2 7.4 低于PH 6.8或高于PH7.6可能对细胞有害，甚至死亡。酚红指示剂：黄酚红指示剂：黄 6.6 橙橙 8.0 红红第四十四页，共六十八页。3、无毒无污染无无 毒：毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与无毒是培养细胞的必需条件。凡与 细胞直接或间接接触的东西都必须细胞直接或间接接触的东西都必须 是无毒的。若具细胞毒性是无毒的。若具细胞毒性(d xn)，细胞，细胞容容 易导致死亡。因此，选用器皿和材易导致死亡。因此，选用器皿和材 料时必须注意。料时必须注意。第四十五页，共六十八页。无无污染污染微生物的污染微生物的污染不同细胞类型的交叉污染不同细胞类型的交叉污染细菌细菌霉菌霉菌支原体支原体体外培养的细胞缺乏机体免疫系统，无防御能力，一体外培养的细胞缺乏机体免疫系统，无防御能力，一旦发生细菌旦发生细菌(xjn)等污染，细胞最终会死亡。等污染，细胞最终会死亡。交叉污染容易使细胞系失去原有特性。交叉污染容易使细胞系失去原有特性。第四十六页，共六十八页。三、细胞培养基本(jbn)技术1、原代细胞培养2、传代细胞培养3、培养细胞生长状况(zhungkung)的观察4、细胞冻存、复苏、运输第四十七页，共六十八页。无菌操作(cozu)(cozu)中的注意事项在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁操作前操作前,无菌室及无菌操作台以紫外灯照射无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30 30 分分钟灭菌，以钟灭菌，以75%75%或或70%ethanol 70%ethanol 擦拭无菌操作台擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转面，并开启无菌操作台风扇运转10 10 分钟分钟操作时操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打开开(d ki)(d ki)之容器正上方操作实验。容器打开之容器正上方操作实验。容器打开(d ki)(d ki)后，后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约4545角取用角取用 操作过程中注意操作过程中注意，有菌意识，无菌操作！，有菌意识，无菌操作！第四十八页，共六十八页。1 1、原代细胞培养、原代细胞培养原理：原理：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胶将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胶原酶）或组织贴壁法处理，得到单个细胞或细胞群，置合原酶）或组织贴壁法处理，得到单个细胞或细胞群，置合适的培养基中培养，使细胞得以适的培养基中培养，使细胞得以(dy)(dy)生存、生长和繁殖。生存、生长和繁殖。仪器、材料及试剂：仪器、材料及试剂：CO2培养箱，培养瓶、平皿、烧杯、吸管、移液枪、手术器培养箱，培养瓶、平皿、烧杯、吸管、移液枪、手术器械、计数板、离心机、水浴箱（械、计数板、离心机、水浴箱（37）1640/DMEMF12培养基（含培养基（含10%血清），血清），2%胶原酶胶原酶II，PBS，酒精酒精第四十九页，共六十八页。组织组织(z(zzhzh)消化法消化法1.准备：准备：取各种已消毒的培养用品置于净化取各种已消毒的培养用品置于净化(jnghu)(jnghu)台台面，紫外线消毒面，紫外线消毒30分钟。开始工作前先洗手、分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。酒精擦拭手至肘部。2.处理组织：处理组织：采集的标本必须在采集的标本必须在4H内完成。取出内完成。取出6-10cm长脐带，置于烧杯或平皿中，用长脐带，置于烧杯或平皿中，用PBS液漂洗液漂洗23次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中含有青链霉素的混合液中3060分钟。分钟。第五十页，共六十八页。3.剪切：剪切：用手术剪将组织块剪成用手术剪将组织块剪成23立方毫米大小，立方毫米大小，然后再用眼科剪把组织剪细成然后再用眼科剪把组织剪细成1立方毫米的小块，立方毫米的小块，以便于消化。加入与组织块总量以便于消化。加入与组织块总量1：1的的2%胶原胶原酶酶II，然后一并倒入瓶中，封口。，然后一并倒入瓶中，封口。4.消化：消化：或用恒温水浴，或置于或用恒温水浴，或置于37温箱消化温箱消化均可，消化中每隔均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间磁恒温搅拌器消化更好。消化时间(shjin)(shjin)依组织依组织块的大小和组织的硬度而定。块的大小和组织的硬度而定。37空气摇床空气摇床100转转/min，1.5-2h第五十一页，共六十八页。5.分离：分离：待组织已分散待组织已分散(fnsn)(fnsn)成细胞团或单个细成细胞团或单个细胞，立即终止消化，并倒入至少胞，立即终止消化，并倒入至少5倍体积的倍体积的PBS稀释消化液，随即通过稀释消化液，随即通过200目的不锈钢筛，滤目的不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。掉尚未充分消化开的组织块。2500rmp离心消离心消化化20分钟，吸出上清，加入分钟，吸出上清，加入8-10mlPBS，1000rmp离心离心5min，吸出上清，加入适量含有血，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。清的培养液。6.计数计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。中。7.换液换液：24-48H后观察细胞是否贴壁，如已有后观察细胞是否贴壁，如已有部分细胞贴壁，可换液继续培养。部分细胞贴壁，可换液继续培养。第五十二页，共六十八页。2、传代(chun di)细胞培养传代前的准备传代前的准备(zhnbi)(zhnbi)1.酒精，棉球，镊子，杂物盒，试管，酒精，棉球，镊子，杂物盒，试管，吸管筒，离心管，培养瓶或板，计时吸管筒，离心管，培养瓶或板，计时器，笔器，笔2.0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶3.含血清培养基，含血清培养基，PBS第五十三页，共六十八页。传代步骤（贴壁细胞）：传代步骤（贴壁细胞）：1.镜下观察细胞生长至融合状态2.吸出旧的培养液，用无血清培养液或PBS清洗两次（切记要清洗干净）。3.消化(xiohu)细胞：最常用的方法是在培养瓶中添加1ml 0.25%含EDTA的胰酶，培养箱中37消化5-15s。可根据不同的细胞类型调整消化时间及程度。在电镜下观察，当细胞突起回缩，细胞之间间隙增大，细胞近乎缩成圆形即可。第五十四页，共六十八页。4.终止消化：立即加入含有血清终止消化：立即加入含有血清(xuqng)(xuqng)的培养基，用吸管吹打分散细胞，吹的培养基，用吸管吹打分散细胞，吹打动作不可过猛，力度要适中，否则打动作不可过猛，力度要适中，否则容易损伤细胞并产生能伤害细胞的气容易损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。泡。5.1000rmp离心离心5min，弃上清。，弃上清。6.用培养液重悬细胞，计数并调整细用培养液重悬细胞，计数并调整细胞密度。胞密度。第五十五页，共六十八页。3 3、培养细胞生长、培养细胞生长(sh(sh ngzhngzhng)ng)状况的状况的观察观察常规常规(chnggu)(chnggu)观察：观察：培养液颜色（是否变黄）培养液颜色（是否变黄）生长增殖变化（经历到哪个时期，长满否）生长增殖变化（经历到哪个时期，长满否）形态变化（透明度、折光性、细胞轮廓）形态变化（透明度、折光性、细胞轮廓）微生物污染（细菌、霉菌）微生物污染（细菌、霉菌）可用显微镜观察活细胞及其动态可用显微镜观察活细胞及其动态第五十六页，共六十八页。细胞细胞(xb(xb o)o)生长状况的观察生长状况的观察细胞计数：细胞计数：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积(tj)(tj)悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。第五十七页，共六十八页。1.将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。2.将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，注意盖片下不要有气泡(qpo)(qpo)，也不能让悬液流入旁边槽中。也不能让悬液流入旁边槽中。3.计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：按公式计算：细胞数细胞数/mL=四大格细胞总数四大格细胞总数/4104说明：公式中除以说明：公式中除以4，因为计数了，因为计数了4个大格的细胞数。个大格的细胞数。公公式中乘以式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）（长）1.0mm（宽）（宽）0.1mm（高）（高）=0.1mm3而而1ml=1000mm3（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液第五十八页，共六十八页。细胞生长细胞生长(shngzhng)(shngzhng)曲线曲线（细胞计数）（细胞计数）细胞周期细胞周期（流式）（流式）细胞分裂指数细胞分裂指数（细胞群中每1000个细胞中的分裂相数）细胞贴壁率细胞贴壁率第五十九页，共六十八页。4 4、细胞、细胞(xb(xb o)o)冻存、复苏及运输冻存、复苏及运输及时进行细胞冻存十分必要：及时进行细胞冻存十分必要：细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。化而不断有新的变化。细胞冷冻储存在细胞冷冻储存在-70冰箱中可以保存冰箱中可以保存(bocn)(bocn)3个月个月到一年之久；细胞储存在液氮中，温度达到一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196，理，理论上储存时间是无限的。论上储存时间是无限的。第六十页，共六十八页。原理原理(yunl(yunl)：细胞冻存及复苏的基本原则是细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融慢冻快融，可以最大限度的保存细胞活力。可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用二甲基亚砜或甘油作保护剂，这两种物目前细胞冻存多采用二甲基亚砜或甘油作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢(hunmn)(hunmn)冷冻可使细冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用复苏细胞应采用快速融化快速融化的方法。的方法。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。第六十一页，共六十八页。冻存步骤冻存步骤(bzhu)(bzhu)1.配制含配制含10%DMSO或甘油、或甘油、1020%血清血清的的冻存冻存培养液培养液；2.取对数生长期的细胞，用取对数生长期的细胞，用胰酶胰酶把单层生长把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至细胞移至15ml离心管中；离心管中；3.离心离心(lxn)(lxn)1000rpm，5min；4.去除胰酶及旧的培养液，加入适量配制好的去除胰酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为数，调节冻存液中细胞的最终密度为5106/ml1107/ml；第六十二页，共六十八页。5.将细胞分装入冻存管中，每管将细胞分装入冻存管中，每管11.5ml；6.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间(shjin)(shjin)及及操作者；操作者；7.冻存：标准的冻存程序为降温速率冻存：标准的冻存程序为降温速率 -1-2/min；当温度达；当温度达-25以下时，可增至以下时，可增至-5-10/min；到；到-100时，则可迅速浸入液氮中。时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入也可将装有细胞的冻存管放入4冰箱冰箱0.5h，-20冰箱冰箱2h，-70冰箱中过夜，取出冻存管，移冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。入液氮容器内。第六十三页，共六十八页。复苏复