基因工程的基本操作程序教学课件.ppt

抗虫棉的培育的过程：抗虫棉的培育的过程：基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序n（1 1）目的基因的获取）目的基因的获取n（2 2）n（3 3）将目的基因导入受体细胞）将目的基因导入受体细胞n（4 4）目的基因的检测与鉴定）目的基因的检测与鉴定基因基因表达载体表达载体的构建的构建一、目的基因的获取一、目的基因的获取1.1.目的基因：目的基因：2.2.获取方法：获取方法：（1 1）从）从基因文库基因文库中获取目的基因；中获取目的基因；（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因；技术扩增目的基因；（3 3）通过）通过DNADNA合成仪用化学方法直接合成合成仪用化学方法直接合成主要指的是编码蛋白质的主要指的是编码蛋白质的结构基因结构基因补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构编码区下游编码区下游 非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 启动子启动子终止子终止子补：真核细胞的基因结构补：真核细胞的基因结构内含子内含子 外显子外显子 编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 RNA聚合酶的聚合酶的始结合位点始结合位点RNA聚合酶的聚合酶的末结合位点末结合位点结构基因结构基因外显子外显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰mRNA能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子：内含子：外显子：外显子：（一）从基因文库中获取目的基因（序列未知）（一）从基因文库中获取目的基因（序列未知）1.基因文库基因文库 基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（cDNAcDNA文库）文库）u基因文库基因文库中不是直接保管相应基因，而是中不是直接保管相应基因，而是保存保存受体菌受体菌，菌中含基因。，菌中含基因。将含有某种生物不同基因的将含有某种生物不同基因的许多许多DNADNA片段片段，导，导入到入到受体菌的群体受体菌的群体中中储存储存，各个受体菌分别含，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。有这种生物的不同基因，称为基因文库。基基因因组组文文库库的的构构建建模模式式图图部部分分基基因因文文库库的的构构建建模模式式图图基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较文库类型文库类型文库类型文库类型cDNAcDNAcDNAcDNA文库文库文库文库基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小文库大小文库大小基因中启动子基因中启动子基因中启动子基因中启动子基因中内含子基因中内含子基因中内含子基因中内含子基因多少基因多少基因多少基因多少物种间基因交流物种间基因交流物种间基因交流物种间基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物的部分某种生物的部分基因基因某种生物的全部某种生物的全部基因基因可以可以部分基因可以部分基因可以解旋酶催化解旋酶催化1)解旋解旋模板模板2)合成互补子链合成互补子链 以母链为模板进行以母链为模板进行碱基配对碱基配对(在在DNA聚合酶聚合酶的催化下的催化下,利用游离的脱氧核苷酸进行利用游离的脱氧核苷酸进行)母链（旧链）母链（旧链）子链子链（新链）（新链）子代子代DNA:同时进行同时进行(边解旋边复制边解旋边复制)组成组成3)形成新的形成新的DNA分子分子补：补：DNA复制过程复制过程：作用：作用：把单个脱氧核苷把单个脱氧核苷酸连接成链酸连接成链(形成磷酸二形成磷酸二酯键酯键)2.利用PCR技术扩增目的基因1 1概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。2 2原理：原理：DNADNA复制复制原料：原料：模板模板DNADNA；DNADNA引物；四种脱氧核苷引物；四种脱氧核苷酸；热稳定酸；热稳定DNADNA聚合酶聚合酶多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段3 3前提：前提：已知目的基因的一段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技术的操作过程a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：）：双链双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：）：系统温度降低，系统温度降低，引物引物与与DNADNA模模板结合，形成局部板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模板的作用下，合成与模板互补的互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.d.重复重复a.b.ca.b.c步骤：每重复一步骤：每重复一次，目的基因增加次，目的基因增加_倍倍一一PCR技术的操作过程PCR技术的操作过程PCRPCR反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成指数指数指数指数(2(2n n)形式扩增形式扩增形式扩增形式扩增PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋边复制边解旋边复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶、聚合酶、解旋酶等解旋酶等n 过程：过程：变性、退火、延伸三步曲变性、退火、延伸三步曲变性：变性：9095退火：退火：5560延伸：延伸：70753.人工合成法利用利用DNADNA合成仪人工合成的前提：合成仪人工合成的前提：基因较小，核苷酸基因较小，核苷酸序列已知序列已知蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测思考：思考：化学法合化学法合成的目的基因含成的目的基因含内含内含子、启动子和终止子子、启动子和终止子吗？吗？课堂小结1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成种种类类基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法思考：为什么要构建思考：为什么要构建基因表达载体？基因表达载体？（1 1）使目的基因在受体细胞中稳定存在）使目的基因在受体细胞中稳定存在并并可以遗传可以遗传给下一代；给下一代；（2 2）使目的基因能够）使目的基因能够表达表达和发挥作用。和发挥作用。二、构建二、构建表达表达载体载体思考：思考：作为基因工程表达载体，作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务只需含有目的基因就可以完成任务吗？吗？不可以。不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，并发挥作用，还需要有其他控制元件还需要有其他控制元件，如，如启动子、终止子和标记基因等。启动子、终止子和标记基因等。2.2.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a a、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因启动子启动子：终止子：终止子：标记基因：标记基因：位于基因位于基因首端首端的一段特殊的的一段特殊的DNADNA片段，片段，它是它是RNARNA聚合酶聚合酶识别和结合的部位，有识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出了它才能驱动基因转录出mRNAmRNA。位于基因位于基因尾端尾端的一段特殊的的一段特殊的DNADNA片段，片段，能能终止终止mRNAmRNA的转录。的转录。鉴别受体细胞中是否含有目的基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从，从而将有目的基因的细胞筛选出来。而将有目的基因的细胞筛选出来。相同点：相同点：不同点：不同点：思考：思考：载体载体与与表达载体表达载体的异同的异同都有都有标记基因标记基因和和复制原点。复制原点。表达载体在载体基础上增加了表达载体在载体基础上增加了目目的基因、启动子、终止子的基因、启动子、终止子三部分三部分结构。结构。基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶切割限制酶切割两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接连接酶连接重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端用用同一种限制酶同一种限制酶分别切割目的基因个质粒，分别切割目的基因个质粒，使之露出相同的粘性末端，并用使之露出相同的粘性末端，并用DNA连接酶连接酶使之连接使之连接 三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化：目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物植物细胞细胞将目的基因导入将目的基因导入动物动物细胞细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物微生物细胞细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞n农杆菌转化法农杆菌转化法n基因枪法基因枪法n花粉管通道法花粉管通道法（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法特点：特点：TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移可以转移到受体细胞，并整合到受体到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的细胞染色体的DNADNA上。上。易感染易感染双子叶植物双子叶植物和裸子和裸子植物，对大多数单子叶植植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。物没有感染能力。转化过程转化过程:TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌 基因枪法又称微基因枪法又称微弹轰击法，是弹轰击法，是利用压利用压缩气体产生的动力缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体DNADNA打打入受体细胞中入受体细胞中，使目，使目的基因与其整合并表的基因与其整合并表达的方法。达的方法。（2 2）基因枪法）基因枪法适用于适用于适用于适用于单子叶植物单子叶植物单子叶植物单子叶植物（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，前，剪去柱头，然后，滴加滴加DNADNA（含目的基因）（含目的基因），使目的基因借助花，使目的基因借助花粉管通道进入受体细粉管通道进入受体细胞。胞。适用于适用于适用于适用于被子植物被子植物被子植物被子植物2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体提将基因表达载体提纯，用显微仪注射到纯，用显微仪注射到受精卵受精卵中中）（2 2）操作程序）操作程序:提纯提纯含目的基因表达载体含目的基因表达载体取取受精卵受精卵显微注射显微注射移植移植到输卵管或子宫到输卵管或子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物常用法常用法：常用菌常用菌：微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：过程：过程：CaCa2+2+处理大处理大肠杆菌肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态感受态细胞吸细胞吸收收DNADNA3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物受体细胞受体细胞导入方法导入方法受精卵受精卵体细胞体细胞受精卵受精卵细胞细胞/个体个体农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注显微注射技术射技术用用CaCa2+2+处理成处理成感受态细胞感受态细胞小结：将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组入重组DNADNA分子吗？分子吗？1 1真正能摄入重组真正能摄入重组真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNADNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。2 2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？维持和表达？不一定，需要检测不一定，需要检测不一定，需要检测不一定，需要检测四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定n检测检测:q是否插入目的基因是否插入目的基因q是否转录是否转录q是否翻译是否翻译n鉴定鉴定:q分子水平鉴定分子水平鉴定q个体生物学水平鉴定个体生物学水平鉴定转基因生转基因生物的物的DNA探针探针15N N15N N14N N14N N（1 1）检测是否插入了目的基因）检测是否插入了目的基因基因探针：基因探针：放射性同位素等标记的放射性同位素等标记的DNA分子分子方法方法 DNA分子杂交技术（分子杂交技术（DNA与与DNA）变性变性变性变性变性变性变性变性1、检测分子水平的检测变性变性变性变性方法方法 DNA与与mRNA杂交技术杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了）检测目的基因是否转录出了mRNA探针探针15N N15N N转基因生物转基因生物的的mRNA14N N14N N1、检测分子水平的检测1、检测分子水平的检测提提取取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法抗原抗原-抗体杂交抗体杂交苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白将将Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管从小鼠血管抽出血液分抽出血液分离出抗离出抗Bt毒毒素的抗体素的抗体抗体抗体蛋白质蛋白质 出现出现杂交带杂交带脱脱分分化化组组织织培培养养（二）鉴定（个体生物学水平）（二）鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等类类型型步骤步骤 检测内容检测内容方法方法结果显示结果显示分分子子检检测测第一第一步步目的基因是否进目的基因是否进入受体细胞入受体细胞DNADNA分子杂交分子杂交（DNADNA和和DNADNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第二第二步步目的基因是否转目的基因是否转录出录出mRNAmRNA分子杂交技术分子杂交技术（DNADNA和和mRNAmRNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第三第三步步目的基因是否翻目的基因是否翻译出蛋白质译出蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带个个体体水水平平鉴鉴定定 包括抗虫、抗病的包括抗虫、抗病的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及，以确定是否有抗性以及抗性的程度；抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。否相同等。v目的基因的表达和检测归纳归纳:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u感受细胞法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注感受细胞法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）射法（动物）4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译；个体检测：是否插入、转录、翻译；个体课堂练习1 1、有关基因工程的叙述中，错误的是有关基因工程的叙述中，错误的是()()A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、限制性内切酶用于目的基因的获得、限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、人工合成目的基因不用限制性内切酶、人工合成目的基因不用限制性内切酶A课堂练习2 2、下列属于获取目的基因的方法的是下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取 从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成 A.B.A.B.C.D.C.D.D课堂练习3 3、有关基因工程的叙述正确的是、有关基因工程的叙述正确的是 （）A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料资料D课堂练习4 4、基因工程是在、基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计施工分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是补配对的步骤是 （）A A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C【拓展深化拓展深化】只有第三步将目的基因导入受只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对及碱基互补配对课堂练习即时应用即时应用(随学随练，轻松夺冠随学随练，轻松夺冠)5(2009年高考浙江卷年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述，下列关于基因工程的叙述，错误的是错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物物B限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的连接酶是两类常用的工具酶工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细的细胞和促进目的基因的表达胞和促进目的基因的表达D D