第五章-微生物的生长繁殖与生长因子I.ppt

第五章第五章 微生物的生长繁殖与生存因子微生物的生长繁殖与生存因子 理解微生物的连续培养理解微生物的连续培养掌握单细胞微生物的生长曲线和在污掌握单细胞微生物的生长曲线和在污水处理中的应用水处理中的应用理解温度和理解温度和pHpH对微生物的影响对微生物的影响理解溶解氧对微生物的影响理解溶解氧对微生物的影响理解有机物及抗生素对微生物的影响理解有机物及抗生素对微生物的影响理解高温对微生物的影响理解高温对微生物的影响了解微生物与微生物的一般关系了解微生物与微生物的一般关系掌握互生和共生关系掌握互生和共生关系了解菌种的退化和复壮了解菌种的退化和复壮理解菌种的保藏方法理解菌种的保藏方法重点：重点：重点：重点：微生物的生长繁殖规律和生长影响因子，微生物的生长繁殖规律和生长影响因子，难点：难点：难点：难点：单细胞微生物的生长曲线单细胞微生物的生长曲线第一节第一节 微生物微生物的生长繁殖的生长繁殖一、微生物生长繁殖的概念一、微生物生长繁殖的概念 细细菌菌两两次次细细胞胞分分裂裂之之间间的的时时间间称称为为世世代代时时间间（代代时时）。在在一一定定培培养养条条件件下下，世世代代时时间间是是一一定定的的。如如果果营营养养成成分分不不同同，世世代代时时间间不不同同。不不同同种种的的微微生生物物，世世代代时时间间不不同同。原原核核微微生生物物的的繁繁殖殖速速度度比比真真核核快快，专专性性厌厌氧氧菌菌的的世世代代时时间间多多数数比比好好氧氧菌的长。菌的长。生长生长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用作用 异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。发育发育从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。一些细菌的代时一些细菌的代时菌名菌名培养基培养基培养温度培养温度 代时代时E.coli（大肠杆菌）大肠杆菌）肉汤肉汤 3717minE.coli 牛奶牛奶 3712.5Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）产气肠细菌）肉汤或牛奶肉汤或牛奶 371618E.aerogenes 组合组合 372944B.Cereus（蜡状芽孢杆菌）蜡状芽孢杆菌）肉汤肉汤3018B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌）嗜热芽孢杆菌）肉汤肉汤5518.3Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌）嗜酸乳杆菌）牛奶牛奶376687Streptococcus lactis（乳酸链球菌）乳酸链球菌）牛奶牛奶3726S.lactis乳糖肉汤乳糖肉汤3748Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）伤寒沙门氏菌）肉汤肉汤3723.5Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌）褐球固氮菌）葡萄糖葡萄糖2534446Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合结核分枝杆菌）组合3779293Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌）活跃硝化杆菌）组合组合271200 二、研究微生物生长的方法二、研究微生物生长的方法微生物生长分个体生长和群体生长：微生物生长分个体生长和群体生长：个体生长个体生长个体生长个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长群体生长群体生长群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）群体生长来反映个体生长的状况）培培养养方方法法有有两两种种，一一种种是是分分批批培培养养（间间歇歇式式培培养养），另另一一种种是是连连续续培培养养。一一般般通通过过测测定定细细菌菌重重量量或或数数量量随随培培养养时时间间延延续续的的曲曲线线关关系系来来考考察察细细菌菌的的生生长特性。长特性。（一）分批培养（一）分批培养 分分批批培培养养是是在在一一个个封封闭闭的的、有有一一定定体体积积的的液液体体培培养养基基的的容容器器中中接接种种一一定定量量的的微微生生物物，在在特特定定条条件件下下进进行行培培养养,并并定定时时取取样样测测定定活活微微生生物物数数目目的的变变化化。在在分分批培养中微生物只完成一次生长循环。批培养中微生物只完成一次生长循环。微微生生物物生生长长曲曲线线：在在分分批批培培养养过过程程中中，微微生生物物的的数数量量由由少少变变多多，达达到到高高峰峰后后又又由由多多变变少少，甚甚至至死死亡亡的的变变化化规规律律。用用坐坐标标法法作作图图,以以时时间间为为横横坐坐标标,以以单单细细胞胞微微生生物物数数量量的的对对数数为为纵纵坐坐标标,可可以以绘绘出出一一条条有有规规律律的的曲线曲线,称为生长曲线。称为生长曲线。生长曲线生长曲线 稳定期稳定期 衰衰亡亡期期 细细胞胞数数目目的的对对数数值值 0时间时间t t微生物的数量很大，都是微生物的数量很大，都是微生物的数量很大，都是微生物的数量很大，都是1010的的的的n n次方次方次方次方，取对数作图时方便。，取对数作图时方便。，取对数作图时方便。，取对数作图时方便。总细胞数总细胞数总细胞数总细胞数活细胞数活细胞数活细胞数活细胞数为什么微生物数目用为什么微生物数目用为什么微生物数目用为什么微生物数目用对对对对数值数值数值数值作图？作图？作图？作图？缓缓 慢慢 期期对对数数期期1 1、停滞期（延迟期或适应期）（、停滞期（延迟期或适应期）（lag phaselag phase）:当细菌被接种到新鲜培养基中，开始一段时间内，通当细菌被接种到新鲜培养基中，开始一段时间内，通常不立即进行细胞分裂、增殖，生长速率近于零，细胞常不立即进行细胞分裂、增殖，生长速率近于零，细胞数目几乎保持不变，甚至稍有减少，这段时间被称为停数目几乎保持不变，甚至稍有减少，这段时间被称为停滞期。滞期。特点特点：生长速率生长速率=0细胞形态变大或增长细胞形态变大或增长细胞内细胞内RNA特别是特别是rRNA含量增高含量增高合成代谢活跃（核糖体、酶类、合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生合成加快），易产生诱导酶诱导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）化学药物）原因原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物 菌种菌种 ：繁殖速度较快繁殖速度较快(世代时间短世代时间短)的的菌种的延迟期一般较短；菌种的延迟期一般较短；接种物菌龄接种物菌龄 ：用对数生长期的菌种接用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；期；接种量：一般来说，接种量：一般来说，接种量增大可缩短接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/101/10的接种量）；的接种量）；营养：培养基成分营养：培养基成分 在营养成分丰富的在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；基上生长时短；接种后培养基成分有较接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。基接近。影响停滞期长短的因素影响停滞期长短的因素影响停滞期长短的因素影响停滞期长短的因素认识停滞期的特点及形成原因对实践的指导意义：认识停滞期的特点及形成原因对实践的指导意义：认识停滞期的特点及形成原因对实践的指导意义：认识停滞期的特点及形成原因对实践的指导意义：在工业上需设法尽量缩短延迟期，采取的缩在工业上需设法尽量缩短延迟期，采取的缩短短lag phase lag phase 的措施有：的措施有：增加接种量；增加接种量；（群体优势（群体优势-适应性增强）适应性增强）采用对数生长期的健壮菌种；采用对数生长期的健壮菌种；调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分；基的某些成分；选用繁殖快的菌种。选用繁殖快的菌种。2 2、对数期（指数期）、对数期（指数期）logarithmic phaselogarithmic phase 细细菌菌生生长长速速度度达达到到最最大大，细细胞胞数数目目以以几几何何级级数数增增加加，其对数与时间呈直线关系。其对数与时间呈直线关系。特点特点特点特点：（1 1）细菌迅速分裂，菌数按几何级数增加；）细菌迅速分裂，菌数按几何级数增加；（2 2）世代时间最短，而且恒定；）世代时间最短，而且恒定；（3 3）生长速度最高而且恒定；）生长速度最高而且恒定；（4 4）代谢活力强无死亡；）代谢活力强无死亡；（5 5）菌体整齐，体积恢复到原来大小；）菌体整齐，体积恢复到原来大小；（6 6）对环境敏感，生理性状及菌体成分较一致）对环境敏感，生理性状及菌体成分较一致细菌代时细菌代时(generation(generation time;Gtime;G)的计算的计算细细菌菌的的代代时时即即世世代代时时间间，或或称称倍倍增增时时间间是是指指细细菌菌繁繁殖殖一一代代即即个个体体数数目目增增加加一一倍倍的的时时间间。细细菌菌代代时时的测定必须以对数期的生长细胞作为对象。的测定必须以对数期的生长细胞作为对象。世代时间的计算世代时间的计算(P167)：x2=x12n以对数表示：以对数表示：lgx2=lgx1+nlg2生长速率常数生长速率常数平均世代时间平均世代时间影响因素：影响因素：（1 1）温温度度。在在适适温温范范围围内内，每每增增加加1010，生生长长速速度提高度提高1 1倍；倍；（2 2）营养；）营养；（3 3）氧气。好氧菌若能供给充足的氧，可能使对数）氧气。好氧菌若能供给充足的氧，可能使对数期延长。期延长。延长措施延长措施延长措施延长措施：定时定量加入营养物质，同时排出代谢产物，：定时定量加入营养物质，同时排出代谢产物，或使用连续培养。或使用连续培养。应用意义应用意义应用意义应用意义：由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种的最佳菌由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种的最佳菌龄和龄和增殖噬菌体的最适宿主菌龄增殖噬菌体的最适宿主菌龄 ；发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度;食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期;是生理代谢及是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等遗传研究或进行染色、形态观察等的良好的良好材料材料。3 3、静止期、静止期 stationary phasestationary phase又称：稳定期或最高生长期。由于营养消耗，供应又称：稳定期或最高生长期。由于营养消耗，供应不足及代谢产物的积累，这时一部分菌死亡，细菌不足及代谢产物的积累，这时一部分菌死亡，细菌进入静止期。进入静止期。特点：特点：新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的生长速率处于动态平衡，培养物中的活细胞数目达到最高值。活细胞数目达到最高值。细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。孢的细菌开始产芽孢。此时期的微生物开始此时期的微生物开始合成次生代谢产物合成次生代谢产物，对，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。若目标是菌累达到高峰，是最佳的收获时期。若目标是菌体，则在静止期初期就要及时收获菌体。体，则在静止期初期就要及时收获菌体。产生原因：产生原因：1 1）营养物尤其是生长限制因子的耗尽；）营养物尤其是生长限制因子的耗尽；2 2）营养物的比例失调，例如）营养物的比例失调，例如C CN N比值不合适等；比值不合适等；3 3）酸、醇、毒素或）酸、醇、毒素或H2O2H2O2等有害代谢产物的累积；等有害代谢产物的累积；4 4）pHpH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜；、氧化还原势等物化条件越来越不适宜；5 5）溶解氧供应不足。）溶解氧供应不足。应用意义：应用意义：发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量。等），生产上应尽量延长此期，提高产量。措施如下：措施如下：措施如下：措施如下：补充营养物质（补料）补充营养物质（补料）调调pH pH 调整温度调整温度 4 4、衰亡期、衰亡期 decline phasedecline phase 由于营养缺乏和代谢产物积累造由于营养缺乏和代谢产物积累造成自身中毒，细胞生长受阻，时间和成自身中毒，细胞生长受阻，时间和菌数对数呈反比，生长曲线直线下降。菌数对数呈反比，生长曲线直线下降。特点：特点：特点：特点：细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现中的活菌数目急剧下降，出现“负生长负生长”。细胞进行内源性呼吸（因为营养缺乏），出现多形态、畸细胞进行内源性呼吸（因为营养缺乏），出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。形或衰退形，芽孢开始释放。因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡。因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡。衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。有关。产生原因：产生原因：产生原因：产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡成代谢，继而导致菌体的死亡（二）连续培养（二）连续培养（continuous culturecontinuous culture）连续培养：连续培养：连续培养：连续培养：在微生物培养的过程中，不断地供给新在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。态。恒化培养器恒化培养器 恒浊培养器恒浊培养器 新鲜培养基新鲜培养基 新鲜培养基新鲜培养基 光电池光电池 光源光源 流速控制阀流速控制阀 流速控制阀流速控制阀 流出物流出物 连续培养与间歇培养不同，它的特点是一方面连续进料，连续培养与间歇培养不同，它的特点是一方面连续进料，另一方面又连续出料。它又分为两种：另一方面又连续出料。它又分为两种：恒浊连续培养和恒化恒浊连续培养和恒化连续培养。连续培养。原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。单批培养单批培养 恒浊法恒浊法恒化法恒化法 单批培养单批培养连续培养连续培养时间时间连续流入连续流入新鲜培养液新鲜培养液lg细胞数（个细胞数（个/ml）连续培养连续培养（1 1）连续培养原理）连续培养原理 1 1、恒浊连续培养、恒浊连续培养 概念：概念：调节培养基流速，使培调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养养液浊度保持恒定的连续培养方法。方法。原理原理：通过调节新鲜培养基流：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度入的速度和培养物流出的速度来来维持菌浓度不变维持菌浓度不变,即浊度不即浊度不变变。主要采用恒浊器，当浊度。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基快，浊度降低，则减慢培养基的流速。的流速。特点：特点：基质过量，微生物始终基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，以最高速率进行生长，并可在并可在允许范围内控制不同的菌体密允许范围内控制不同的菌体密度度；但工艺复杂，烦琐。；但工艺复杂，烦琐。使用范围：使用范围：用于生产大量菌用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。乙醇等。2 2、恒化连续培养、恒化连续培养概念：概念：概念：概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。率恒定的方法。原理：原理：原理：原理：通过控制某一种营养物浓度通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因（如碳、氮源、生长因子等）子等），使其始终成为，使其始终成为生长限制因子生长限制因子，而达到控制培养液，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。件下进行生长繁殖。特点：特点：特点：特点：维持营养成分的维持营养成分的亚适量亚适量，控制微生物生长速率。，控制微生物生长速率。菌菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。体产量。应用范围：应用范围：应用范围：应用范围：实验室科学研究及污水生物处理。实验室科学研究及污水生物处理。常用的限制性营养物质有作为常用的限制性营养物质有作为N N源的氨、氨基酸；作为源的氨、氨基酸；作为C C源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸；生长因子、无机盐等。源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸；生长因子、无机盐等。恒化器恒化器Chemostat 或或bactogen 稀稀释释率率/稀稀释释度度（D D）：新新鲜鲜培培养养基基流流入入的的速速度度为为f f，培培养养器器中中培培养养液液体体积积为为V V，稀稀释释度度为为D=f/VD=f/V，表表示示单单位位时时间间内内，新新加加入入的的培培养养基基体体积积与与培培养养器器内内培培养养基总体积之比。基总体积之比。随随着着D D增增大大，细细菌菌浓浓度度先先升升后后降降，但但在在相相当当大大范范围围内内这这种种变变化化不不明明显显。当当稀稀释释度度增增大大到到最最大大比比生生长长速速率率时时，微微生生物物的的增增长长速速率率赶赶不不上上流流出出速速率率，结结果果必必然然是是到到某某一一时时刻刻，微微生生物物浓浓度度降降到到维维持持生生长长所所必必需需的的最最低低浓浓度度（临临界界浓浓度度）之之下下，这这时时培培养养器器内内微微生物浓度趋于零。这时的生物浓度趋于零。这时的D D为临界稀释度。为临界稀释度。装置装置控制对象控制对象培养培养基基培养基培养基流速流速生长速生长速率率产物产物应用应用范围范围恒浊器恒浊器 菌体密度菌体密度（内控制）（内控制）无限无限制生制生长因长因子子不恒定不恒定最高最高大量菌体大量菌体或与菌体或与菌体形成相平形成相平行的产物行的产物生产生产为主为主恒化器恒化器 培养基流培养基流速（外控速（外控制）制）有限有限制生制生长因长因子子恒定恒定低于最低于最高高不同生长不同生长速率的菌速率的菌体体实验实验室为室为主主恒浊器与恒化器的比较恒浊器与恒化器的比较三、细菌生长曲线在废水处理中的应用三、细菌生长曲线在废水处理中的应用 在在废废水水生生物物处处理理时时，可可利利用用不不同同生生长长阶阶段段的的微生物处理废水：微生物处理废水：常规活性污泥法：减速期，静止期常规活性污泥法：减速期，静止期生物吸附法：生长下降阶段（静止期）生物吸附法：生长下降阶段（静止期）高负荷活性污泥法：对数期、减速期高负荷活性污泥法：对数期、减速期延时曝气法：衰亡期延时曝气法：衰亡期 利用对数期进行废水生物处理，虽然反应速率快，利用对数期进行废水生物处理，虽然反应速率快，但想取得稳定的出水及较高的处理效果亦比较困难。故但想取得稳定的出水及较高的处理效果亦比较困难。故一般在废水生物处理工程中，常利用减速生长期或内源一般在废水生物处理工程中，常利用减速生长期或内源呼吸初期的微生物的生长、活动，使废水中的有机物稳呼吸初期的微生物的生长、活动，使废水中的有机物稳定化，并取得较好的处理效果。定化，并取得较好的处理效果。四、微生物生长量的测定方法四、微生物生长量的测定方法 可可根根据据菌菌体体细细胞胞量量、菌菌体体体体积积、重重量量直直接接测测定定，也也可可以以根根据据某某种种细细胞胞物物质质的的含含量量或或某某个个代代谢谢活活动动速速度度间接测定（比浊法，碳、氮含量法，间接测定（比浊法，碳、氮含量法，DNADNA测定法等）。测定法等）。微微生生物物生生长长测测量量方方法法个体计数法个体计数法重重 量量 法法生理指标法生理指标法1.1.血球计数板法血球计数板法原理：原理：将将1mm20.02mm的薄层空间划分为的薄层空间划分为400小格，小格，从中均匀分布地选取从中均匀分布地选取80小格，计数其中的细胞数目，小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。换算成单位体积中的细胞数。适用范围：适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细）细菌细胞太小，不易沉降；（菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。线，超出油镜工作距离。特点：特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。2.2.涂片染色法涂片染色法应用：可同时计数不同微生物的菌数，适于土壤、牛应用：可同时计数不同微生物的菌数，适于土壤、牛奶中细菌计数。奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.1ml0.1ml菌液菌液涂于涂于1cm1cm2 2面积上，计数后代入公式：面积上，计数后代入公式：每每mlml原菌液含菌数原菌液含菌数=视野中平均菌数视野中平均菌数涂布面积涂布面积/视野面积视野面积1010稀释倍稀释倍数数3.平板菌落计数法平板菌落计数法技术要求技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（：样品充分混匀，操作熟练快速（1520min完完成操作），严格无菌操作；成操作），严格无菌操作；注意事项：注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；处理，倾注平板时的培养基温度；适用范围：适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，长的微生物，误差：误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作样品内菌体分布不均匀、以及不当操作4、薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法 常用该法测定含菌量较少的空气和水中的常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。样品中所含菌数。5.干重法干重法 将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来出来,然后烘干然后烘干(干燥温度可采用干燥温度可采用105105、100100或或80)80)、称重。一般干重为湿重的、称重。一般干重为湿重的10%10%-20%-20%，而一个细，而一个细菌细胞一般重约菌细胞一般重约1010-12-12-10-10-13-13g g。该法适合菌浓度较高的样品。该法适合菌浓度较高的样品。举举例例：大大肠肠杆杆菌菌一一个个细细胞胞一一般般重重约约10101212-10-101313g g，液液体体培培养养物物中中细细胞胞浓浓度度达达到到2 210109 9个个/ml/ml时时，100ml100ml培培养养物可得物可得10-90mg10-90mg干重的细胞。干重的细胞。6.比浊法比浊法原理：是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度原理：是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。特点：快速、简便；但易受干扰。7.生理指标法生理指标法测含氮量测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的一般细菌含氮量为干重的12.5%12.5%，酵母菌为，酵母菌为7.5%7.5%，霉菌为，霉菌为6.0%6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.256.25，就可，就可测得粗蛋白的含量。测得粗蛋白的含量。其他方法其他方法含碳、磷含碳、磷、DNADNA、RNARNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。五、五、获得纯培养的方法获得纯培养的方法纯培养纯培养(pure culture)(pure culture)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代过培养繁殖而得到的后代,称纯培养称纯培养.（1 1）液体稀释法液体稀释法（2 2）平板划线分离法（平板划线分离法（Streak Plate）（3 3）平板涂布分离法（平板涂布分离法（Spread Plate）（4 4）选择性培养分离法选择性培养分离法（5 5）单细胞（单孢子）分离法）单细胞（单孢子）分离法 首先将待分离的样品进行连续稀释首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度目的是得到高度稀释的效果稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物使一支试管中分配不到一个微生物.如果经如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物殖而来的纯培养物.这种方法适合于细胞较大的微生物这种方法适合于细胞较大的微生物.（1 1）液体稀释法液体稀释法（2 2）平板划线分离法（平板划线分离法（Streak Plate）特点：快速、方便。特点：快速、方便。分区划线（适用于浓度较大的样品）分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）（3 3）平板涂布分离法（平板涂布分离法（Spread Plate）简单易行，但易造成机械损伤简单易行，但易造成机械损伤（4 4）选择性培养分离法选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。条件等，采用选择培养的方法进行分离。利用选择培养基进行直接分离利用选择培养基进行直接分离富集培养富集培养（5 5）单细胞（单孢子）分离法）单细胞（单孢子）分离法 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。在显微镜下进行。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。分离。第二节第二节微生物的生存因子微生物的生存因子 微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用响和相互作用:一方面一方面,各种各样的环境因素对微各种各样的环境因素对微生物的生长和繁殖有影响生物的生长和繁殖有影响,另一方面另一方面,微生物生长微生物生长繁殖也会影响和改变环境繁殖也会影响和改变环境.研究环境因素与微生物研究环境因素与微生物之间的关系之间的关系,可以通过控制环境条件来利用微生物可以通过控制环境条件来利用微生物有益的一面有益的一面,同时防止它有害的一面。同时防止它有害的一面。温度是影响微生物生长的最重要因素之一。温度是影响微生物生长的最重要因素之一。温度对微生物的影响具体表现在：温度对微生物的影响具体表现在：影响酶活性。温度变化影响酶促反应速率，最影响酶活性。温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性。温度高，流动性大，有影响细胞膜的流动性。温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。吸收与代谢产物的分泌。影响物质的溶解度。对生长有影响。影响物质的溶解度。对生长有影响。一、温度一、温度最低生长温度最低生长温度:指微生物能进行繁殖的最低温度界限。指微生物能进行繁殖的最低温度界限。最适生长温度：最适生长温度：指使微生物迅速生长的温度指使微生物迅速生长的温度 。最高生长温度：最高生长温度：指微生物生长繁殖的最高温度界限。指微生物生长繁殖的最高温度界限。处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。微生物微生物根据微生物的最适生长温度分类根据微生物的最适生长温度分类嗜冷微生物嗜冷微生物嗜温微生物嗜温微生物嗜热微生物嗜热微生物超嗜热或嗜高温微生物超嗜热或嗜高温微生物 微生物类型微生物类型 最低温度最低温度o oC C 最适温度最适温度o oC C 最高温度最高温度o oC C嗜冷微生物嗜冷微生物-5-0-5-05-105-10 20-3020-30嗜温微生物嗜温微生物5-105-1025-4025-4045-5045-50嗜热微生物嗜热微生物303050-6050-6070-8070-80超嗜热或嗜高温微生物超嗜热或嗜高温微生物555570-10570-105110-113110-113嗜冷微生物嗜冷机制：嗜冷微生物嗜冷机制：专性嗜冷菌：最适专性嗜冷菌：最适5-155-15，最低，最低-12-12，两极地区。，两极地区。兼性嗜冷菌：最适兼性嗜冷菌：最适10-2010-20，最低，最低，-5-0-5-0，海水及冷藏食品，海水及冷藏食品 嗜冷微生物能在低温下生长的机制在于：嗜冷微生物能在低温下生长的机制在于：（1 1）酶在低温下仍能有效地发挥作用）酶在低温下仍能有效地发挥作用（2 2）细胞膜中不饱和脂肪酸含量较高，低温下仍能保）细胞膜中不饱和脂肪酸含量较高，低温下仍能保持流动状态。低温致死的原因是细胞内水分变成冰晶，持流动状态。低温致死的原因是细胞内水分变成冰晶，造成细胞脱水，还造成细胞尤其是细胞膜的损伤。造成细胞脱水，还造成细胞尤其是细胞膜的损伤。嗜热微生物嗜热机制嗜热微生物嗜热机制嗜热机制：嗜热机制：嗜热机制：嗜热机制：（1 1）酶以及核糖体有较强的抗热性酶以及核糖体有较强的抗热性（2 2）产产生生多多胺胺、热热亚亚胺胺和和高高温温精精胺胺，可可稳稳定定细细胞胞中中与与蛋蛋白白质质合成有关的结构和保护大分子免受高温的损害合成有关的结构和保护大分子免受高温的损害（3 3）核核酸酸具具有有较较高高的的热热稳稳定定性性（核核酸酸中中G+CG+C含含量量高高（tRNAtRNA），可提供形成氢键，增加热稳定性可提供形成氢键，增加热稳定性 ）。）。（4 4）细细胞胞膜膜中中含含有有较较多多的的饱饱和和脂脂肪肪酸酸和和直直链链脂脂肪肪酸酸，较较高高温温度下能维持正常的液晶状态。度下能维持正常的液晶状态。使膜具有热稳定性使膜具有热稳定性（5 5）生生长长速速率率快快，合合成成大大分分子子迅迅速速，可可及及时时弥弥补补由由于于热热所所造造成的大分子的破坏成的大分子的破坏嗜热菌：适于在嗜热菌：适于在45-5045-50中生长，主要分布在温泉、堆肥中生长，主要分布在温泉、堆肥和土壤中。和土壤中。菌名菌名生长温度生长温度发酵温度发酵温度累积产物温度累积产物温度 （）（）（）Streptococcus thermophilus374737S.lactis3440产细胞：产细胞：2530产乳酸：产乳酸：30Streptomyces griseus3728_Corenybacterium pekinense32 3335_Clostridium acetobutylicum3733_Penicilium chrysogenum302520 以青霉素的生产为例：培养以青霉素的生产为例：培养165165小时采用小时采用分段控制温度分段控制温度分段控制温度分段控制温度的的方法，其青霉素产量比始终在方法，其青霉素产量比始终在30 30 培养提高了培养提高了14.7%14.7%。分段控制方式分段控制方式分段控制方式分段控制方式：0-50-5小时，小时，30 30；5-405-40小时，小时，25 25；40-40-125125小时，小时，20 20；125-165125-165小时，小时，25 25。不同生理生化过程的最适温度不同生理生化过程的最适温度 微生物不同生理活动要求不同温度，所以最适生长温度微生物不同生理活动要求不同温度，所以最适生长温度 发发酵速度快、积累代谢产物多。酵速度快、积累代谢产物多。高温与低温对微生物的影响高温与低温对微生物的影响1 1、高温对微生物的影响、高温对微生物的影响 高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。用于灭菌。破坏细胞结构（溶菌）。用于灭菌。2 2、低温对微生物的影响、低温对微生物的影响 当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖停止，用于保存食物和菌种。生物的生长繁殖停止，用于保存食物和菌种。造成死亡的原因：造成死亡的原因：冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤