实验：细胞化学染色POX.ppt

实验：细胞化学染色实验：细胞化学染色POXPOX沧州医专医学技术系沧州医专医学技术系 侯振江侯振江细胞化学染色细胞化学染色，是一种以，是一种以形态形态为基础，结为基础，结合运用合运用化学化学或或生物化学生物化学技术对血细胞内各技术对血细胞内各种化学成分作种化学成分作定位定位、定性定性及及半定量半定量分析的分析的方法。方法。用于研究用于研究血细胞生理血细胞生理、病理病理和化学结构；和化学结构；临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、预后监测和发病机制的探讨，疗效观察、预后监测和发病机制的探讨，提供重要依据。提供重要依据。血细胞化学染色的基本要求是在血细胞化学染色的基本要求是在原位原位显示细胞成分和结构，反应产物应是显示细胞成分和结构，反应产物应是有色沉淀物有色沉淀物，具有一定的，具有一定的稳定稳定性。性。血细胞化学染色可显示血细胞化学染色可显示糖原糖原、脂类脂类、酶酶、蛋白质蛋白质等。等。（一）（一）固定固定固定有固定有物理法物理法与与化学法化学法，物理法物理法为干燥和火焰固定，为干燥和火焰固定，化学法化学法最常用的是甲醛、乙醇、最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。丙酮和醋酸等。血细胞化学染色流程血细胞化学染色流程（二）（二）显示显示 1、偶氮偶联法偶氮偶联法：利用人工合成的酶底物，：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存在。氮色素，以此证明酶的存在。2、联苯胺法联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。3 3、普鲁士蓝法普鲁士蓝法：细胞内、外铁与酸性亚铁：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。4 4、雪夫反应雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。使无色品红形成红色沉淀。5 5、金属沉着法金属沉着法其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。诊断。（三）（三）细胞化学定量细胞化学定量粗略估量粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴性和各种程度的阳性。人为地区别为阴性和各种程度的阳性。百分法百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。色强弱。积分法积分法，是常用的半定量法，将等级估量与，是常用的半定量法，将等级估量与百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低，百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低，又反映了细胞受色的强弱。又反映了细胞受色的强弱。下面介绍几种常用的细胞化学染色方下面介绍几种常用的细胞化学染色方法法这些方法学在白血病的鉴别诊断上具这些方法学在白血病的鉴别诊断上具有重要意义。有重要意义。实验：细胞化学染色实验：细胞化学染色POX（一）（一）四甲基联苯胺法四甲基联苯胺法(TMB)【原理原理】粒细胞粒细胞和和单核细胞单核细胞的胞浆内的的胞浆内的髓髓过氧化物酶过氧化物酶（POX orMPO）分解）分解过氧过氧化氢化氢，释放，释放新生态氧新生态氧，使，使无色无色联苯胺氧化联苯胺氧化成成蓝色蓝色联苯胺，后者进一步变成联苯胺，后者进一步变成棕色棕色化合化合物沉着于物沉着于细胞质细胞质内。内。实验：实验：细胞细胞化学化学染色染色POX新生态氧新生态氧 OO过氧化氢过氧化氢（基质中）（基质中）四甲基联苯胺四甲基联苯胺TMBTMB （无色）（无色）联苯胺蓝（蓝色）联苯胺蓝（蓝色）亚硝基铁氰化钠亚硝基铁氰化钠 蓝色颗粒蓝色颗粒（浆内酶部位）（浆内酶部位）粒、单核粒、单核细胞胞浆细胞胞浆【原理原理】四甲基苯醌二胺四甲基苯醌二胺四甲基苯醌二胺四甲基苯醌二胺(棕色棕色棕色棕色)自我脱氢氧化自我脱氢氧化自我脱氢氧化自我脱氢氧化【试剂试剂】1%TMB亚硝基铁氰化钠饱和溶液亚硝基铁氰化钠饱和溶液1%过氧化氢溶液过氧化氢溶液稀过氧化氢溶液稀过氧化氢溶液瑞氏染色液瑞氏染色液【操作操作】1.取取0.1%TMB乙醇溶液乙醇溶液lml，加亚硝基铁氰加亚硝基铁氰化钠饱和溶液化钠饱和溶液10l l，混合溶液呈淡混合溶液呈淡棕黄色棕黄色。2.在新鲜干燥的血片上，加混合溶液在新鲜干燥的血片上，加混合溶液0.5ml,放置放置lmin后，再加稀过氧化氢溶液后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml，染色染色6min。3.瑞氏染液复染瑞氏染液复染1520min。4.油镜镜检。油镜镜检。【结果】【结果】细胞质内有细胞质内有蓝黑色颗粒蓝黑色颗粒蓝黑色颗粒蓝黑色颗粒者为阳性。者为阳性。（）（）无颗粒沉着；无颗粒沉着；（）颗粒细小颗粒细小，分布稀疏；，分布稀疏；（+）颗粒较粗，局灶分布；颗粒较粗，局灶分布；（+）颗粒粗大，分布较密，占胞质颗粒粗大，分布较密，占胞质 1/22/3；（+）颗粒粗大，呈团块分布；颗粒粗大，呈团块分布；（+）全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核。全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核。实验：细胞化学染色POX实验：细胞化学染色POX【临床意义】【临床意义】（1）粒系粒系：POX主要分布在主要分布在粒细胞粒细胞和和单核细胞单核细胞内，随内，随着粒细胞着粒细胞成熟成熟的程度而逐渐增强，中性分的程度而逐渐增强，中性分叶核粒细胞为叶核粒细胞为强强阳性阳性。嗜酸嗜酸性粒细胞阳性程度性粒细胞阳性程度最强最强，其阳性颗粒，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。比中性粒细胞粗大，有折光。碱性碱性粒细胞为粒细胞为阴性阴性。（2）单核细胞单核细胞：原始单原始单核细胞为核细胞为阴性阴性反应，反应，幼稚单幼稚单核细胞和核细胞和成熟单成熟单核细胞呈核细胞呈弱阳性弱阳性反应，颗粒细小，弥散分布。反应，颗粒细小，弥散分布。（3）其他细胞其他细胞淋巴淋巴细胞、细胞、浆浆细胞、细胞、幼红幼红细胞、细胞、组织组织细细 胞、胞、巨核巨核细胞均呈细胞均呈阴性阴性反应。反应。（4）血小板过氧化物酶血小板过氧化物酶主要定位于主要定位于幼稚型幼稚型巨核细胞的核膜上，可巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种标志物，有助于作为原巨核细胞的一种标志物，有助于FAB M7的识别。的识别。（5）过氧化物酶染色过氧化物酶染色主要用于主要用于鉴别急性白血病类型鉴别急性白血病类型，急性髓细胞白血病多呈急性髓细胞白血病多呈阳性阳性反应，以反应，以M3和和M2型反应最型反应最强强，MI和和M5型反应较型反应较弱弱，故有助于区别故有助于区别M3和和M5型。型。急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病呈呈POX阴性阴性反应，故反应，故为为急性髓细胞急性髓细胞和和淋巴细胞白血病鉴别淋巴细胞白血病鉴别的重的重要指标。要指标。实验：细胞化学染色实验：细胞化学染色POXPOX 1.1.涂片应涂片应新鲜制作、厚薄适宜新鲜制作、厚薄适宜。2.2.TMB TMB 配制在配制在85858888的乙醇溶液中染色效果较好的乙醇溶液中染色效果较好，勿用，勿用90909595乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而使显色反应减弱或消失。胞内渗入而使显色反应减弱或消失。3.3.过氧化氢溶液需新鲜配制过氧化氢溶液需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。，其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示过氧化氢过浓。若示过氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示无效无效。4.4.染色液适宜染色液适宜pHpH值应为值应为5.55.5，若，若pHpH值值 5.010个铁颗粒。个铁颗粒。正常范围：正常范围：30%90%，平均平均60%，多见多见型，少见型，少见型，无型，无、型。型。实验：细胞化学染色POX细胞内铁细胞内铁（3）环形铁粒幼红细胞环形铁粒幼红细胞：指含铁颗粒指含铁颗粒6个个，其中，其中2/3以上以上铁颗粒铁颗粒围绕核周排列成完整环形或不完整围绕核周排列成完整环形或不完整环形环形。正常或非铁粒幼细贫血正常或非铁粒幼细贫血无无环形铁粒幼细环形铁粒幼细胞，胞，铁粒幼细贫血铁粒幼细贫血中环形铁粒幼细胞中环形铁粒幼细胞6%。实验：细胞化学实验：细胞化学染色染色POX【临床意义】【临床意义】1缺铁性贫血缺铁性贫血时，时，骨骨髓髓细细胞胞外外铁铁明明显显减减少少，为为“一一”“士士”，细胞内铁平均，细胞内铁平均5.9%，仅为，仅为I型。型。经有效铁剂治疗后，外铁增多。经有效铁剂治疗后，外铁增多。因此骨髓铁染色是诊断因此骨髓铁染色是诊断缺铁性贫血缺铁性贫血及及指导指导铁剂治疗铁剂治疗的重要方法。的重要方法。2铁粒幼细胞性贫血铁粒幼细胞性贫血时，时，外铁外铁“2”一一“3”，内铁平均，内铁平均70%，其铁粒粗大，以，其铁粒粗大，以 型为主，型为主，出现较多环形铁粒幼细胞。出现较多环形铁粒幼细胞。因此，本实验是诊断因此，本实验是诊断铁粒幼细胞贫血铁粒幼细胞贫血的有效方法。的有效方法。MDS也可出现环形铁粒幼细胞。也可出现环形铁粒幼细胞。3.非缺铁性贫血非缺铁性贫血如如巨巨幼幼细细胞胞贫贫血血、溶溶血血性性贫贫血血、再再生生障障碍碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度的增加。性贫血等骨髓铁正常或不同程度的增加。但但再再生生障障碍碍性性贫贫血血不不会会出出现现环环形形铁铁粒粒幼幼细细胞，可作为与胞，可作为与MDS鉴别的参考。鉴别的参考。4.继继发发性性贫贫血血的的部部分分患患者者细细胞胞内内铁铁可可减减少少，但细胞外铁不减少。但细胞外铁不减少。谢谢！谢谢！