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第第 九九 章章 离子交换层析法离子交换层析法仪器设备简介仪器设备简介离子交换全套装置第第 九九 章章 离子交换层析离子交换层析第一节第一节 离子交换层析基本原理离子交换层析基本原理第二节第二节 离子交换剂的离子交换剂的分类与性质分类与性质 第三节第三节 离子交换剂与缓冲液的选择离子交换剂与缓冲液的选择第四节第四节 离子交换拄层析操作方法离子交换拄层析操作方法第五节第五节 离子交换拄层析离子交换拄层析应用应用第一节第一节 离子交换层析基本原理离子交换层析基本原理一、离子交换剂的组成结构及其的特性一、离子交换剂的组成结构及其的特性 二、离子交换剂的选择性二、离子交换剂的选择性 三、离子交换柱层析原理示意图三、离子交换柱层析原理示意图 一、离子交换剂的组成结构及其特性一、离子交换剂的组成结构及其特性 基质基质基质基质 电荷基团电荷基团电荷基团电荷基团 反离反离反离反离子子子子商品名商品名商品名商品名纤维素纤维素纤维素纤维素 OCHOCH2 2COOCOO-NaNa+CM-CM-纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素-O-O-O-O-（CHCHCHCH2 2 2 2）2 2 2 2-N N+H H H H（C C C C2 2 2 2H H H H5 5 5 5）2 2 2 2 ClCl-DEAE-DEAE-纤维素纤维素纤维素纤维素聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯SOSO3 3 3 3-NaNa+732732阳离子树阳离子树阳离子树阳离子树脂脂脂脂 聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯N N+（CHCH2 2）4 4 4 4 ClCl-717717阴离子树阴离子树阴离子树阴离子树脂脂脂脂聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备离子交换树脂的形状结构示意图离子交换树脂的形状结构示意图二、离子交换剂的选择性二、离子交换剂的选择性1 1、平衡常数平衡常数 2 2、选择性与离子的电荷及、选择性与离子的电荷及 水合离子半径的关系水合离子半径的关系 3 3、离子浓度对选择性的影响、离子浓度对选择性的影响4 4、两性物质的选择性、两性物质的选择性 1 1、平衡常数、平衡常数 值值值值反反反反映映映映离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂对对对对不不不不同同同同离离离离子子子子的的的的结结结结合合合合力力力力或或或或选选选选择择择择性性性性，称称称称为为为为选选选选择择择择系系系系数数数数，此此此此外外外外平平平平衡衡衡衡的的的的移动遵循质量作用定律移动遵循质量作用定律移动遵循质量作用定律移动遵循质量作用定律 若若若若K K K KB B B BA A A A值值值值1 1 1 1，即，即，即，即RBRBRBRBRARARARA，若若若若K K K KB B B BA A A A值值值值1 1 1 1，即，即，即，即RBRBRBRBRA,RA,RA,RA,若若若若K K K KB B B BA A A A值值值值1 1 1 1，即，即，即，即RBRBRBRBRARARARA，RA+BRA+B+RB+A RB+A+2 2、选择性与离子的电荷及、选择性与离子的电荷及水合离子半径的关系水合离子半径的关系 离子交换剂与各种水合离子的结合力是离子交换剂与各种水合离子的结合力是与离子的电荷量成正比，而与水合离子半与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。径的平方成反比。一价离子：一价离子：LiLi+NaNa+K K+RbRb+CsCs+二价离子：二价离子：MgMg2+2+CaCa2+2+SrSr2+2+BaBa2+2+一价阴离子：一价阴离子：F F-ClCl-BrBr-I I-不同价阳离子：不同价阳离子：NaNa+CaCa2+2+AlAl3+3+TiTi4+4+磺酸基树脂和季胺基树脂磺酸基树脂和季胺基树脂对各种离子的相对选择系数对各种离子的相对选择系数 阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂 阴离子树脂阴离子树脂阴离子树脂阴离子树脂反离子反离子反离子反离子相对选择系数相对选择系数相对选择系数相对选择系数反离子反离子反离子反离子相对选择系数相对选择系数相对选择系数相对选择系数H H H H+NaNaNaNa+NHNHNHNH4 4 4 4+K K K K+MnMnMnMn2+2+2+2+MgMgMgMg2+2+2+2+FeFeFeFe2+2+2+2+1.01.01.01.01.51.51.51.51.951.951.951.952.52.52.52.52.352.352.352.352.52.52.52.52.552.552.552.55OHOHOHOH-柠檬酸柠檬酸柠檬酸柠檬酸乙酸乙酸乙酸乙酸 ClClClCl-HCOHCOHCOHCO-HPOHPOHPOHPO-苯苯苯苯1.01.01.01.02202202202203.23.23.23.2 222222226.06.06.06.05.55.55.55.5 500500500500 三、离子交换柱层析原理示意图三、离子交换柱层析原理示意图动画按钮第二节第二节 离子交换剂的分类及性质离子交换剂的分类及性质一、离子交换剂分类一、离子交换剂分类二、离子交换剂性质二、离子交换剂性质 一、离子交换剂分类一、离子交换剂分类1疏水性疏水性2亲水性亲水性(1)阳离子交换剂阳离子交换剂(2)阴离子交换剂阴离子交换剂（1）纤维素离子交换剂）纤维素离子交换剂（2）交联葡聚糖离子交换剂）交联葡聚糖离子交换剂（3）琼脂糖离子交换剂）琼脂糖离子交换剂1 1疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂 R-SOR-SOR-SOR-SO-3 3 3 3H+NaH+NaH+NaH+Na+=R-SO=R-SO=R-SO=R-SO3 3 3 3Na+HNa+HNa+HNa+H+R-PO R-PO R-PO R-PO（OHOHOHOH）2 2 2 2+Na+Na+Na+Na+=R-=R-=R-=R-POOHONaPOOHONaPOOHONaPOOHONa+H+H+H+H+R-NR-NR-NR-N+（CHCHCHCH3 3 3 3）3 3 3 3 OHOHOHOH-+ClClClCl-=R-N=R-N=R-N=R-N+（CHCHCHCH3 3 3 3）3 3 3 3 ClClClCl-+OH+OH+OH+OH-R-NR-NR-NR-N+（CHCHCHCH3 3 3 3）2 2 2 2 OHOHOHOH-+H+H+H+H2 2 2 2O=R-NO=R-NO=R-NO=R-N+（CHCHCHCH3 3 3 3）2 2 2 2 H H H HOHOHOHOH-R-N R-N R-N R-N+（CHCHCHCH3 3 3 3）2 2 2 2 H H H HOHOHOHOH-+ClClClCl-=R-N=R-N=R-N=R-N+（CHCHCHCH3 3 3 3）2 2 2 2 H H H HClClClCl+OH+OH+OH+OH-阴阴离离子子交交换换剂剂 阳阳离离子子交交换换剂剂2 2亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂 磷酸纤维素 CM-纤维素 DEAE-纤维素 CM-交联葡聚糖 DEAE-交联葡聚糖CM-CM-SepharoseSepharose CL-6B CL-6B 二、离子交换剂性质二、离子交换剂性质 n n颜色与形状颜色与形状 n n交联度交联度 n n吸水量或膨胀度吸水量或膨胀度 n n交换容量交换容量n n稳定性稳定性 n n比重比重 交换容量交换容量交换容量交换容量交换容量交换容量:是指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。是指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。(mg(mgg g或或mmolmmolg g、mgmgmlml或或mmolmmolml)ml)交换容量的交换容量的交换容量的交换容量的测定测定测定测定：强酸型与强碱型测定其解离盐的能力；强酸型与强碱型测定其解离盐的能力；弱酸型与弱碱型测定其中和酸碱的能力。弱酸型与弱碱型测定其中和酸碱的能力。影响交换容量的影响交换容量的影响交换容量的影响交换容量的因素因素因素因素：筛孔、离子强度、筛孔、离子强度、pHpH值值 。强酸型阳离子交换介质强酸型阳离子交换介质交换容量的测定法交换容量的测定法 取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用1mol1mol1mol1molL L L L的的的的NaOHNaOHNaOHNaOH处理，去离子水洗至中性，处理，去离子水洗至中性，处理，去离子水洗至中性，处理，去离子水洗至中性，1mol1mol1mol1molL L L L的的的的HClHClHClHCl处处处处理，去离子水洗至中性。然后用理，去离子水洗至中性。然后用理，去离子水洗至中性。然后用理，去离子水洗至中性。然后用1mol1mol1mol1molL L L L的的的的NaClNaClNaClNaCl洗脱，收集洗脱，收集洗脱，收集洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的洗脱液，再通过已标定的洗脱液，再通过已标定的洗脱液，再通过已标定的NaOHNaOHNaOHNaOH滴定洗脱液中的氢离子浓度，滴定洗脱液中的氢离子浓度，滴定洗脱液中的氢离子浓度，滴定洗脱液中的氢离子浓度，计算出吸附氢离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量，计算出吸附氢离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量，计算出吸附氢离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量，计算出吸附氢离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量，即可得到交换容量。即可得到交换容量。即可得到交换容量。即可得到交换容量。计算公式如下：计算公式如下：计算公式如下：计算公式如下：强碱型阴离子交换介质强碱型阴离子交换介质交换容量的测定方法交换容量的测定方法 取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净，用洗干净，用洗干净，用洗干净，用1mol1mol1mol1molL L L L的的的的HClHClHClHCl处理，去离子水洗至中性，处理，去离子水洗至中性，处理，去离子水洗至中性，处理，去离子水洗至中性，1mol1mol1mol1molL L L L的的的的NaOHNaOHNaOHNaOH处理，去离子水洗至中性。然后用处理，去离子水洗至中性。然后用处理，去离子水洗至中性。然后用处理，去离子水洗至中性。然后用1mol1mol1mol1molL L L L的的的的NaClNaClNaClNaCl洗脱，收集洗脱液，再通过已标定洗脱，收集洗脱液，再通过已标定洗脱，收集洗脱液，再通过已标定洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的的的的HClHClHClHCl滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，计算出吸滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，计算出吸滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，计算出吸滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，计算出吸附氢氧根离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的附氢氧根离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的附氢氧根离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的附氢氧根离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量即可得到交换容量。计算公式如下：质量即可得到交换容量。计算公式如下：质量即可得到交换容量。计算公式如下：质量即可得到交换容量。计算公式如下：凝胶或纤维类弱碱型阴离子或弱酸性阳离子交换介凝胶或纤维类弱碱型阴离子或弱酸性阳离子交换介凝胶或纤维类弱碱型阴离子或弱酸性阳离子交换介凝胶或纤维类弱碱型阴离子或弱酸性阳离子交换介质换容量的测定方法质换容量的测定方法质换容量的测定方法质换容量的测定方法 取一定量的离子交换介质，漂洗干净，用取一定量的离子交换介质，漂洗干净，用取一定量的离子交换介质，漂洗干净，用取一定量的离子交换介质，漂洗干净，用1mol1mol1mol1molL L L L的的的的NaClNaClNaClNaCl处理，去离子水洗至中性，缓冲液平衡，处理，去离子水洗至中性，缓冲液平衡，处理，去离子水洗至中性，缓冲液平衡，处理，去离子水洗至中性，缓冲液平衡，用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，直至柱内的介质用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，直至柱内的介质用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，直至柱内的介质用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，直至柱内的介质吸附的量达到饱和。用一定浓度的吸附的量达到饱和。用一定浓度的吸附的量达到饱和。用一定浓度的吸附的量达到饱和。用一定浓度的NaClNaClNaClNaCl或其他的洗或其他的洗或其他的洗或其他的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白质的脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白质的脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白质的脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白质的浓度，按如下计算公式交换容量。浓度，按如下计算公式交换容量。浓度，按如下计算公式交换容量。浓度，按如下计算公式交换容量。第三节第三节 离子交换剂与缓冲液的选择离子交换剂与缓冲液的选择 一、离子交换剂的选择一、离子交换剂的选择二、缓冲液的选择二、缓冲液的选择 一、离子交换剂的选择一、离子交换剂的选择n n必须考虑的影响因素必须考虑的影响因素 1 1阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择2 2强、弱离子交换剂的选择强、弱离子交换剂的选择3 3不同离子型交换剂的选择不同离子型交换剂的选择4 4不同基质离子交换剂的选择不同基质离子交换剂的选择必须考虑的因素必须考虑的因素要求要求要求要求 高度的不溶性和疏松的多孔结构或巨大的表面高度的不溶性和疏松的多孔结构或巨大的表面高度的不溶性和疏松的多孔结构或巨大的表面高度的不溶性和疏松的多孔结构或巨大的表面积，较多的交换基团和稳定的物理化学性质积，较多的交换基团和稳定的物理化学性质积，较多的交换基团和稳定的物理化学性质积，较多的交换基团和稳定的物理化学性质 影响影响因素因素因素因素 对样品生物活性和可溶性的影响对样品生物活性和可溶性的影响对样品生物活性和可溶性的影响对样品生物活性和可溶性的影响 pHpHpHpH对交换基团、分离物电荷及电性强弱的影响对交换基团、分离物电荷及电性强弱的影响对交换基团、分离物电荷及电性强弱的影响对交换基团、分离物电荷及电性强弱的影响 分子大小及共存物质的影响分子大小及共存物质的影响分子大小及共存物质的影响分子大小及共存物质的影响1 1阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择n n参照电泳结果参照电泳结果n n测定测定pIpIn n确定稳定确定稳定pHpH范围范围 碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素c c c c 酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、HCGHCGHCGHCG离子交换剂的选择图2 2、强、弱离子交换剂的选择、强、弱离子交换剂的选择3、不同离子型交换剂的选择选用何种类型离子交换剂选用何种类型离子交换剂?-取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。4不同基质离子交换剂的选择n n基质的理化性质n n目标物质的理化性质n n溶液的组成及杂质含量二、缓冲液的选择二、缓冲液的选择1 1、缓冲液、缓冲液pHpH的选择的选择 2 2、缓冲液离子组成的选择、缓冲液离子组成的选择3 3、缓冲液离子强度的选择、缓冲液离子强度的选择1 1、缓冲液、缓冲液pHpH的选择的选择 要求：要求：要求：要求：起起起起始始始始缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液能能能能使使使使样样样样品品品品中中中中有有有有效效效效成成成成分分分分与与与与离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂结结结结合合合合，洗洗洗洗脱脱脱脱液液液液能能能能使使使使有有有有效效效效成成成成分分分分从从从从离离离离子子子子交交交交换换换换剂上解离下来。剂上解离下来。剂上解离下来。剂上解离下来。PHPHPHPH值与目标物值与目标物值与目标物值与目标物pIpIpIpI的关系（的关系（的关系（的关系（pH=pIpH=pIpH=pIpH=pI1 1 1 1）选择性吸附选择性吸附选择性吸附选择性吸附 选用弱阳离子交换剂时，选用弱阳离子交换剂时，选用弱阳离子交换剂时，选用弱阳离子交换剂时，pHpHpHpH高于其高于其高于其高于其pKpKpKpK；选用弱阴离子交换剂时，选用弱阴离子交换剂时，选用弱阴离子交换剂时，选用弱阴离子交换剂时，pHpHpHpH低于其低于其低于其低于其pKpKpKpK；2 2、缓冲液离子组成的选择、缓冲液离子组成的选择缓冲液离子的缓冲液离子的缓冲液离子的缓冲液离子的pKpKpKpK值要接近所用的值要接近所用的值要接近所用的值要接近所用的pHpHpHpH，采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，如如如如：TrisTrisTrisTris缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液离离离离子子子子不不不不影影影影响响响响被被被被分分分分离离离离物物物物的的的的活活活活性性性性、测测测测定定定定、溶解度。溶解度。溶解度。溶解度。3 3、缓冲液离子强度的选择、缓冲液离子强度的选择起起起起始始始始缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液能能能能使使使使样样样样品品品品中中中中有有有有效效效效成成成成分分分分与与与与离离离离子子子子交交交交换换换换剂结合，一般小于剂结合，一般小于剂结合，一般小于剂结合，一般小于0.1mol/L0.1mol/L0.1mol/L0.1mol/L。洗洗洗洗脱脱脱脱液液液液能能能能使使使使有有有有效效效效成成成成分分分分从从从从离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂上上上上解解解解离离离离下下下下来，一般来，一般来，一般来，一般0.15mol/L0.15mol/L0.15mol/L0.15mol/L（或采用或采用或采用或采用pHpHpHpH洗脱）。洗脱）。洗脱）。洗脱）。第四节第四节 离子交换拄层析操作方式离子交换拄层析操作方式一、离子交换剂的处理、转型和再生一、离子交换剂的处理、转型和再生二、分离物质的交换二、分离物质的交换三、物质的洗脱与收集三、物质的洗脱与收集 一、离子交换剂的处理和转型一、离子交换剂的处理和转型n n一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性n n疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂 用用用用2-42-42-42-4倍的倍的倍的倍的2mol/L 2mol/L 2mol/L 2mol/L NaOHNaOHNaOHNaOH或或或或2mol/L HCl2mol/L HCl2mol/L HCl2mol/L HCl溶液处理溶液处理溶液处理溶液处理 n n亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂 用用用用0.5mol/LNa0H0.5mol/LNa0H0.5mol/LNa0H0.5mol/LNa0H或或或或0.5mol/LHCl0.5mol/LHCl0.5mol/LHCl0.5mol/LHCl溶液处理；溶液处理；溶液处理；溶液处理；n n转型与再生：由一种反离子转到另一种反离子的过程转型与再生：由一种反离子转到另一种反离子的过程转型与再生：由一种反离子转到另一种反离子的过程转型与再生：由一种反离子转到另一种反离子的过程。欲欲欲欲使使使使阳阳阳阳离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂转转转转成成成成钠钠钠钠型型型型时时时时，则则则则需需需需用用用用NaOHNaOHNaOHNaOH处处处处理理理理；欲欲欲欲使使使使其其其其转转转转成成成成氢氢氢氢型型型型时时时时，则则则则需需需需用用用用HClHClHClHCl处处处处理理理理；欲欲欲欲使使使使其其其其带带带带铵铵铵铵离离离离子子子子时时时时，则需用则需用则需用则需用NHNHNHNH4 4 4 4OHOHOHOH或或或或NHNHNHNH4 4 4 4C1C1C1C1处理。处理。处理。处理。目的：使离子交换剂带上所希望的离子或基团目的：使离子交换剂带上所希望的离子或基团二、分离物质的交换二、分离物质的交换n n分批法分批法n n柱层析法柱层析法n n实际交换量只能按理论实际交换量只能按理论交换量的交换量的2525-50-50计算计算。分批法分批法柱层析系统的组装柱层析系统的组装柱层析系统的连接三、物质的洗脱与收集三、物质的洗脱与收集 n n梯度混合器及形成的梯度混合器及形成的梯度变化梯度变化n n离子强度离子强度梯度洗脱梯度洗脱n npHpH值梯度洗脱值梯度洗脱产生梯度溶液的三种装置及形成的梯度变产生梯度溶液的三种装置及形成的梯度变化化 C=CC=CB B-（C CB B-C-CA A）（）（1-V1-V2 2/V/V1 1）B B1 1/A1/A1 C CA A、C CB B 梯度混合器梯度混合器A A瓶、瓶、B B瓶的浓度；瓶的浓度；A1 A1、B1 B1 A A瓶、瓶、B B瓶的横切面积；瓶的横切面积；V V2 2流经层析柱的体积，流经层析柱的体积，V V1 1梯度洗脱液的总体积。梯度洗脱液的总体积。线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱白蛋白的图谱第五节第五节 离子交换拄层析应用离子交换拄层析应用 一、去离子水的制备一、去离子水的制备二、制备、纯化生命物质二、制备、纯化生命物质二、测定蛋白质的等电点二、测定蛋白质的等电点