第七章-微生物的遗传变异与育种.ppt

第七章第七章 微生物的遗传变异与育种微生物的遗传变异与育种n第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础n第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种n第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种n第四节第四节 基因工程基因工程n第五节第五节 菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏理想的工业发酵菌种应符合以下要求：理想的工业发酵菌种应符合以下要求：遗传性状稳定；遗传性状稳定；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；于分离；尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离；量并利于分离；培养基成分简单、来源广、价格低廉；培养基成分简单、来源广、价格低廉；对温度、对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。遗传与变异的概念遗传与变异的概念遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传遗传(heredity)(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。具稳定性。遗传型（遗传型（genotypegenotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；全部基因的总和；-是一种内在可能性或潜力。是一种内在可能性或潜力。遗传型遗传型 +环境条件环境条件 表型表型表型（表型（phenotypephenotype）：）：指生物体所具有的一切外表特征和内在指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和特性的总和;-;-是一种是一种现实存在，现实存在，是具一定遗传型是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。的生物在一定条件下所表现出的具体性状。代谢代谢发育发育变变异异(variation):生生物物体体在在外外因因或或内内因因的的作作用用下下，遗遗传传物物质质的结构或数量发生改变。的结构或数量发生改变。变变异异的的特特点点：a.a.在在群群体体中中以以极极低低的的几几率率出出现现，（一一般般为为1010-6-61010-10-10）；b.b.形形状状变变化化的的幅幅度度大大；c.c.变变化化后后形形成成的新性状是稳定的，可遗传的。的新性状是稳定的，可遗传的。饰饰变变（modification）：指指不不涉涉及及遗遗传传物物质质结结构构改改变变而而只只发发生在转录、转译水平上的表型变化。生在转录、转译水平上的表型变化。特特点点是是：a.几几乎乎整整个个群群体体中中的的每每一一个个个个体体都都发发生生同同样样的的变变化化；b.性性状状变变化化的的幅幅度度小小；c.因因遗遗传传物物质质不不变变，故故饰饰变是不遗传的。变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。例如：例如：粘质沙雷氏菌：粘质沙雷氏菌：在在25下培养，产生深红色的灵杆菌素；在下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37下培养，不产生色素；如果重新将温度降到下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25，又恢复产色，又恢复产色素的能力。素的能力。遗传与变异的概念遗传与变异的概念微生物的独特生物学特性：微生物的独特生物学特性：（1 1）个体的体制极其）个体的体制极其简单简单；（2 2）营养体一般都是）营养体一般都是单倍体单倍体；（3 3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；（4 4）繁殖速度快繁殖速度快；（5 5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6 6）菌落形态特征的可见性和多样性；）菌落形态特征的可见性和多样性；（7 7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；（8 8）易于形成营养缺陷型易于形成营养缺陷型；（9 9）各种微生物一般都有相应的病毒；）各种微生物一般都有相应的病毒；（1010）存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；）存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；n微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的学基本理论问题中最热衷的研究对象研究对象研究对象研究对象。n对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代现代现代现代分子生物学分子生物学分子生物学分子生物学和和生物工程学生物工程学生物工程学生物工程学的发展，而且为的发展，而且为育种工育种工育种工育种工作作作作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。缘杂交到远缘杂交的方向发展。研究微生物遗传学的意义研究微生物遗传学的意义第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础n n种质连续理论种质连续理论种质连续理论种质连续理论：1883188318891889年间年间WeissmannWeissmann提出。认为遗传提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。物质是一种具有特定分子结构的化合物。n n基因学说基因学说基因学说基因学说：19331933年摩尔根（年摩尔根（Thomas Hunt MorganThomas Hunt Morgan）发现了染）发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。n但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。2020多种氨多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4 4种不同的核苷酸组成，它们通过排列核组合只能产生较少种种不同的核苷酸组成，它们通过排列核组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。起活性成分是蛋白质。n nDNADNADNADNA是遗传变异的物质基础的证明是遗传变异的物质基础的证明是遗传变异的物质基础的证明是遗传变异的物质基础的证明：19441944年以后，先后有利年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证（肺炎球菌用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验），的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验），才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。1928年，年，Griffith进行了以下几组实验：进行了以下几组实验：（1）动物实验）动物实验对小鼠注射活对小鼠注射活RII菌或死菌或死SIII菌菌 小鼠存活小鼠存活对小鼠注射活对小鼠注射活SIII菌菌小鼠死亡小鼠死亡对小鼠注射活对小鼠注射活RII菌和热死菌和热死SIII菌菌 小鼠死亡小鼠死亡 抽取心血抽取心血 分离分离 活的活的SIII菌菌一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验n（一）（一）经典转化实验（经典转化实验（transformationtransformation）：）：F.GriffithF.Griffith，n研究对象：研究对象：Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae（肺炎双球菌）（肺炎双球菌）nS SIIIIII型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性nR RIIII型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性Griffith转化试验示意转化试验示意混合培养混合培养RII型活菌型活菌SIII型活菌型活菌SIII型热死菌型热死菌RII型活菌型活菌SIII型活菌型活菌健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死病死病死病死（2）细菌培养实验）细菌培养实验（3）S型菌的无细胞抽提液试验型菌的无细胞抽提液试验以上实验说明：以上实验说明：加热杀死的加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使型细胞并使RII型细胞型细胞获得稳定的遗传性状，转变为获得稳定的遗传性状，转变为SIII型细胞。型细胞。热死热死SIII菌菌不生长不生长活活 RII 菌菌长出长出RII菌菌热死热死SIII菌菌长出大量长出大量RII菌和菌和10-6SIII菌菌活活R菌菌+S菌无细胞抽提液菌无细胞抽提液长出大量长出大量R菌和菌和少量少量S菌菌+活活RII菌菌平皿培养平皿培养加加S S菌菌DNADNA加加S S菌菌DNADNA及及DNADNA酶以外的酶酶以外的酶加加S S菌的菌的DNADNA和和DNADNA酶酶加加S S菌的菌的RNARNA加加S S菌的蛋白质菌的蛋白质加加S S菌的荚膜多糖菌的荚膜多糖活活R菌菌长出长出S菌菌只有只有R菌菌1944年年O.T.Avery、C.M.MacLeod和和M。McCarty从从热热死死S型型S.pneumoniae中中提提纯纯了了可可能能作作为为转转化化因因子子的的各各种种成成分分，并在离体条件下进行了转化试验：并在离体条件下进行了转化试验：只只有有S型型细细菌菌的的DNA才才能能将将S.pneumoniae的的R型型转转化化为为S型型。且且DNA纯纯度度越越高高，转转化化效效率率也也越越高高。说说明明S型型菌菌株株转转移给移给R型菌株的，是遗传因子。型菌株的，是遗传因子。（二）噬菌体感染实验（二）噬菌体感染实验nA.D.HersheyA.D.Hershey和和M.ChaseM.Chase，19521952年年（1）含）含32P-DNA的一组：放射性的一组：放射性85%在沉淀中在沉淀中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含15%放射性放射性沉淀中含沉淀中含85%放射性放射性沉淀中含沉淀中含25%放射性放射性以以3232S S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验n（2 2）含）含3535S-S-蛋白质的一组：放射性蛋白质的一组：放射性75%75%在上清液中在上清液中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含75%放射性放射性（三）植物病毒的重建实验（三）植物病毒的重建实验n为了证明核酸是遗传物质，为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-H.Fraenkel-ConratConrat（19561956）用含）用含RNARNA的烟草花叶病毒（的烟草花叶病毒（TMVTMV）进行）进行了著名的植物病毒重建实验。了著名的植物病毒重建实验。n将将TMVTMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与外壳与RNARNA核心相分离。分离后的核心相分离。分离后的RNARNA在没有蛋白质包在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。在病斑中还能分离出正常病毒粒子。选选用用TMVTMV和和霍霍氏氏车车前前花花叶叶病病毒毒（HRVHRV），分分别别拆拆分分取取得得各各自自的的RNARNA和和蛋蛋白白质质，将将两两种种RNARNA分分别别与与对对方方的的蛋蛋白白质外壳重建形成两种杂合病毒：质外壳重建形成两种杂合病毒：（1 1）RNARNA（TMVTMV）蛋白质（蛋白质（HRVHRV）（2 2）RNARNA（HRVHRV）蛋白质（蛋白质（TMVTMV）用两种杂合病毒感染寄主：用两种杂合病毒感染寄主：（1 1）表现）表现TMVTMV的典型症状病分离到正常的典型症状病分离到正常TMVTMV粒子粒子（2 2）表现）表现HRVHRV的典型症状病分离到正常的典型症状病分离到正常HRVHRV粒子。粒子。上述结果说明，在上述结果说明，在RNARNA病毒中，遗传的物质基础病毒中，遗传的物质基础也是核酸。也是核酸。l（一）核酸存在的七个水平及质粒（一）核酸存在的七个水平及质粒细胞水平：细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平细胞核水平:原与真核生物的细胞核结构不同，核外原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA染色体水平染色体水平:倍性倍性(真核真核)和染色体数和染色体数核酸水平：核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或或RNA，复合或裸露，双链或单链，复合或裸露，双链或单链基因水平：基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录量，转录翻译翻译密码子水平：密码子水平：信息单位信息单位,起始和终止起始和终止,核苷酸水平：核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基突变或交换单位，四种碱基二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式核外核外DNA的种类的种类核外染色体核外染色体真真核核生生物物的的“质质粒粒”原原核核生生物物的质粒的质粒线粒体线粒体细胞质基因细胞质基因叶绿体叶绿体（质体）（质体）中心体中心体动动 体体共生生物：共生生物：卡巴颗粒卡巴颗粒酵母菌的酵母菌的2 m质粒质粒F因子因子R因子因子Col质粒质粒Ti质粒质粒巨大质粒巨大质粒降解性质粒降解性质粒基基因因：能能够够表表达达和和产产生生基基因因产产物物（蛋蛋白白质质或或RNA）的）的DNA序列。序列。原核生物基因系统：原核生物基因系统：启动子（基因）启动子（基因）操纵子操纵子操纵子（基因）操纵子（基因）基因调控系统基因调控系统 结构基因结构基因 调节基因调节基因C ABSummaryA:RNA polymeraseB:lac repressor C:CRP-cAMP细胞水平：细胞水平：大部分或全部大部分或全部DNADNA都集中于细胞核或都集中于细胞核或核质体中，不同种类微生物或同种不同细胞核质体中，不同种类微生物或同种不同细胞中细胞核的数目不同中细胞核的数目不同染色体水平：染色体水平：真核微生物的每个细胞核内含有真核微生物的每个细胞核内含有一定数量的染色体；而原核微生物中一个核一定数量的染色体；而原核微生物中一个核质体就是一个裸露的、光学显微镜下不能看质体就是一个裸露的、光学显微镜下不能看到的环状染色体。到的环状染色体。一些真核生物和原核生物基因组的比较一些真核生物和原核生物基因组的比较生生 物物 单倍体的单倍体的 分子量分子量 核苷酸核苷酸 已知已知 染色体数染色体数 约数（约数（DaDa）对数对数 基因数基因数 人人 3232 3 35 5 10101212 5 57 7 10109 9 40004000 黑腹果蝇黑腹果蝇 4 4 7.9 7.9 10101010 8.0 8.0 10107 7 5000 500060006000粗糙脉孢菌粗糙脉孢菌7 7 2.8 2.8 10101010 4.5 4.5 10107 7 500 500 大肠杆菌大肠杆菌1 1 2.5 2.5 10109 9 3.8 3.8 10106 6 10271027 噬菌体噬菌体T4T41 1 1.1 1.1 10108 8 2.0 2.0 10105 5 135135 噬菌体噬菌体 1 1 3.2 3.2 10107 7 4.8 4.8 10104 4 3535噬菌体噬菌体MS2MS21 1 1.1 1.1 10106 6 3.5 3.5 10103 3 3 3遗遗传传密密码码：指指DNA链链上上各各个个核核苷苷酸酸的的特定排列顺序特定排列顺序密码子（密码子（codencoden）：）：由由3 3个核苷酸顺序决定，负载个核苷酸顺序决定，负载遗传信息的基本单位遗传信息的基本单位不对称转录：不对称转录：只有只有DNADNA双链的一股才作为有意义双链的一股才作为有意义链被转录，这种现象又称不对称转录。链被转录，这种现象又称不对称转录。起始密码子：起始密码子：AUGAUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸终止密码子：终止密码子：UAAUAA、UGAUGA、UAGUAG质粒：质粒：细菌染色体外的遗传物质，由共价闭合环状细菌染色体外的遗传物质，由共价闭合环状双链双链DNADNA分子组成，能独立于细胞核进行自主复制。分子组成，能独立于细胞核进行自主复制。大小：大小：分子量约为分子量约为100 100 10 106 6 D D，携带，携带1 1100100个个基因基因,一个菌细胞可有一至数个质粒。一个菌细胞可有一至数个质粒。质粒的特点：质粒的特点：q可自我复制，稳定遗传。对生存不是必可自我复制，稳定遗传。对生存不是必要的。复制与染色体分开，但同步进行。要的。复制与染色体分开，但同步进行。q不同质粒携带不同遗传信息。不同质粒携带不同遗传信息。q无质粒细菌可通过接合、转化、转导等无质粒细菌可通过接合、转化、转导等方式获得，不能自发产生。方式获得，不能自发产生。例：例：细菌抗药性因子、大肠杆菌的细菌抗药性因子、大肠杆菌的F F因子。因子。质粒质粒应用应用:基因工程，体外重组基因工程，体外重组.三、原核生物的质粒三、原核生物的质粒1.1.特点：特点：可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以掺入染色体上，以附加体（附加体（episomeepisome）的形式存在；的形式存在；质粒是一种质粒是一种复制子（复制子（repliconreplicon），），根据自我复制能力的不同，可把质粒复根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒严紧型质粒的复制受细胞核控制，的复制受细胞核控制，与染色体与染色体DNADNA复制相伴随复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（一般一个寄主细胞内只有少数几个（1 15 5）个拷贝；）个拷贝；松弛型质粒松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体的复制不受细胞核控制，在染色体DNADNA复制停止的情况下仍可以进复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到行复制，在细胞内的数量可以达到1010200200个或更多。个或更多。可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。对于细菌的生存并不是必要的对于细菌的生存并不是必要的功能多样化功能多样化三、原核生物的质粒三、原核生物的质粒2.2.质粒在基因工程中的应用质粒在基因工程中的应用 质粒在基因工程操作中的优点质粒在基因工程操作中的优点 ：1.1.体积小，便于体积小，便于DNADNA的分离和操作；的分离和操作；2.2.呈环状，在化学分离过程中能保持稳定性；呈环状，在化学分离过程中能保持稳定性；3.3.有不受核基因组控制的独立复制起始点；有不受核基因组控制的独立复制起始点；4.4.拷贝数多，使外源拷贝数多，使外源DNADNA可快速扩增；可快速扩增；5.5.存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克隆的检出和选择。隆的检出和选择。E.ColiE.Coli 的的PBR322PBR322质粒质粒E.ColiE.Coli 的的PBR322PBR322质粒的具体优点：质粒的具体优点：1.1.体积小，仅体积小，仅4361bp4361bp；2.2.在宿主在宿主E.coliE.coli中稳定地维持高拷贝数（中稳定地维持高拷贝数（20203030个个/细胞）；细胞）；3.3.氯霉素抑制宿主蛋白质合成，则每个细胞可扩增到含氯霉素抑制宿主蛋白质合成，则每个细胞可扩增到含1000100030003000个质粒；个质粒；4.4.分离极其容易；分离极其容易；5.5.可插入较多的外源可插入较多的外源DNADNA（不超过（不超过10bp10bp）；）；6.6.结构完全清楚，各种核酸内切酶可酶解的位点可任意选用；结构完全清楚，各种核酸内切酶可酶解的位点可任意选用；7.7.有两个选择性抗药标记（氨苄青霉素和四环素）；有两个选择性抗药标记（氨苄青霉素和四环素）；8.8.可方便地通过转化作用导入宿主细胞。可方便地通过转化作用导入宿主细胞。功能：功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。重组：重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。存在范围存在范围：很多细菌如：很多细菌如E.coliE.coli、ShigellaShigella、S.aureusS.aureus、Streptococcus lactisStreptococcus lactis、根癌土壤杆菌等、根癌土壤杆菌等制备：制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除白质等成分、去除RNARNA和蛋白质等步骤。和蛋白质等步骤。鉴定：鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法图谱等方法3.质粒的分离与鉴定质粒的分离与鉴定1.1.细菌的培养和收集细菌的培养和收集 将含有质粒将含有质粒pBSpBS的的DH5DH5菌种接种在菌种接种在LBLB固体培养基固体培养基(含含50g/ml Amp)50g/ml Amp)中中,37,37培养培养12-2412-24小时。用无菌牙签挑小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到取单菌落接种到5ml LB5ml LB液体培养基液体培养基(含含50g/ml Amp)50g/ml Amp)中中,37,37振荡培养约振荡培养约1212小时至对数生长后期。小时至对数生长后期。2.2.溶菌：一般用溶菌酶去壁形成原生质球或原生质体溶菌：一般用溶菌酶去壁形成原生质球或原生质体3.3.碱变性处理：在碱变性处理：在SDSSDS等表面活性剂存在下加等表面活性剂存在下加NaOHNaOH溶液使溶液使pHpH升至升至12.412.4可使菌体蛋白和染色体可使菌体蛋白和染色体DNADNA均不可逆变性而与均不可逆变性而与质粒质粒DNADNA分开。分开。4.4.离心分离：经高速离心可以使细胞碎片和已变性的菌离心分离：经高速离心可以使细胞碎片和已变性的菌体蛋白和染色体体蛋白和染色体DNADNA一道沉淀，上清液主要是质粒一道沉淀，上清液主要是质粒DNADNA，经乙醇沉淀后，可获得质粒经乙醇沉淀后，可获得质粒DNADNA。1.1.1.1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 DNADNADNADNA电泳速率排列：超螺旋、共价、闭合环电泳速率排列：超螺旋、共价、闭合环电泳速率排列：超螺旋、共价、闭合环电泳速率排列：超螺旋、共价、闭合环状状状状DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)缺刻环状缺刻环状缺刻环状缺刻环状DNA(ocDNA)DNA(ocDNA)DNA(ocDNA)DNA(ocDNA)线性线性线性线性DNA(LDNA)DNA(LDNA)DNA(LDNA)DNA(LDNA)2.2.2.2.氯化铯氯化铯氯化铯氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心溴化乙锭密度梯度离心溴化乙锭密度梯度离心溴化乙锭密度梯度离心3.3.3.3.电镜观察电镜观察电镜观察电镜观察4.质粒的种类：质粒的种类：种类种类 代表菌代表菌1.1.接合性质粒接合性质粒E.ColiE.Coli的的F F质粒；质粒；PseudomonasPseudomonas（假单胞菌属）（假单胞菌属）的的pfdmpfdm和和K K质粒；质粒；Vibrio choleraeVibrio cholerae（霍乱弧（霍乱弧菌）的菌）的P P质粒；质粒；StreptomycesStreptomyces（链霉菌属）的（链霉菌属）的SCPSCP质粒质粒2.2.抗药性质粒：抗抗生素，抗抗药性质粒：抗抗生素，抗重金属等离子重金属等离子肠道细菌和肠道细菌和StaphylococcusStaphylococcus（葡萄球菌属）（葡萄球菌属）的的R R质粒质粒3.3.产细菌素和抗生素质粒产细菌素和抗生素质粒肠道细菌；肠道细菌；ClostridiumClostridium（梭菌属）；（梭菌属）；StreptomycesStreptomyces4.4.具生理功能的质粒具生理功能的质粒利用乳糖、蔗糖、尿素、固氮利用乳糖、蔗糖、尿素、固氮降解辛烷、樟脑、萘、水杨酸降解辛烷、樟脑、萘、水杨酸产生色素产生色素结瘤和共生固氮结瘤和共生固氮 肠道细菌肠道细菌 PseudomonasPseudomonasErwiniaErwinia（欧文氏菌），（欧文氏菌），Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus Rhizobium Rhizobium（根瘤菌属）（根瘤菌属）5.5.产毒质粒产毒质粒E.Coli E.Coli，Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus几种代表性质粒：几种代表性质粒：1.F1.F因子（因子（fertility factorfertility factor）：）：又称致育因又称致育因子或性因子，是子或性因子，是E.coliE.coli等细菌决定性别并有转等细菌决定性别并有转移能力的质粒，移能力的质粒，626210106 6DaDa，94.5kb94.5kb，相当于核，相当于核染色体染色体DNA2%DNA2%的环状双链的环状双链DNADNA，足以编码，足以编码9494个中个中等大小多肽，其中等大小多肽，其中1/31/3基因（基因（tratra区）与接合作区）与接合作用有关。用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。Figure.Representative FERTILITY PLASMID.A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes.In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.F F质粒的遗传结构质粒的遗传结构又称致育因子或性因又称致育因子或性因子，是子，是E.coliE.coli等细菌决等细菌决定性别并有转移能力的定性别并有转移能力的质粒，质粒，6262106Da106Da，99.15kb99.15kb，相当于核染，相当于核染色体色体DNA2%DNA2%的环状双链的环状双链DNADNA，足以编码，足以编码9494个中个中等大小多肽，其中等大小多肽，其中1/31/3基因（基因（tratra区）与接合区）与接合作用有关。作用有关。（1 1）转移区）转移区（3 3）插入区）插入区（2 2）复制区）复制区F 因子(F-factor)转转 重重 移移 IS3 组组 IS3 区区 区区 O IS2 P OriT OriV 复复 区区 制制 最初发现于痢疾志贺氏菌（最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后），后来发现还存在于来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和和Staphylococcus中。中。R因子由相连的两个因子由相连的两个DNA片段组成，即片段组成，即抗性转移因子抗性转移因子（resistence transfor factor，RTF）和）和抗性决定抗性决定R因子因子（r-determinant），），RTF为分子量约为为分子量约为11106Dalton，控制质，控制质粒粒copy数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到100106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。R-因子在细胞内的因子在细胞内的copy数可从数可从12个到几十个，分为严个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个个/细胞。细胞。2.R因子（因子（resistence factor）RTFRTF（含转移和复制基因）（含转移和复制基因）+IS R R质粒质粒 r r决定因子决定因子 （含抗药性基因）（含抗药性基因）产大肠杆菌素因子。产大肠杆菌素因子。n大肠杆菌素是由大肠杆菌素是由E.coliE.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约量约4 410104 48 810104 4DaltonDalton。大肠杆菌素都是由。大肠杆菌素都是由ColCol因子编码的。因子编码的。nColCol因子可分为两类，分别以因子可分为两类，分别以ColE1ColE1和和ColIbColIb为代表。为代表。nColE1ColE1分子量约为分子量约为5 5106Dalton106Dalton，无接合作用，是多，无接合作用，是多copycopy的；的；ColE1ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组研究得很多，并被广泛地用于重组DNA DNA 的研究和用于体外复的研究和用于体外复制系统上。制系统上。nColIbColIb分子量约为分子量约为8080106Dalton106Dalton，它与，它与F F因子相似，具有通过接合因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有作用转移的功能，属于严紧型控制，只有1212个个copycopy。n凡带凡带ColCol因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。3.Col3.Col因子因子（colicinogenic factorcolicinogenic factor）即诱癌质粒。即诱癌质粒。存在于根癌土壤杆菌（存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium Agrobacterium tumefacienstumefaciens）中）中,可引起许多双子叶植物的根癌。可引起许多双子叶植物的根癌。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的的DNADNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的TiTi质粒质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。TiTi质粒长质粒长200kb200kb，是一个大型质粒。当前，是一个大型质粒。当前，TiTi质粒已质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借状的外源基因可借DNADNA重组技术设法插入到重组技术设法插入到TiTi质粒中，并质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。性，达到培育植物优良品种的目的。5.Ti质粒（质粒（tumor inducing plasmid）4.Ri4.Ri质粒质粒 与与TiTi质粒相似，存在于发根土壤杆菌或质粒相似，存在于发根土壤杆菌或发根农杆菌，其侵染双子叶植物时，可诱发发根农杆菌，其侵染双子叶植物时，可诱发大量称为毛状根的不定根。其中大量称为毛状根的不定根。其中RiRi质粒中的质粒中的一段一段T-DNAT-DNA整合到宿主根部细胞核基因组中，整合到宿主根部细胞核基因组中，使之发生转化，并在宿主细胞内稳定遗传。使之发生转化，并在宿主细胞内稳定遗传。是近年来在是近年来在RhizobiumRhizobium（根瘤菌属）中发现的（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为一种质粒，分子量为20020030030010106 6DaltonDalton，比，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。其上有一系列固氮基因。6.6.巨大质粒（巨大质粒（mega质粒）质粒）v降解性质粒降解性质粒 只在假单胞菌属中发现。它们的降解性只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解有分解CAMCAM（樟脑）质粒，（樟脑）质粒，XYLXYL（二甲苯）质（二甲苯）质粒，粒，SALSAL（水杨酸）质粒，（水杨酸）质粒，MDLMDL（扁桃酸）质（扁桃酸）质粒，粒，NAPNAP（奈）质粒和（奈）质粒和TOLTOL（甲苯）质粒等。（甲苯）质粒等。7.7.降解性质粒降解性质粒第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种突变（突变（突变（突变（mutation mutation mutation mutation）：）：）：）：指细胞内遗传物质的分子结构或数量突指细胞内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。然发生的可遗传的变化。染色体畸变染色体畸变细胞学上可以看到染色体的变化细胞学上可以看到染色体的变化突变突变 基因突变基因突变细胞学上看不到遗传物质的变化细胞学上看不到遗传物质的变化突变体（突变体（mutantmutant）：）：发生了突变的微生物细胞或菌株发生了突变的微生物细胞或菌株野生型（野生型（wild typewild type）：）：从自然界分离到的任何微生物在其发从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株生突变前的原始菌株依表型的改变分为：依表型的改变分为：1.营养缺陷型营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。2.抗性突变型抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或