第十三章高效液相色谱法..ppt

第十三章第十三章 高效液相色谱法高效液相色谱法1.1.溶剂强度和选择性，混合溶剂强度参数的计算溶剂强度和选择性，混合溶剂强度参数的计算（了解）了解）2.高效液相色谱仪的部件；紫外检测器和荧光检测器的检测原理和适用范围。（熟悉）2.高效液相色谱固定相的选择，分离条件，与液相色谱气相色谱的区别。（掌握）第八章第八章 高效液相色谱法高效液相色谱法 反相键合相色谱法保留行为的主要影响因素和分离条件选择；化学键合相的性质、特点和种类及使用注意事项；流动相对色谱分离的影响；HPLC中的速率理论及其对选择实验条件的指导作用；定量分析方法。（掌握）高效液相色谱法：一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。高压：150-350*105Pa高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g（紫外检测）、10-12g（荧光检测）第十三章第十三章第十三章第十三章 高效液相色谱分析法（高效液相色谱分析法（高效液相色谱分析法（高效液相色谱分析法（HPLCHPLC）经典液相色谱法与高效液相色谱法的比较经典液相色谱法高效液相色谱法常压或减压填料颗粒大柱效低分析速度慢色谱柱只用一次不能在线检测高压，4050MPa填料颗粒小，250m柱效高,4000060000块/m分析速度快色谱柱可重复多次使用能在线检测气相色谱与高效液相色谱的比较 气相色谱高效液相色谱不能用于热不稳定性物质的分析高温（程序升温）有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用检测器（FID和TCD）流动相为气体，无毒运行和操作容易可以用于热不稳定物质的分析室温没有较高灵敏的通用检测器流动相有毒，可供选择范围宽（梯度洗脱）运行和操作比GC难一些特点：具有分离效率高选择性好分析速度快检测灵敏度高应用范围广流动相选择范围宽柱后流出组分不被破坏，易制备第一节高效液相色谱仪HPLCHPLC仪器结构示意图（方框图）仪器结构示意图（方框图）仪器结构示意图（方框图）仪器结构示意图（方框图）流程（1）高压输液泵）高压输液泵输液泵应具备的性能：输液泵应具备的性能：流量精度高且稳定流量精度高且稳定 流量范围宽流量范围宽 能在高压下连续工作能在高压下连续工作 液缸容积小液缸容积小 密封性能好，耐腐蚀密封性能好，耐腐蚀 恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式有串联式和并联式输液泵操作注意事项：输液泵操作注意事项：防止固体微粒进入泵体防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气流动相一般应该先脱气 梯度淋洗（洗提、洗脱）梯度淋洗（洗提、洗脱）分离过程中按一定程序连续改变载液中溶剂即流动相分离过程中按一定程序连续改变载液中溶剂即流动相的配比和极性以提高分离效果（类似的配比和极性以提高分离效果（类似GC中的程序升温）中的程序升温）高压梯度和低压梯度高压梯度和低压梯度高压梯度低压梯度二、分离和进样二、分离和进样系统系统 进样器进样阀（六通阀）、自动进样装置色谱柱色谱柱分析柱、制备柱分析柱、制备柱 性能评价性能评价：H、n、fs、k和和的重复性，或的重复性，或R。柱效评价柱效评价1.1.硅胶柱：硅胶柱：样品：苯、萘、联苯及菲（己烷配制）流动相：无水己烷2.反相反相色谱柱：色谱柱：样品：尿嘧啶、硝基苯、萘及芴流动相：甲醇-水（85：15）或乙腈-水（60：40）3.正相正相色谱柱：色谱柱：样品：四氯乙烯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇流动相：正庚烷 色谱柱再生色谱柱再生1.反相色谱柱：先以甲醇-水（95：5）、甲醇、一氯甲烷为流动相依次冲洗，再以相反顺序依次洗脱。2.正相色谱柱：先以正己烷、异丙醇、一氯甲烷及甲醇为流动相依次冲洗，再以相反顺序依次洗脱。三、检测系统三、检测系统（一）检测器（一）检测器(detector)的主要性能的主要性能要求：要求：灵敏度高（检测限低）噪音低线性范围宽重复性好适用范围广（通用型、专属型）（二）紫外检测器（二）紫外检测器检测原理：朗伯比尔(Lambert-Beer)定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=Cl特点：灵敏度较高（10-610-9g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。紫外检测器紫外检测器固定波长检测器：254nm可变波长检测器：光源：氘灯（和钨灯），200400（800）nm，单色器，流通池（试样），光电管光路系统和紫外分光光度计相似光电二极管阵列检测器(photodiodearraydetector；PDAD)：一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光紫外检测器紫外检测器光电二极管阵列检测器工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维光谱色谱图。用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量,判断峰纯度。（三）荧光检测器（三）荧光检测器(FD)检测原理：化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称为荧光荧光强度(F)与激发光强度(I0)及荧光物质浓度(C)之间的关系为：F=2.3QKI0ClQ为量子产率，K为荧光效率，为摩尔吸光系数，l为光径长度。F=KC特点：选择性好，专属型检测器灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10g/ml）激发波长(ex)和发射波长(em)的选择 一、主要类型一、主要类型 1.固定相的聚集状态固定相的聚集状态 液液色谱法（液液色谱法（LLC）和液固色谱法（）和液固色谱法（LSC）2.分离机制：分离机制：分配色谱法分配色谱法 吸附色谱法吸附色谱法 离子交换色谱法离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（空间排阻色谱法（SEC）3.其他色谱类型其他色谱类型亲合色谱法（亲合色谱法（AC）手性色谱法（手性色谱法（CC）胶束色谱法（胶束色谱法（MC）电色谱法（电色谱法（EC）化学键合相色谱法化学键合相色谱法第二节第二节高效液相色谱法的高效液相色谱法的固定相和流动相固定相和流动相 固定相应符合下列要求：固定相应符合下列要求：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。一、液一、液-固吸附色谱固定相固吸附色谱固定相1.硅胶表孔硅胶（薄壳玻珠）（YBK）无定形全多孔硅胶(YWG)球形全多孔硅胶(YQG)堆积硅胶(YQG)2.高分子多孔微球或称有机胶 二、液二、液-液分配色液分配色谱固定相谱固定相化学键合相色谱法的固定相化学键合相色谱法的固定相 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法（BPC）化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所 形成的固定相 （二）键合相的性质和特点（二）键合相的性质和特点 1.键合反应硅氧烷（SiOSiC）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC 化学键合相形成具备的条件化学键合相形成具备的条件 2.固定液应有与载体表面发生化学反应的官能团1.载体表面应有某种活性基团2.键合相的种类（1）非极性键合相非极性键合相：非极性烃基，如C18C8C1与苯基等键合在硅胶表面；用于反相色谱；ODS（2）极性键合相：极性键合相：常用-NH2、-CN键合相（氰乙硅烷基Si(CH2)2CN)键合硅胶一般用于正相色谱（3）离子交换键合相：离子交换键合相：常用-SO3H、-COOH、-R3NCl3.键合相的特点使用过程中不流失；化学稳定性好；柱效高，分离选择性好；适于梯度洗脱；载样量大注意：流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH范围的键合相)二、化学键合相色谱法的流动相二、化学键合相色谱法的流动相 对流动相的要求：1.与固定相不发生化学反应。2.对试样有适宜的溶解度。使k在110范围内，3.与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。4.纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈等可以降低柱压，提高柱效。1、液固吸附色谱流动相、液固吸附色谱流动相的选择的选择选择原则是待测样品的极性和洗脱剂的极性一致，即分离极性大的试样选用极性强的洗脱剂；分离极性弱的试样选用极性弱的洗脱剂。1.溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强2.溶剂的选择性不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同混合溶剂（二元或多元流动相）（二）液液分配色谱法流动相的选择性二）液液分配色谱法流动相的选择性溶剂的选择性溶剂的选择性 溶溶剂剂和和样样品品分分子子间间的的作作用用力力用用接接受受质质子子的的能能力力xe、给给予予质质子子的的能能力力xd和和静静电电力力xn(由由偶偶极极矩矩决决定定)三三种种参参数数来来表表征征，并并以以xe、xd和和xn构成一个三角坐标图构成一个三角坐标图。溶溶剂剂可可分分为为八八组组而而分分别别位位于于图图中中不不同同区区。I组组的的xe值值较较大大，属属质质子子受受体体溶溶剂剂；VII组组的的xd值值较较大大，属属质质子子给给于于体体溶溶剂剂；V组组的的xn值值较较大大，属属偶偶极极作作用用力力溶溶剂剂。同同组组溶溶剂剂在在分分离离中中具具有有相相似似的的选选择性，不同组差别较大。择性，不同组差别较大。溶剂的选择性溶剂的选择性多元混合溶剂的溶剂极性参数计算多元混合溶剂的溶剂极性参数计算 式中式中i 为混合溶剂中各溶剂的体积百分数。为混合溶剂中各溶剂的体积百分数。二元混合溶剂的则为二元混合溶剂的则为 式中式中A，B分别为二元混合溶剂中溶剂分别为二元混合溶剂中溶剂A和溶剂和溶剂B的体积百分数。的体积百分数。多元混合溶剂的溶剂极性参数计算多元混合溶剂的溶剂极性参数计算 对对于于正正相相色色谱谱，二二元元溶溶剂剂的的极极性性参参数数P 和和组组分分的的k值值存存在在如如下下关系：关系：式式中中分分别别为为初初始始和和调调节节后后二二元元溶溶剂剂的的极极性性参参数数。k1、k2为为组组分分相应的容量因子。相应的容量因子。例例 在在一一反反相相色色谱谱柱柱上上，当当流流动动相相为为30%甲甲醇醇和和70%水水(体体积积比比)时时，某某组组分分的的保保留留时时间间为为25.6min，死死时时间间为为0.35min，如何调节溶剂配比使组分容量因子为，如何调节溶剂配比使组分容量因子为5？解：初始值解：初始值 =0.75 即即调调整整溶溶剂剂比比例例为为75%甲甲醇醇和和25%水水可可使使该该组组分分的的k值为值为5。固定相固定相：极性键合相 如CN、NH2或二羟基键合硅胶流动相流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物 分离机制？分离机制？分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用一、正相键合相色谱法一、正相键合相色谱法 组分的保留和分离组分的保留和分离 分离选择性决定于键合相的种类、流动相分离选择性决定于键合相的种类、流动相的强度和试样的性质的强度和试样的性质 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，减小，tR 减小。反之，减小。反之，k增大，增大，tR增大。增大。极性强的组分极性强的组分k大，后洗脱出柱。大，后洗脱出柱。（二）反相键合相色谱法（二）反相键合相色谱法1.固定相：非极性键合相固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（）、辛烷基（C8）键合硅胶键合硅胶 流动相：流动相：水水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂 常用甲醇水、乙腈水等常用甲醇水、乙腈水等应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等 2.保留机制：疏溶剂理论保留机制：疏溶剂理论溶质的保留主要是溶质分子与溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的极性溶剂分子间的排斥力排斥力，促，促使溶质分子与键合相的烃基发使溶质分子与键合相的烃基发生生疏水缔合疏水缔合。不是溶质分子与。不是溶质分子与键合相间的色散力。键合相间的色散力。3.保留行为的主要影响因素保留行为的主要影响因素 （1）溶质的分子结构（极性）极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。同系物碳数越多，极性越弱，k越大；引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。（2）固定相键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。（3）流动相）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大越大 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加，使溶剂比例：水的比例增加，使k增大增大 中性盐的加入：使中性溶质的中性盐的加入：使中性溶质的k增大增大 pH：影响弱酸、弱减的离解：影响弱酸、弱减的离解 流动相的流动相的pH降低，弱酸降低，弱酸k增大，增大，tR增大；弱碱增大；弱碱k变小。变小。第三节第三节 影响色谱峰扩展的因素及分离操作条件的选择影响色谱峰扩展的因素及分离操作条件的选择 涡流扩散A=2dp球形、小粒度、均匀（RSD5%）固定相，匀浆高压填充，以降低A。纵向扩散=2Dm可以忽略。因为Dl很小，室温操作，且U大于U最佳，传质阻抗：固定相传质阻抗CS可以忽略，因df极小流动相传质阻抗Cm要求：dp小，Dm大（一）柱内展宽及分离条件的选择（一）柱内展宽及分离条件的选择1.影响柱内展宽的因素影响柱内展宽的因素静态流动相传质阻抗：由于部分流动相在固定相微孔内的滞留静态流动相传质阻抗系数CsmCsmdp2，Csm1/Dm，而DmT/要求:固定相dp2、流动相都小H=A+Cmu+Csmu=A+CuHPLC的实验条件应该是：小粒度、均匀的球形化学键合相；低粘度流动相，流速不宜过快；柱温适当。（二）分离条件的选择（二）分离条件的选择 1.固定相的选择2.流动相的选择：黏度低的选择3.流速的选择4.柱温的选择柱温的选择：室温：室温二、柱外展宽二、柱外展宽 柱外因素：柱前峰展宽和柱后峰展宽。柱前峰展宽：由进样及进样器到色谱柱连接管引起的（柱头直接进样，色谱峰的不对称性和柱效有明显改善）。柱后峰展宽：柱后连接管和检测器死体积；通用紫外检测器的池体积仅为8L。第四节第四节 HPLC 应用与示例应用与示例 定性分析方法定性分析方法定量分析方法：定量分析方法：外标法、内标法外标法、内标法同同GC（自己看）（自己看）二、二、分离类型选择分离类型选择分析实例：分析实例：环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。固定相：薄壳型硅胶(3750m)流动相：正己烷流速：1.5mL/min色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：示差折光检测器 稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min流速：1mL/min柱温：50C柱压：70104Pa检测器：紫外检测器血浆分析血浆分析1.计算在某色谱条件下，分析只含有二氯乙烷，二溴乙烷及四乙基铅三组分的样品，结果如下：二氯乙烷二溴乙烷四乙基铅相对质量校正因子1.001.651.75峰面积cm21.501.012.82(1)试求各组分的百分含量。上述色谱分析采用了何种定量方法?该定量方法有何优点和局限性?2.已知物质A和B在一根30.00cm长的柱上的保留时间分别为16.40min和17.63min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30min。峰底宽度分别为1.11min和1.21min，计算：（1）柱的分离度；（2）柱的平均塔板数（3）达到1.5分离度所需的柱长度。（1分）1HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为2液相色谱定量分析时，要求混合物中每一个组分都出峰的是（C）。3在分配色谱法与化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是A柱前压力高B流速比GC的快C流动相黏度较小D柱温低A外标标准曲线法B内标法C面积归一化法D外标法（C）。A提高分配系数比B容量因子增大C保留时间增长D色谱柱柱效提高（A ）。（D）。4在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离A异构体B沸点相近，官能团相同的化合物C沸点相差大的试样D极性变化范围宽的试样5在高效液相色谱中，采用254nm紫外控制器，下述溶剂的使用极限为A甲醇210nmB乙酸乙醋260nmC丙酮330nm（A ）6当用硅胶为基质的填料作固定相时，流动相的pH范围应为A在中性区域B5一8C1一14D2一8（D）。8在正相色谱中，若适当增大流动相极性则A样品的k降低，tR降低B样品的k增加，tR增加C相邻组分的增加D对基本无影响7在液相色谱中，提高色谱柱柱效的最有效途径是在液相色谱中，提高色谱柱柱效的最有效途径是 A减小填料粒度B适当升高柱温C降低流动相的流速D增大流动相的流速（A ）（A ）9用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇一水为流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好的办法是A增加流动相中甲醇的比例B增加流动相中的水的比例C流动相中加人少量HAcD流动相中加人少量的氨水（B）10如果样品比较复杂，相邻两峰间距离太近或操作条件不易控制稳定，要准确测量保留值有一定困难时，可选择以下方法A利用相对保留值定性B加人已知物增加峰高的办法定性C利用文献保留值数据定性D与化学方法配合进行定性11液相色谱中通用型检测器是A紫外吸收检测器B示差折光检测器C热导池检测器D荧光检测器（B ）（C ）12高压、高效、高速是现代液相色谱的特点，采用高压主要是由于A可加快流速，缩短分析时间B高压可使分离效率显著提高C采用了细粒度固定相所致D采用了填充毛细管柱（C ）。13在液相色谱中，提高色谱柱柱效的最有效途径是A减小填料粒度B适当升高柱温C降低流动相的流速D增大流动相的流速（A）14液相色谱的H一u曲线A与气相色谱的一样，存在着HminBH随流动相的流速增加而下降CH随流动相的流速增加而上升DH受u影响很小（C ）15与气相色谱相比，在液相色谱中A分子扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成B涡流扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成C传质阻力项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成D速率方程式同样由三项构成，两者相同（A ）16在液相色谱中，下列检测器可在获得色谱流出曲线的基础上，同时获得被分离组分的三维彩色图形的是A光电二极管阵列检测器B示差折光检测器C荧光检测器D电化学检测器（A）17.在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是A分子筛B硅胶C氧化铝D活性炭（B ）18键合相的键合基团的碳链长度增长后A极性减小B极性增大C载样量增大D载样量减小19.水在下述色谱中，洗脱能力最弱（作为底剂）的是A正相色谱法B反相色谱法C吸附色谱法D空间排斥色谱法（A ）（B ）20在下列方法中，组分的纵向扩散可忽略不计的是A毛细管气相色谱法B高效液相色谱法C气相色谱法D超临界色谱法（B ）。1高效液相色谱仪一般可分为 、和 等部分。填空题2常用的高效液相色谱检测器主要是常用的高效液相色谱检测器主要是 、和和 检测器等。检测器等。3高效液相色谱中的技术类似于气相色谱中的程序升温，不过前者连续改变的是流动相的，而不是温度。高压输液系统、进样系统、分离系统、检测器、显示系统紫外、示差折光、荧光、电导、电化学梯度洗脱、组成与极性 4在液液分配色谱中，对于亲水固定液采用流动相，即流动相的极性_固定相的极性称为正相分配色谱。5正相分配色谱适用于分离化合物、极性的先流出、极性的后流出。疏水性；小于 极性；小；大 6高效液相色谱的发展趋势是减小和以提高柱效。填料粒度；柱径 7在液相色谱中，为改善分离度并调整出峰时间，可通过改变流动相和_的方法达到。8在液相色谱中，速率理论方程中的项很小，可忽略不计，vanDeemter方程式可写成。9通过化学反应，将键合到表面，此固定相称为化学键合固定相。组成、极性 分子扩散、H A Cu固定液、载体 10液相色谱流动相应使用黏度溶剂，可减小溶质的，有利于提高柱效。11以ODS键合固定相，甲醇一为流动相时，该色谱条件为色谱。12在正相色谱中，极性的组分先出峰，极性的组分后出峰。小；大水；反相键合低、传质阻力1液一液色谱流动相与被分离物质相互作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。2利用离子交换剂作固定相的色谱法称为离子交换色谱法。3紫外吸收检测器是离子交换色谱法通用型检测器。4检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。5色谱归一化法只能适用于检测器对所有组分均有响应的情况。6高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。7高效液相色谱中通常采用调节分离温度和流动相流速来改善分离效果。8离子交换键合固定相具有机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。（）（）（）（）（）（）（）（）9在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。10正相分配色谱的流动相极性大于固定相极性。11反相分配色谱适于非极性化合物的分离。12高效液相色谱法采用梯度洗脱，是为了改变被测组分的保留值，提高分离度。13在液一液色谱中，为改善分离效果，可采用梯度洗脱。14化学键合固定相具有良好的热稳定性，不易吸水，不易流失，可用 梯度洗脱。15液相色谱的流动相又称为淋洗液，改变淋洗液的组成、极性可显著改 变组分分离效果。16液相色谱指的是流动相是液体，固定相也是液体的色谱。（）（）（）（）（）（）（）（）17液相色谱的H一u曲线与气相色谱的H一u一样，流速都存在一个最低点。18液相色谱的中引起色谱扩展的主要原因是分子扩散项。19正相键合色谱的固定相为非（弱）极性固定相，反相色谱的固定相为极性固定相。（）（）（）2何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？1在液相色谱中,提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么?答：液相色谱中提高柱效的途径主要有：（1）提高柱内填料装填的均匀性；（2）改进固定相：（3）粒度;选择薄壳形担体;选用低粘度的流动相;（4）适当提高柱温其中，减小粒度是最有效的途径。答：化学键合固定相是利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面形成的固定相。使用过程中不流失；化学稳定性好；柱效高，分离选择性好；适于梯度洗脱；载样量大3何谓梯度洗脱？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？答：梯度洗脱是在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成或浓度配比，是改进液相色谱分离的重要手段。梯度洗脱与气相色谱中的程序升温类似，但是前者连续改变的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度。程序升温也是改进气相色谱分离的重要手段。