中药提取成分对于肿瘤细胞生长的影响分析40016.pptx

大连理工大学 环境与生命学院实验十一实验十一 中药提取成分对于肿瘤细中药提取成分对于肿瘤细胞生长的影响分析胞生长的影响分析 指导教师：唐颖指导教师：唐颖大连理工大学 环境与生命学院1.1.实验目的实验目的此此综综合合性性实实验验是是通通过过细细胞胞传传代代、绘绘制制细细胞胞生生长长曲曲线线等等基基础础实实验验来来初初步步检检验验中中药药中中的的某活性成分的抗肿瘤活性。某活性成分的抗肿瘤活性。大连理工大学 环境与生命学院2.2.实验原理实验原理 MTTMTTMTTMTT比比比比色色色色法法法法的的的的主主主主要要要要原原原原理理理理是是是是；MTTMTTMTTMTT被被被被活活活活细细细细胞胞胞胞中中中中线线线线粒粒粒粒体体体体琥琥琥琥珀珀珀珀酸酸酸酸脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶还还还还原原原原后后后后，生生生生成成成成暗暗暗暗蓝蓝蓝蓝色色色色甲甲甲甲躜躜躜躜，甲甲甲甲躜躜躜躜被被被被助助助助溶溶溶溶剂剂剂剂溶溶溶溶解解解解后后后后，可可可可在在在在酶酶酶酶标标标标仪仪仪仪上上上上读读读读取取取取光光光光吸吸吸吸收收收收值值值值(OD)(OD)(OD)(OD)，在在在在一一一一定定定定范范范范围围围围内内内内光光光光吸吸吸吸收收收收值值值值(OD)(OD)(OD)(OD)与与与与活活活活细细细细胞胞胞胞数数数数量量量量呈呈呈呈线线线线性性性性关关关关系系系系。所所所所以以以以可可可可以以以以通通通通过过过过测测测测量量量量ODODODOD值值值值，间接测量活细胞数量。间接测量活细胞数量。间接测量活细胞数量。间接测量活细胞数量。其其其其他他他他见见见见细细细细胞胞胞胞的的的的传传传传代代代代培培培培养养养养、细细细细胞胞胞胞的的的的生生生生长长长长曲曲曲曲线线线线的的的的绘绘绘绘制制制制等等等等实实实实验验验验内内内内容容容容大连理工大学 环境与生命学院3.3.实验材料、用品实验材料、用品 实实实实验验验验材材材材料料料料：HelaHelaHelaHela细细细细胞胞胞胞，HL-60HL-60HL-60HL-60细细细细胞胞胞胞等等等等多多多多种种种种肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤细细细细胞胞胞胞及及及及原原原原代代代代培培培培养养养养的的的的正常细胞。正常细胞。正常细胞。正常细胞。实验用品：实验用品：实验用品：实验用品：试剂：试剂：试剂：试剂：不同浓度梯度的重要某活性成分溶液。不同浓度梯度的重要某活性成分溶液。不同浓度梯度的重要某活性成分溶液。不同浓度梯度的重要某活性成分溶液。MTTMTTMTTMTT（四甲基偶氮（四甲基偶氮（四甲基偶氮（四甲基偶氮唑盐，唑盐，唑盐，唑盐，5 mg/ml5 mg/ml5 mg/ml5 mg/ml溶于溶于溶于溶于PBSPBSPBSPBS），），），），SDSSDSSDSSDS脱色液：脱色液：脱色液：脱色液：0.01 mol/L HCl0.01 mol/L HCl0.01 mol/L HCl0.01 mol/L HCl，10%SDS10%SDS10%SDS10%SDS或或或或DTWDTWDTWDTW脱色液：脱色液：脱色液：脱色液：1 1 1 1份份份份Triton X100Triton X100Triton X100Triton X100溶于溶于溶于溶于3 3 3 3份份份份DMFDMFDMFDMF（N,N-N,N-N,N-N,N-二二二二甲基甲酰胺）中，摇匀，然后加甲基甲酰胺）中，摇匀，然后加甲基甲酰胺）中，摇匀，然后加甲基甲酰胺）中，摇匀，然后加2 2 2 2份去离子水，加柠檬酸至终浓份去离子水，加柠檬酸至终浓份去离子水，加柠檬酸至终浓份去离子水，加柠檬酸至终浓度度度度0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L，调，调，调，调pHpHpHpH至至至至5 5 5 56 6 6 6。其他：其他：其他：其他：见细胞的传代培养、细胞的生长曲线的绘制等实验内容。见细胞的传代培养、细胞的生长曲线的绘制等实验内容。见细胞的传代培养、细胞的生长曲线的绘制等实验内容。见细胞的传代培养、细胞的生长曲线的绘制等实验内容。大连理工大学 环境与生命学院4.4.4.4.实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤 中药活性成分的分离、提取剂鉴定；中药活性成分的分离、提取剂鉴定；中药活性成分的分离、提取剂鉴定；中药活性成分的分离、提取剂鉴定；细胞的传代培养。细胞的传代培养。细胞的传代培养。细胞的传代培养。检测不同浓度梯度的重要活性成分对肿瘤细胞及正常细胞的生长曲线的影检测不同浓度梯度的重要活性成分对肿瘤细胞及正常细胞的生长曲线的影检测不同浓度梯度的重要活性成分对肿瘤细胞及正常细胞的生长曲线的影检测不同浓度梯度的重要活性成分对肿瘤细胞及正常细胞的生长曲线的影响（与未加药物组作对照）。响（与未加药物组作对照）。响（与未加药物组作对照）。响（与未加药物组作对照）。方法：方法：方法：方法：MTTMTTMTTMTT法绘制生长曲线。法绘制生长曲线。法绘制生长曲线。法绘制生长曲线。a a a a 制制制制备备备备1 1 1 1 mlmlmlml细细细细胞胞胞胞悬悬悬悬液液液液。空空空空白白白白对对对对照照照照以以以以1 1 1 1 mlmlmlml培培培培养养养养基基基基代代代代替替替替细细细细胞胞胞胞悬悬悬悬液液液液。加加加加入入入入0.1 0.1 0.1 0.1 ml ml ml ml MTT MTT MTT MTT 于于于于37373737孵育孵育孵育孵育4 h4 h4 h4 h，使，使，使，使MTTMTTMTTMTT还原为蓝紫色甲脯结晶。还原为蓝紫色甲脯结晶。还原为蓝紫色甲脯结晶。还原为蓝紫色甲脯结晶。b b b b 加加加加1 1 1 1 ml ml ml ml DTWDTWDTWDTW脱脱脱脱色色色色液液液液，37373737至至至至少少少少静静静静置置置置30min30min30min30min（甚甚甚甚至至至至过过过过夜夜夜夜），使使使使甲甲甲甲脯脯脯脯颗颗颗颗粒粒粒粒充充充充分溶解。分溶解。分溶解。分溶解。c c c c 吸吸吸吸取取取取200l200l200l200l该该该该溶溶溶溶解解解解液液液液至至至至96969696孔孔孔孔板板板板孔孔孔孔中中中中，在在在在酶酶酶酶标标标标仪仪仪仪上上上上读读读读取取取取ODODODOD值值值值，检检检检测测测测波波波波长长长长570nm570nm570nm570nm，参考波长，参考波长，参考波长，参考波长630nm630nm630nm630nm。d d d d 每隔每隔每隔每隔24h24h24h24h测量一个点，每个点为测量一个点，每个点为测量一个点，每个点为测量一个点，每个点为3 3 3 3个平行样品的平均值。个平行样品的平均值。个平行样品的平均值。个平行样品的平均值。大连理工大学 环境与生命学院5.5.注意事项注意事项 每一样本组实验应重复三次。每一样本组实验应重复三次。每一样本组实验应重复三次。每一样本组实验应重复三次。MTTMTTMTTMTT法法法法的的的的原原原原理理理理是是是是测测测测定定定定细细细细胞胞胞胞线线线线粒粒粒粒体体体体琥琥琥琥珀珀珀珀酸酸酸酸脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶的的的的活活活活性性性性。此此此此法法法法从从从从根根根根本本本本上上上上看看看看是是是是反反反反映映映映细细细细胞胞胞胞的的的的代代代代谢谢谢谢和和和和增增增增殖殖殖殖活活活活力力力力，而而而而非非非非细细细细胞胞胞胞数数数数量量量量。如如如如果果果果想想想想用用用用MTTMTTMTTMTT法法法法间间间间接接接接测测测测量量量量细细细细胞胞胞胞数数数数量量量量，必必必必须须须须先先先先用用用用MTTMTTMTTMTT法法法法作作作作出出出出细细细细胞胞胞胞数数数数量量量量和和和和ODODODOD值值值值相相相相互互互互关关关关系系系系的的的的趋趋趋趋势势势势线线线线，在在在在线线线线性性性性相相相相关关关关的的的的范范范范围围围围内内内内可可可可间间间间接接接接测测测测量量量量细细细细胞胞胞胞数数数数量量量量。在在在在需需需需要要要要确确确确知知知知细细细细胞胞胞胞数数数数量的场合不宜用量的场合不宜用量的场合不宜用量的场合不宜用MTTMTTMTTMTT法。法。法。法。可可可可结结结结合合合合科科科科研研研研，将将将将课课课课题题题题组组组组项项项项目目目目中中中中研研研研究究究究的的的的一一一一些些些些抑抑抑抑癌癌癌癌活活活活性性性性物物物物质质质质作作作作为为为为研研研研究究究究对对对对象象象象进行分析。浓度根据研究对象的不同，通过预实验来设定。进行分析。浓度根据研究对象的不同，通过预实验来设定。进行分析。浓度根据研究对象的不同，通过预实验来设定。进行分析。浓度根据研究对象的不同，通过预实验来设定。大连理工大学 环境与生命学院6.6.思考题思考题分分析析实实验验结结果果，该该中中药药成成分分对对于于肿肿瘤瘤细细胞胞的的生生长长是是否否有有作作用用？请请设设想想一一下下怎怎样样进进一一步验证其结果？步验证其结果？大连理工大学 环境与生命学院谢谢观看/欢迎下载BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH