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基因信息的传递第第 十十 章章 DNADNA 的生物合成的生物合成生物化学生物化学 Biochemistry第一节第一节 DNADNA的生物合成（复制）的生物合成（复制）第二节第二节 DNADNA损伤与修复损伤与修复内容提要：内容提要：基基 因因 (gene)：为蛋白质或为蛋白质或RNARNA编码的编码的DNADNA功能片段功能片段，是是以碱基排列顺序的方式储存的遗传信以碱基排列顺序的方式储存的遗传信息息。基基 因因 组组（genome)：某一物种拥有的全部遗传物质，从某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意义上说，是指分子意义上说，是指全部全部DNADNA序列序列。生物化学生物化学 Biochemistry 转录转录 翻译翻译 复制复制 DNA RNA 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录*中心法则中心法则(the central dogma)转录转录 翻译翻译 复制复制 DNA RNA 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录 转录转录 翻译翻译 复制复制 DNA RNA 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录 转录转录 翻译翻译 复制复制 DNA RNA 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录 转录转录 翻译翻译 复制复制 DNA RNA 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录 转录转录 翻译翻译 复制复制 DNA RNA 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录 生物化学生物化学 Biochemistry生物化学生物化学 BiochemistryDNA的生物合成(复制)DNA Biosynthesis(Replication)第第 一一 节节生物化学生物化学 Biochemistry DNA的生物合成的生物合成复制复制(replication)：以以亲代亲代DNADNA为模板为模板，按照，按照碱基互补配对碱基互补配对规律规律合成子代合成子代DNADNA的过程的过程。复制复制逆转录逆转录复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA生物化学生物化学 Biochemistry一、半保留复制一、半保留复制 DNADNA生生物物合合成成时时，亲亲代代DNADNA解解开开为为两两股股单单链链，各各自自作作为为模模板板(template)(template)按按碱碱基基配配对对规规律律，合合成成与与模模板板互互补补的的新新链链。在在子子代代DNADNA分分子子的的两两条条链链中中，一一条条来来自自亲亲代代，另另一一条条是是新新合合成成的的，这种复制方式称为这种复制方式称为半保留复制。半保留复制。（一）半保留复制的概念（一）半保留复制的概念生物化学生物化学 Biochemistry 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 DNA复制的三种可能方式复制的三种可能方式（二）（二）DNA半保留复制的实验依据半保留复制的实验依据 含含N15-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代生物化学生物化学 Biochemistry按按半半保保留留复复制制方方式式，子子代代DNADNA与与亲亲代代DNADNA的的碱碱基基序序列列一一致致，即即子子代代保保留留了了亲亲代代的的全部遗传信息，体现了遗传的全部遗传信息，体现了遗传的保守性保守性。（三）半保留复制的意义（三）半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但基础，但不是绝对的不是绝对的。生物化学生物化学 Biochemistry二、复制的方向二、复制的方向双向复制双向复制复制原点复制原点（origins of replication）：）：又又叫复制的起始点，是指叫复制的起始点，是指DNADNA复制开始的特定复制开始的特定的位点的位点。这个区域通常由。这个区域通常由富含富含A/TA/T碱基对碱基对的的特殊碱基序列组成，能特殊碱基序列组成，能结合各种蛋白结合各种蛋白，有，有助于解开螺旋，启动复制。助于解开螺旋，启动复制。生物化学生物化学 Biochemistry 复复制制时时双双链链打打开开，分分开开成成两两股股，各各自自作作为为模模板板，子子链链沿沿模模板板延延长长所所形形成成的的Y Y字字形形 的的 结结 构构 称称 为为 复复 制制 叉叉(replication(replication fork)fork)。生物化学生物化学 Biochemistry原核生物：原核生物：基因组是环状基因组是环状DNADNA 只有一只有一个复制起始点个复制起始点 复制时，复制时，DNADNA从复制原点向两个方向解链，从复制原点向两个方向解链，形成两个延伸相反的复制叉，两个叉均参与形成两个延伸相反的复制叉，两个叉均参与DNADNA的复制，并以几乎相等的速率移动，称为的复制，并以几乎相等的速率移动，称为双向双向复制（复制（bidirectional replicationbidirectional replication）。生物化学生物化学 Biochemistry 在在原原核核生生物物双双向向复复制制中中，DNADNA被被描描述述为为眼睛眼睛状，称为状，称为复制。复制。oriCoriC生物化学生物化学 Biochemistry真核生物：真核生物：染色体染色体DNADNA有有多个复制起始点多个复制起始点。两两个个起起始始点点之之间间的的DNADNA片片段段称称为为复复制制子子(repliconreplicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。复制子是独立完成复制的功能单位。真核生物多个复制起始点、复制子与复制叉真核生物多个复制起始点、复制子与复制叉生物化学生物化学 Biochemistry3 5 3 5 3535解链方向解链方向前导链前导链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)复制的半不连续性复制的半不连续性35生物化学生物化学 Biochemistry顺顺着着解解链链方方向向生生成成的的子子链链，复复制制是是连连续续进进行行的的这这股链称为股链称为前导链或领头链前导链或领头链(leading strand)。另另一一股股链链因因为为复复制制的的方方向向与与解解链链方方向向相相反反，不不能能顺顺着着解解链链方方向向连连续续延延长长，这这股股不不连连续续复复制制的的链链称称为为后随链或随从链后随链或随从链(lagging strand)。前前导导链链连连续续复复制制而而后后随随链链不不连连续续复复制制，就就是是复复制制的的半不连续性半不连续性。生物化学生物化学 Biochemistry 冈崎片段：冈崎片段：19681968年年日日本本生生化化学学者者冈冈崎崎用用电电镜镜及及放放射射自自显显影影技技术术，观观察察到到DNADNA复复制制中中出出现现一一些些不不连连续续的的片片段段，将将这这些些不不连连续续的的片片段段称称为为冈冈崎崎片片段段。冈冈崎崎片片段段再再由由DNADNA连连接接酶酶连连成一条完整的新链。成一条完整的新链。原核生物原核生物:1000-20001000-2000个核苷酸个核苷酸 真核生物真核生物:100-200100-200个核苷酸个核苷酸生物化学生物化学 Biochemistry3 5 3 5 3535解链方向解链方向前导链前导链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)35冈崎冈崎片段片段半不连续复制半不连续复制生物化学生物化学 Biochemistry半不连续复制动画半不连续复制动画生物化学生物化学 Biochemistry DNA复制的化学反应复制的化学反应The chemistry reaction of DNA Replication 三、三、（一）（一）DNA复制的体系复制的体系 底物底物:dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)聚合酶聚合酶:依赖依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶(DNA-(DNA-polpol)模板模板:解开成单链的解开成单链的DNADNA母链母链 引物引物:提供提供3-OH3-OH末端的一段末端的一段RNARNA 其他酶和蛋白质因子其他酶和蛋白质因子:拓扑异构酶、解螺旋酶、拓扑异构酶、解螺旋酶、单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白、引物酶、连接酶引物酶、连接酶生物化学生物化学 Biochemistry（二）复制的化学反应（二）复制的化学反应 (dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi 生物化学生物化学 Biochemistry聚合反应的特点聚合反应的特点DNADNA新链生成需要以单链新链生成需要以单链DNADNA为为模板模板需要需要RNARNA引物引物提供提供3 3-OH-OH，以，以dNTPdNTP为原为原料料新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 5 3 3 方向进行方向进行 聚合反应机理聚合反应机理3 5 3 5 5 A G C T T C A G G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除引物和突变的能切除引物和突变的DNADNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性核酸外切酶活性 生物化学生物化学 Biochemistry生物化学生物化学 Biochemistry四、参与复制的主要酶类四、参与复制的主要酶类全称：全称：依赖依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol活性：活性：1 1.5 53 3 的聚合活性的聚合活性 2.2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性（一）（一）DNA聚合酶聚合酶生物化学生物化学 Biochemistry1959 1959 年获诺贝尔生理学或医学奖年获诺贝尔生理学或医学奖 奥乔亚奥乔亚 科恩伯格科恩伯格 Severo Ochoa Arthur Kornberg生物化学生物化学 Biochemistry1.原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 生物化学生物化学 Biochemistry（1）DNA-pol 多功能酶：多功能酶：5 5聚合酶活性聚合酶活性，对复制和修复中出现的，对复制和修复中出现的空隙进行填补；空隙进行填补；5 5 外切酶活性外切酶活性，对复制中的错误进行校对，对复制中的错误进行校对，保证复制准确性；保证复制准确性；5 5外切酶活性外切酶活性，去除，去除RNARNA引物和突变碱基。引物和突变碱基。生物化学生物化学 BiochemistryDNA聚合酶聚合酶I的的5 外切酶活性：外切酶活性：识别切除生长链识别切除生长链3 3 端的错配核苷酸，每次切除端的错配核苷酸，每次切除1 1个核苷酸，个核苷酸，该活性对双链该活性对双链DNADNA不起作用不起作用；正常聚合条件下，活性很低正常聚合条件下，活性很低，一旦出现碱基错，一旦出现碱基错配，配，DNADNA聚合酶聚合酶I I的聚合活性被抑制，聚合反应停的聚合活性被抑制，聚合反应停止，止，5 5 外切酶活性切除错配核苷酸，再继续聚外切酶活性切除错配核苷酸，再继续聚合；合；有效的保证有效的保证DNADNA复制的高度忠实性复制的高度忠实性。323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 605个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol 928 AaKlenowKlenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNADNA，进行分子生物学进行分子生物学研究中常用的工具酶。研究中常用的工具酶。（2）DNA聚合酶聚合酶II(DNA-pol II)具有具有5 5聚合酶活性聚合酶活性和和5 5 外外切酶活性，没有切酶活性，没有5 5外切酶活性外切酶活性。只是在无只是在无polpol及及polpol的情况下暂的情况下暂时起作用。时起作用。对模板的特异性不高对模板的特异性不高,参与参与DNADNA损损伤伤 的应急状态修复的应急状态修复。生物化学生物化学 Biochemistry（3）DNA聚合酶聚合酶III (DNA-pol III)是复制延长中是复制延长中真正起催化作用的酶真正起催化作用的酶。由由1010种亚基组成不对称的聚合体。种亚基组成不对称的聚合体。，/ksi/ksi/，/it/it/亚亚基基组组成成核核心心酶酶，亚亚基基具具有有5 533的的聚聚合合活活性性，亚亚基基具具有有3535外外切切酶酶活活性性和和碱碱基基选选择择功功能能，亚基可能起组装作用亚基可能起组装作用。生物化学生物化学 Biochemistry亚亚基基(DNA(DNA夹夹子子)能能夹夹稳稳模模板板链链，负负责责酶酶沿沿DNADNA模板滑动的作用。模板滑动的作用。其其余余亚亚基基统统称称为为-复复合合物物,促促进进全全酶酶的的组装及增强核心酶活性。组装及增强核心酶活性。DNA-pol 53聚聚合活性合活性35外切外切组装组装核心酶核心酶DNA夹子夹子-复合复合物物大肠杆菌每个细胞中只有大肠杆菌每个细胞中只有10102020个个DNA DNA polpol-III-III酶分子，但催化脱氧核苷酶分子，但催化脱氧核苷酸掺入酸掺入DNADNA链的速率分别是链的速率分别是DNADNA聚合酶聚合酶I I和和IIII的的1515倍和倍和3030倍，可达倍，可达150150个核苷个核苷酸酸/秒。并且它可连续催化多达秒。并且它可连续催化多达50005000个核苷酸的加入，因此是真正意义上个核苷酸的加入，因此是真正意义上的的DNADNA复制酶。复制酶。生物化学生物化学 Biochemistry催化催化DNA聚合聚合参与参与DNADNA损伤损伤的应急状态修的应急状态修复复校读、修复合校读、修复合成、成、切除引物切除引物填补空隙填补空隙功能功能2040400分子数分子数/细胞细胞+5 外切酶活性外切酶活性+5 外切酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE.Coli中的中的DNA聚合酶聚合酶生物化学生物化学 Biochemistry2.真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶起始引发，催化起始引发，催化后随链的不连续合成后随链的不连续合成。复制的主要酶复制的主要酶，参与，参与前导链前导链的合成。的合成。参与参与DNADNA的的修复修复。在复制过程中起在复制过程中起校读、修复和填补缺校读、修复和填补缺口口的作用。的作用。在在线粒体线粒体DNADNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol （二）（二）DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase)1010 8 8 局部解链后局部解链后拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持不变的性质。拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持不变的性质。生物化学生物化学 Biochemistry解解链链过过程程中中，DNADNA分分子子会会过过度度拧拧紧紧、打打结结、缠缠绕绕、连连环环等等现现象象，DNADNA拓拓扑扑异异构构酶酶催催化化DNADNA链链的的瞬瞬时时断断裂裂和和闭闭合合释放长螺旋产生的扭转张力，使复制顺利进行。释放长螺旋产生的扭转张力，使复制顺利进行。生物化学生物化学 Biochemistry拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点兼有兼有内切酶活性内切酶活性和和连接酶活性连接酶活性克服解链过程中的打结、缠绕现象克服解链过程中的打结、缠绕现象 拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶分分 类类拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNADNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNADNA解解链旋转不致打结；适当时候封闭链旋转不致打结；适当时候封闭切口，切口，DNADNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATPATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNADNA分子分子两股两股链，断端通过切口链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。旋转使超螺旋松弛。利用利用ATPATP供能，连接断端，供能，连接断端，DNADNA分子分子进入负超螺旋状态。（主要）进入负超螺旋状态。（主要）作用机制作用机制 生物化学生物化学 Biochemistry拓扑异构酶拓扑异构酶的作用的作用拓扑异构酶拓扑异构酶的作用的作用（三）解螺旋酶（三）解螺旋酶(helicase)位于复制叉前，位于复制叉前，利用利用ATPATP供能供能，作用于氢键作用于氢键，使，使DNADNA双链双链解开成为两条解开成为两条单链单链，便于，便于DNA DNA polpol III III和和引物酶作用。引物酶作用。每解开一对碱基，需消耗每解开一对碱基，需消耗2 2分子分子ATPATP。Dna BDna C解链方向解链方向（四）引物酶（四）引物酶(primase)依赖依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶。可以催化游离可以催化游离NTPNTP聚合形成聚合形成小段小段RNARNA。催化催化RNARNA引物的生成，对于引物的生成，对于DNADNA合成是必需的。合成是必需的。在大肠杆菌，是在大肠杆菌，是dnadna G G基因的表达产物。基因的表达产物。引物（引物（primer）：）：是是一一小小段段单单链链DNADNA或或RNARNA，作作为为DNADNA复复制制的的起起始始点点，在在核核酸酸合合成成反反应应时时，作作为为每每个个多多核核苷苷酸酸链链进进行行延延伸伸的的出出发发点点而而起作用的多核苷酸链，引物的起作用的多核苷酸链，引物的3-OH3-OH，必须是游离的。，必须是游离的。生物化学生物化学 Biochemistry（五）（五）DNA连接酶连接酶连连接接DNADNA链链3 3-OH-OH末末端端和和相相邻邻DNADNA链链5 5-P-P末末端端，使使二二者者生生成成磷磷酸酸二二酯酯键键，从从而而把两段相邻的把两段相邻的DNADNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。生物化学生物化学 BiochemistryHO5335DNA连接酶连接酶ATP（NAD+）AMP5353生物化学生物化学 Biochemistry 在复制中起接合在复制中起接合双链中单链缺口双链中单链缺口的作用。的作用。在在DNADNA修修复复、重重组组及及剪剪接接中中也也起起缝缝合合缺缺口口作用。作用。是基因工程的重要工具酶之一。是基因工程的重要工具酶之一。DNA连接酶的功能连接酶的功能 （六）（六）单链单链DNA结合蛋白结合蛋白 (single stranded DNA binding protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性单链的完整性。生物化学生物化学 Biochemistry解旋解链酶类的作用解旋解链酶类的作用 解螺旋酶、引物酶和单链解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白结合蛋白理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶(gyrA,B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链DNA结合蛋白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG(dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC(dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB(dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA(dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质生物化学生物化学 Biochemistry（一）复制的起始（一）复制的起始需要解决三个问题：需要解决三个问题：复制起始位点的识别；复制起始位点的识别；DNADNA解开成单链，提供模板；解开成单链，提供模板；合成引物，提供合成引物，提供3 3-OH-OH末端；形成引发体。末端；形成引发体。五、原核生物的五、原核生物的DNA生物合成生物合成 DNADNA的复制可以分为的复制可以分为3 3个阶段：个阶段：起始、延伸起始、延伸和和终止终止。生物化学生物化学 Biochemistry1.复制起始位点的识别复制起始位点的识别在细菌和病毒中，在细菌和病毒中，DNADNA复制的起始发生在特定的复制的起始发生在特定的DNADNA位点。在位点。在E.coli中，中，oriC是复制的唯一起始位点是复制的唯一起始位点。复制起点的序列特征复制起点的序列特征富含富含ATATDnaADnaA蛋白蛋白(解旋酶解旋酶)结合位点结合位点生物化学生物化学 Biochemistry腺嘌呤被甲基化，与腺嘌呤被甲基化，与DNA复制的启动相关复制的启动相关13 bp13 bp13 bp9 bp9 bp9 bp9 bp GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 5 3 2.DNA的解链的解链E.coli复制起始点复制起始点 oriC 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 DNA解链的过程：解链的过程：DnaADnaA蛋白与蛋白与DNA DNA orioriC C的重复序的重复序列结合形成列结合形成DNA-PrDNA-Pr起始复合体起始复合体富含富含ATAT区域双螺旋变性，区域双螺旋变性，orioriC C局局部解链形成开链复合物部解链形成开链复合物DnaCDnaC蛋白将解旋酶蛋白将解旋酶(DnaBDnaB蛋白蛋白)运运送到复制模板，与模板结合送到复制模板，与模板结合解旋酶解旋酶(DnaBDnaB)作用于氢键，消耗作用于氢键，消耗ATPATP，解开双螺旋变成单链，解开双螺旋变成单链单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白(SSB)(SSB)与单链与单链DNADNA结合，避免重新配对和降解结合，避免重新配对和降解 Dna A Dna B、Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 3.引物的合成引物的合成含有解螺旋酶含有解螺旋酶(DnaBDnaB)、DnaCDnaC蛋白、引物酶蛋白、引物酶(DnaGDnaG)和和DNADNA复制起始区域的复合结构称为复制起始区域的复合结构称为引发体引发体(primosomeprimosome)。生物化学生物化学 Biochemistry3 5 3 5 引物是由引物酶引物是由引物酶(DnaGDnaG蛋白蛋白)催化合成的催化合成的短链短链RNARNA分分子子，其合成需要，其合成需要ATPATP供能供能和和NTP(NTP(不是不是dNTPdNTP)的参与的参与。引物引物3 HO5引物引物酶酶DnaADNA拓扑异构酶拓扑异构酶DnaB、DnaCSSB生物化学生物化学 Biochemistry（二）复制的延长（二）复制的延长复复制制的的延延长长指指在在DNA-DNA-polpol催催化化下下，dNTPdNTP以以dNMPdNMP的的方方式式逐逐个个加加入入引引物物或或延延长长中中的的子子链链上上，其其化化学学本本质质是是磷磷酸酸二二酯酯键键的的不不断断生生成成。生物化学生物化学 Biochemistry 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 3 3DNA-pol复复制制过过程程简简图图领头链的合成领头链的合成随从链的合成随从链的合成后随链的合成是由引物酶沿着模板在有规则的后随链的合成是由引物酶沿着模板在有规则的间隔的间隔的合成合成短的短的RNARNA引物引物，当一段新的冈崎片段合成后，当一段新的冈崎片段合成后，DNA-DNA-polpol I I利用利用5 533外切活性外切活性将将RNARNA引物引物切除切除，又利用，又利用DNA-DNA-polpol I I的聚合酶活性的聚合酶活性合成一段合成一段DNADNA作为替换作为替换，留下的，留下的缺口缺口由由DNADNA连接酶连接连接酶连接。5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP AMP+PPi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接生物化学生物化学 Biochemistry原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNADNA，双向复制的复制片双向复制的复制片段在复制的终止点段在复制的终止点(terter)处汇合。处汇合。E.colioriter8232 ori terSV40500（三）复制的终止（三）复制的终止生物化学生物化学 Biochemistry（四）（四）复制保真性的酶学依据复制保真性的酶学依据 DNADNA复制的出错率仅为复制的出错率仅为1010-9-9-10-10-10-10左右，左右，即大约每合成即大约每合成10109 9-10-101010个核苷酸才会出现个核苷酸才会出现一个误差。一个误差。生物体内有多种机制保证生物体内有多种机制保证DNADNA复制的高复制的高度忠实性。度忠实性。DNADNA复制时复制时按照按照碱基配对规律碱基配对规律进行，是遗传信进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。息能准确传代的基本原理。DNA-DNA-polpol具有具有3 3-5-5核酸外切酶活性和即时校核酸外切酶活性和即时校对功能对功能，可以检测并消除偶然出现的错误。，可以检测并消除偶然出现的错误。RNARNA引物也是保证复制忠实性的因素。引物也是保证复制忠实性的因素。细胞内具有完整的细胞内具有完整的DNADNA修复机制修复机制，可以校正、，可以校正、修复新合成修复新合成DNADNA中的碱基错误及中的碱基错误及DNADNA损伤。损伤。DNA复制高保真性的酶学机制复制高保真性的酶学机制 DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读的核酸外切酶活性和即时校读（一）复制的特点（一）复制的特点六、真核生物的六、真核生物的DNA生物合成生物合成 真核生物真核生物DNADNA分子包装在分子包装在核小体核小体中，与组蛋白紧密结中，与组蛋白紧密结合。在合。在DNADNA复制过程中，也要复制过程中，也要合成组蛋白合成组蛋白，亲代亲代DNADNA的的组蛋白仍保留和组蛋白仍保留和DNADNA复制子的结合复制子的结合，而，而新合成的组蛋新合成的组蛋白与子代链结合白与子代链结合。3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物组蛋白组蛋白真真核核生生物物DNADNA分分子子比比较较大大，每每个个染染色色体体有有多多个个起起始始点点，是是多多复复制制子子复复制制。复复制制有有时时序序性性，即复制子以分组方式激活而不是同步启动。即复制子以分组方式激活而不是同步启动。生物化学生物化学 Biochemistry复复制制的的起起始始需需要要DNA-DNA-polpol（引引物物酶酶活活性性）和和DNA-DNA-polpol（解解螺螺旋旋酶酶活活性性）参参与与。还还需需拓拓扑扑酶酶和和复复制制因因子子(replication(replication factor,factor,RF)RF)。DNA-DNA-polpol主要负责主要负责前导链的合成前导链的合成；而；而后随后随链的合成则由链的合成则由DNA-DNA-polpol负责负责，不连续的合，不连续的合成冈崎片段后去除引物，由连接酶连接成完成冈崎片段后去除引物，由连接酶连接成完整的整的DNADNA。生物化学生物化学 Biochemistry增增 殖殖 细细 胞胞 核核 抗抗 原原(proliferation(proliferation cell cell nuclear nuclear antigen,antigen,PCNA)PCNA)在在复复制制起起始始和和延延长长中中起起关关键键作作用用。PCNAPCNA可可以以协协同同DNA-DNA-polpol取取代代DNA-DNA-polpol，合合成前导链。成前导链。生物化学生物化学 BiochemistryDNADNA复制与核小体装配同步进行。复制与核小体装配同步进行。染色体染色体DNADNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制终止包括：复制终止包括：1.1.冈崎片段、复制子之间的连接。冈崎片段、复制子之间的连接。2.2.端粒的合成。端粒的合成。（二）（二）端粒和端粒酶端粒和端粒酶(09诺贝尔生理学奖诺贝尔生理学奖)生物化学生物化学 Biochemistry 真核生物端粒的形成真核生物端粒的形成1.端粒端粒（telomere）是是指真核生物染色体指真核生物染色体线性线性DNADNA分子末端分子末端的结构部分，通常的结构部分，通常膨大成粒状。膨大成粒状。功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNADNA复制的完整性复制的完整性端粒结构特点端粒结构特点 由由末端末端DNADNA序列序列和和蛋白质蛋白质构成。构成。末端末端DNADNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G G、T T碱基的短序列。碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG线性线性DNADNA在复制完成后，其末端由于引物在复制完成后，其末端由于引物RNARNA的的水解而可能出现缩短水解而可能出现缩短。故需要在。故需要在端粒酶端粒酶（telomerasetelomerase）的催化下，进行延长反应。的催化下，进行延长反应。2.端粒酶端粒酶(telomerase)端端粒粒酶酶是是一一种种RNA-RNA-蛋蛋白白质质复复合合体体，它它可可以以与与端端粒粒区区重重复复序序列列互互补补，以以自自身身RNARNA为为模模板板，通通过过逆逆转转录录对对末末端端DNADNA链链进进行延长。行延长。端粒酶的分子结构端粒酶的分子结构生物化学生物化学 Biochemistry端粒酶端粒酶RNA(human telomerase RNA,RNA(human telomerase RNA,hTRhTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白 (human telomerase(human telomerase associated protein 1,hTP1)associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶 (human telomerase(human telomerase reverse transcriptase,reverse transcriptase,hTRThTRT)端粒酶的组成端粒酶的组成3.端粒的复制机制端粒的复制机制端粒端粒DNADNA的的3 3端和端粒酶所含的端和端粒酶所含的RNARNA分子的分子的3 3端形成端形成碱碱基配对基配对；端粒酶端粒酶以自身以自身RNARNA为模板为模板，将，将dNTPdNTP加到端粒加到端粒DNADNA的的3 3端；端；端粒酶发生转位，端粒酶发生转位，DNA-RNADNA-RNA杂交链之间发生相对滑动，杂交链之间发生相对滑动，新生成的端粒新生成的端粒DNADNA链链3 3端重新与端粒酶端重新与端粒酶RNARNA碱基配对，碱基配对，暴露出部分暴露出部分RNARNA模板序列；模板序列；继续逆转录，结合继续逆转录，结合聚合聚合转位的过程周而复始，直至转位的过程周而复始，直至端粒的端粒的DNADNA形成足够长度的单链突出；形成足够长度的单链突出；端粒端粒3 3端的单链突出弯转形成后随链合成的起始端，端的单链突出弯转形成后随链合成的起始端，再由再由DNADNA聚合酶复制聚合酶复制DNA5DNA5末端空缺的末端空缺的DNADNA，最后由，最后由连接连接酶连接酶连接。生物化学生物化学 Biochemistry端粒的复制（动画演示）端粒的复制（动画演示）DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工生物化学生物化学 Biochemistry4.端粒端粒及及端粒酶的意义端粒酶的意义 成年人端粒比胚胎细胞端粒短；成年人端粒比胚胎细胞端粒短；老化与端粒酶活性下降有关；老化与端粒酶活性下降有关；肿瘤的发生与端粒酶活性有关。肿瘤的发生与端粒酶活性有关。生物化学生物化学 Biochemistry 简单地说，简单地说，端粒变短，细胞就老化。相端粒变短，细胞就老化。相反，如果端粒酶活性很高，端粒的长度就能反，如果端粒酶活性很高，端粒的长度就能得到保持，细胞的老化就被延缓。得到保持，细胞的老化就被延缓。“染色体染色体携有遗传信息。携有遗传信息。端粒是细胞内染色体末端的端粒是细胞内染色体末端的保护帽保护帽，它能够保护染色体，而端粒酶，它能够保护染色体，而端粒酶在端粒受损时能够恢复其长度。在端粒受损时能够恢复其长度。”生物化学生物化学 Biochemistry七、逆转录和其他复制方式七、逆转录和其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways生物化学生物化学 Biochemistry（一）（一）逆转录逆转录(reverse transcription)在在逆转录酶逆转录酶的催化下，以的催化下，以RNARNA为模板为模板合成合成DNADNA的过程，又称反转录。的过程，又称反转录。逆转录逆转录酶酶逆转录病毒和逆转录酶逆转录病毒和逆转录酶 生物化学生物化学 Biochemistry（二）（二）逆转录病毒逆转录病毒逆转录病毒的逆转录病毒的基因组是基因组是RNARNA，复制方式是逆，复制方式是逆转录，故称逆转录病毒，也叫做转录，故称逆转录病毒，也叫做RNARNA病毒。病毒。如：许多种肿瘤病毒都是如：许多种肿瘤病毒都是RNARNA病毒；病毒；人类免疫缺陷病毒（人类免疫缺陷病毒（HIVHIV）,它可引起艾滋它可引起艾滋病（病（AIDSAIDS）。）。生物化学生物化学 Biochemistry（三）（三）逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)从从RNARNA病毒中发现，能催化以病毒中发现，能催化以RNARNA为模板合成为模板合成双链双链DNADNA的酶，全称为依赖的酶，全称为依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。有三种活性：有三种活性：RNARNA指导的指导的DNADNA聚合活性聚合活性 RNaseRNase H H活性活性 DNADNA指导的指导的DNADNA聚合活性聚合活性（四）逆转录病毒细胞内的逆转录过程（四）逆转录病毒细胞内的逆转录过程RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA分子生物学研究可应用分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，程目的基因的重要方法之一，此法称为此法称为cDNAcDNA法。法。以以mRNAmRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNAmRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNADNA链链。试管内合成试管内合成cDNAcDNA complementary DNA 逆转录酶活性逆转录酶活性 A AA A T T T T DNA聚合酶聚合酶AAAA碱水解碱水解 T T T T生物化学生物化学 Biochemistry逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNARNA同样兼有遗传信息传递与表达功能。同样兼有遗传信息传递与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了2020世纪初世纪初已注意到的病毒致癌理论。已注意到的病毒致癌理论。（五）逆转录研究的意义（五）逆转录研究的意义 生物化学生物化学 Biochemistry 滚环复制滚环复制(rolling circle replication)滚环复制和滚环复制和D环复制环复制 是某些低等生物的复制形式，如是某些低等生物的复制形式，如 X X174174和和M13M13噬菌体等。噬菌体等。滚环复制滚环复制生物化学生物化学 Biochemistry滚环复制动画滚环复制动画生物化学生物化学 Biochemistry D环复制环复制(D-loop replication)是线粒体是线粒体DNA(mitochondrial DNADNA(mitochondrial DNA，mtDNA)mtDNA)的