细菌内毒素检查法凝胶法.pptx

细菌内毒素检查法 凝胶法 方法分类 浊度法 光度法 显色基质法 重现性好方法特性 能定量 能控制药物的增强/抑制干扰 操作简便。节省时间第1页/共14页原理：v利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关.第2页/共14页第3页/共14页细菌内毒素检测之凝胶法实验程序1、试验准备：试剂、仪器及用具2、内毒素限值的确定3、确定最大有效稀释倍数4、凝胶限度试验5、结果判定第4页/共14页要求1、以最终产品为检测必要（浓度超过）2、检测样品PH应在68之间，不符应调整第5页/共14页1、试验准备：试剂、仪器及用具仪器与器具 电热恒温水浴锅、定时钟、去热源枪头和小玻璃瓶、移液枪、试管架、剪刀、锡箔纸。试剂 细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水、鲎试剂。第6页/共14页2、内毒素限值的确定 L=K/M 式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kgh）表示；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kgh）、mg/（kgh）或U/（kgh）表示。一般由供试品提供者直接提供内毒素限值如1000EU。第7页/共14页3、确定最大有效稀释倍数（MVD）：MVD=cL/式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度；为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)。第8页/共14页3、鲎试剂灵敏度复核按下表制备溶液A、B、C，使用稀释倍数为MVD的供试品溶液来制备溶液A，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。B C A A鲎试剂200ul100ul100ul100ul标准品100ul供试品100ul100ul第9页/共14页6、结果判定将制备好的试剂用锡箔纸包裹好后放入电热恒温水浴锅中，37恒温水浴60min后观察结果（保证玻璃瓶中溶液处于水面以下，并防止水进入瓶中）。若阴性对照溶液B为阴性，阳性对照溶液C为阳性，试验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试，复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定 第10页/共14页操作注意事项试验前准备：1、玻璃器具应规范化，便于除热原、计量准确、清洗操作方便。2、用于内毒素检测的稀释试管最好用玻璃试管；塑料用具只能为一次性且保证无内毒素。实验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进行，保证环境温度、湿度及通风稳定。实验人员：戴干净手套和口罩。第11页/共14页实验过程：1、内毒素工作标准品应严格按要求低温保存；工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完，不再保存。2、每一步稀释液所用的移液器不能反复、交叉使用。3、鲎试剂复溶时应将检查用水顺着瓶壁加入，避免产生气泡。4、操作时间的长短。环境温度变化都会影响实验结果，故操作应尽量熟练、快速。第12页/共14页5、恒温器的温度变化应1，鲎试剂与样品混匀后应立即移入水浴槽，严格控制保温时间在602min，保温期间不得移动试管架，桌面保持平稳，周围不能有振颤因素。结果判断：恒温结束后，取出试管或反应瓶缓缓倒转180，不从管壁脱落为阳性，不能保持完整即使有部分脱落者也判为阴性。第13页/共14页感谢您的观看！第14页/共14页