细菌内毒素检测技术.pptx
细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法(凝胶法凝胶法)1、热原2、细菌内毒素3、鲎试剂4、细菌内毒素检查用水5、细菌内毒素检查的程序6、相关参数的计算7、鲎试剂标示灵敏度的复核试验8、干扰试验9、检查法Page 1第1页/共27页1、热原热原 热原是指临床上能引起哺乳动物发热反应的物质。热原反应 医院临床在使用药品注射剂时，常有发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、休克、严重时导致死亡，这种症状称为热原反应。Page 2第2页/共27页热原分类外毒素热原 外毒素是指某些病原菌生长繁殖过程中分泌到菌体外的一种代谢产物。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。内毒素热原Page 3第3页/共27页2、细菌内毒素定义 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。毒性反应 发热反应、白细胞反应、内毒素休克Page 4第4页/共27页Page 5 细菌内毒素与热原的关系细菌内毒素是热原之一种医药工业接受的观点是,内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原,在GMP条件下控制内毒素污染就等于控制热原污染。第5页/共27页特性致热性耐热性酸碱性鲎反应性分子极性需要在250摄氏度干热30分钟才能彻底灭活多糖链端有亲水性，脂肪链端具有疏水性，在水中呈不均匀分布内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原刺激下丘脑体温调节中枢，使人体发热升温能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶与强酸强碱水解反应，可灭活内毒素Page 6第6页/共27页Page 7第7页/共27页标准内毒素与环境内毒素标准内毒素经人工精制并经生物效价测定的细菌内毒素,作为BET的参考标准品或对照品标准内毒素分内毒素标准参考品(RSE)和内毒素工作标准品(CSE)两种CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际）环境内毒素环境内毒素是天然的内毒素普遍存在于水、空气及各种原料中,成份除了脂多糖外还含有蛋白质、多糖和其它杂质,其两极活性不明显,致热性较弱。BET的对象是环境内毒素。Page 8第8页/共27页细菌内毒素检查 通常称使用鲎试剂来检测细菌内毒素的方法为细菌内毒素检查法。其中包括两种方法：凝胶法和光度测定法。Page 9第9页/共27页Page 103、鲎试剂鲎试剂的分类根据鲎的种类分类：美洲鲎试剂（LAL）中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL）根据检查方法分类：凝胶法鲎试剂光度法鲎试剂根据鲎试剂的特异性分类：普通鲎试剂特异性鲎试剂第10页/共27页Page 114、细菌内毒素检查用水（BET水）2005年版药典要求，凝胶法BET水应为内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET水内毒素含量应少于0.005EU/ml。2010年版药典要求，细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。美国药典要求的BET水是指与所使用的鲎试剂不发生反应的灭菌注射用水或其它水。第11页/共27页Page 125、细菌内毒素检查的程序验证实验灵敏度复核试验干扰试验检查法凝胶限量试验凝胶半定量试验第12页/共27页Page 136、相关参数的计算内毒素限值药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/ML为供试品的细菌内毒素限值；K为人每千克体重每小时可接受的最大内毒素剂量；M为人每千克体重每小时的最大供试品剂量。安福隆成品内毒素限值为10EU/5MIU，原液内毒素限值为20EU/mg。第13页/共27页Page 14 最大有效稀释倍数指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数（1-MVD），在不超过此稀释倍数的浓度按下进行内毒素限值的检测。用以下公式计算：MVD=cL/C为供试品溶液的浓度，为鲎试剂的灵敏度。第14页/共27页Page 157、鲎试剂标示灵敏度的复核试验实验目的验证实验室的条件是否满足BET实验的要求验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET水等）是否满足BET实验的要求第15页/共27页Page 16操作步骤示意图翻转180度，观察凝胶状况稀释为2、0.5、0.25内毒素标准溶液(C溶液)0.1mlTAL0.1mlCSE(RSE)，平行4管NC：0.1mlTAL0.1mlBET水，平行2管单次管：原安瓿多次管：反应试管轻轻转动瓶壁摇匀每步稀释于旋涡混合器混合30秒旋涡混合器混合15min混匀混匀BET水复溶BET水复溶内毒素RSE或CSE鲎试剂TAL371，孵育60min2min混匀（水浴恒温需封口）第16页/共27页Page 178、干扰试验通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰。至少对3批样品进行干扰试验。第17页/共27页Page 18试验步骤供试品限值的确定鲎试剂的选择最大有效稀释倍数的确定反应溶液的制备加样及反应结果判断第18页/共27页1）供试品限值安福隆水针，1ml：5MIU；药典要求内毒素限值L=10EU/5MIU2）试剂的选择试剂名称规格标示效价数量TAL 0.1ml/支0.25EU/ml36内毒素标准品（CSE）10ng/瓶10EU/ng（CoA）1BET（水）50ml/瓶0.003EU/ml1Page 19第19页/共27页Page 203）最大有效稀释倍数的计算MVD=cL/=40（倍）4）各反应溶液的制备溶液编号 CD溶液内容 E0.5 E0.25 E0.125 E0.06W平行管溶液编号BA溶液内容 S40E0.5 S40E0.25 S40E0.125 S40E0.06S40平行管第20页/共27页Page 216）结果判断溶液编号 C（Es系列）D溶液内容 E0.5 E0.25 E0.125 E0.06W平行管溶液编号B（Et系列）A溶液内容S40E0.5 S40E0.25 S40E0.125 S40E0.06S40平行管+第21页/共27页Page 227）结果计算及判断药典规定：当溶液A和溶液D（阴性对照）的所有平行管都为阴性，且0.5 Es 2时，试验有效。当0.5 Es Et 2 Es时，供试品在该浓度下无干扰。本试验：1）0.5=0.125，2=0.5 Es=0.25，0.5 Es 2，有效!2）0.5Es=0.125，2Es=0.5 Et=0.210，0.5 Es Et 2 Es，无干扰！结论：使用灵敏度=0.25EU/ml的鲎试剂对安福隆水针（1ml：5MIU）的40倍稀释液(S40)作BET，无干扰。ES=lg-14(lg0.25)4=0.25 EU/mlEt=lg-1=0.210 EU/ml(lg0.125)+(lg0.25)34第22页/共27页Page 239、检查法(凝胶法限量试验)反应项目设置项目名称供试品检查供试品阳性对照阳性对照阴性对照溶液编号ABCD溶液内容SSE2E2W平行管第23页/共27页结果判断当需要复检时，A溶液平行4管，若所有平行管均为阴性，则供试品合格；否则不合格。溶液编号ABCD溶液内容S40S40E0.5E0.5W试验有效合格不合格需复检复检合格复检不合格Page 24+第24页/共27页Page 25内毒素指示剂用途用于干热灭活内毒素程序的验证使用方法1、保留12支指示剂作为未经干热对照品2、除去指示剂标签，开启，用铝箔纸把指示剂包裹3、把指示剂放置在烤箱的不同位置，一般放置1015个点。指示剂应与除热原物料夹放在一起。4、按灭活内毒素程序进行干烤5、对经灭活程序后的指示剂进行鲎试验测试6、数据分析第25页/共27页第26页/共27页感谢您的观看！第27页/共27页
