第六章_____稳定性同位素示踪法.ppt
第六章第六章稳定性同位素示踪法稳定性同位素示踪法概述：概述：1、1912年年，Thomson首首发发现现稳稳定定性性核核素素20Ne和和22Ne（氖）。氖）。2、1929年，年，Naude发现了发现了15N。3、1937年年，Urey等等首首次次报报道道人人工工生生产产15N的的方法。方法。4、1940年年，先先后后获获得得具具生生物物意意义义的的15N、18O和和3H大量生产。大量生产。5.1947年年9月在美国月在美国Wisconsin大学召开了大学召开了“同位素同位素在生物学和医学中应用在生物学和医学中应用”专题讨论会，从此开始专题讨论会，从此开始了了稳定性核素示踪技术应用的新纪元。稳定性核素示踪技术应用的新纪元。6.近近20年，稳定性核素示踪技术迅速发展，分离分析方年，稳定性核素示踪技术迅速发展，分离分析方法取得了较大突破，法取得了较大突破，13C、2H、18O、15N广泛应用于生物广泛应用于生物学、医学、环保、农药、农学、微生物等研究领域。我学、医学、环保、农药、农学、微生物等研究领域。我国先后分离了国先后分离了25种元素的种元素的100多种稳定性核素，例如：多种稳定性核素，例如：15N标记化合物就有标记化合物就有30余余种。种。几个概念几个概念稳定性同位素稳定性同位素（Stableisotope）丰度丰度（Abundance）A即某核在该组同位素中浓度即某核在该组同位素中浓度(通常指人工加浓通常指人工加浓了了的的)。自然丰度自然丰度（Naturalabundaa）A自自(AO)15N：0.365%、18O:0.204%原子百分超原子百分超（Atompercentexcess）aa=A-A自自又称富集度（又称富集度（Enrichment）富集富集15N（Enriched15N）贫化贫化15N（Depeled15N)一一.稳定性同位素示踪法的基本依据：稳定性同位素示踪法的基本依据：1.自然界中一种元素同位素组成是自然界中一种元素同位素组成是相对恒定相对恒定2.同一元素的同位素具有同一元素的同位素具有相同的化学性质相同的化学性质3.同一元素的同位素之间存在同一元素的同位素之间存在质量差异质量差异 重要化学元素的稳定性同位素重要化学元素的稳定性同位素元素元素同位素同位素自然丰度自然丰度样品来源样品来源H1H99.985新鲜的表面淡水新鲜的表面淡水2H(D)0.0147B10B18.46意大利天然硼酸盐意大利天然硼酸盐11B81.54C12C98.892捷克扑利兹石灰石捷克扑利兹石灰石13C1.108N14N99.635大气中的氮气大气中的氮气15N0.365O16O99.759大气中的氧气大气中的氧气17O0.037418O0.2039氮的同位素表氮的同位素表同位素同位素射线种类射线种类半衰期半衰期自然丰度自然丰度12N+0.011S13N+9.96m14N-99.635-99.63515N-0.365-0.36516N-7.1S17N-4.15S18N-0.63S稳定性同位素标记物的命名稳定性同位素标记物的命名1978年国际纯化学和化学联合会年国际纯化学和化学联合会IUPAC的命名的命名法法:1.结构式结构式:15NHCl或或15NHCl（这样純的这样純的物质不存在物质不存在)单标记化合物单标记化合物:H215N-CO-NH215N-尿素，尿素，例如例如15N的丰度可为的丰度可为5%，10%，15%双标记化合物双标记化合物(一个同位素一个同位素):H215N-CO-15NH2尿素尿素1.4.混合标记化合物混合标记化合物:(15NH2)13CO(13C15N)尿素尿素核素核素A（%）质量数质量数14N99.6351415N0.36515注注意意：由由于于同同位位素素之之间间的的质质量量差差异异，因因此此它它们们的的物物理理、化化学学、生生物物化化学学等等性性质质会会有有所不同，进行实验时，需注意所不同，进行实验时，需注意同位素效应同位素效应。二二.稳定性同位素示踪法的特点：稳定性同位素示踪法的特点：1.无放射性，无辐射效应及不良影响。无放射性，无辐射效应及不良影响。2.安全、对人无伤害。安全、对人无伤害。3.无污染，不受环境条件限制。无污染，不受环境条件限制。4.无衰变，实验时间不受限制。无衰变，实验时间不受限制。5.可进行放射性示踪法难以进行的实验。可进行放射性示踪法难以进行的实验。例：例：N素中素中T最长的最长的13N：T=9.096m一一三三.稳定性同位素分析法的基本流程稳定性同位素分析法的基本流程同位素引入生物体同位素引入生物体 动植物原始样品动植物原始样品仪器所需的待测样品仪器所需的待测样品 进样过程进样过程 质谱分析法质谱分析法光谱分析法光谱分析法 记录记录 实验结果分析实验结果分析 四四.影响影响1515N N引入丰度的因素引入丰度的因素 1.1.实验材料对实验材料对1515N N的稀释程度。的稀释程度。2.2.N N素在不同部位分布的不均匀性素在不同部位分布的不均匀性 3.3.分析测定技术所能达到的精度。分析测定技术所能达到的精度。1515N N示示踪踪法法引引入入N N素素肥肥料料的的丰丰度度计计算算 参考公式参考公式 a af f =W Wp p R Rp p a ap p/N Nf f R RN N式中：式中：a af f：N N素肥料的原子百分超素肥料的原子百分超 W Wp p：植物总重量（待测）植物总重量（待测）a ap p：植物样品中原子百分超植物样品中原子百分超 R Rp p：植物样品中含植物样品中含N N百分率百分率 N Nf f：施纯施纯N N量量 R RN N：N N肥利用率肥利用率 注意事项：注意事项：1.1.同同位位素素交交换换反反应应：在在一一定定条条件件下下，标标记记的铵盐可与大气发生反应：的铵盐可与大气发生反应：1515NHNH+4 4水水 溶溶 液液+1414NHNH3 31414NHNH+4 4水水 溶溶 液液+1515NHNH3 3 1515N N丰度高时应注意。丰度高时应注意。2.2.同同位位素素效效应应：藻藻类类对对1414C C、1313C C、1212C C的的吸吸收收依次递减。依次递减。3.3.予测样品测定项目予测样品测定项目 五、质谱和光谱测定五、质谱和光谱测定1515N N原理原理 14 14N N和和1515质量不同质量不同质质 谱谱：把把 N N2 2离离 子子 化化 为为2828N-NN-N2 2，2929N-NN-N2 2，3030N-NN-N2 2 使使 其其 在在均匀磁场均匀磁场中发生不同角度偏转中发生不同角度偏转 2 2光谱：光谱：2828N-NN-N2 2：谱线波长为谱线波长为2976.82976.8埃埃 2929N-NN-N2 2：谱线波长为谱线波长为2982.92982.9埃埃 3030N-NN-N2 2：谱线波长为谱线波长为2988.62988.6埃埃-入口入口出口出口加加速速电电压压1800的均匀磁场的均匀磁场 六六.供仪器待测样品的制备、测量供仪器待测样品的制备、测量 1.1.对待测样品的要求：对待测样品的要求：(1)(1)因因为为测测量量的的是是不不同同质质量量离离子子流流的的相相对对含含量量，因因此此，保保证证有有一一定定的的N N量量即即可可。一一般般要要求求含含N N量量1 1mg/mlmg/ml最少不低于最少不低于0.50.5mgmg。(2)(2)仪器的本底检查。仪器的本底检查。(3)(3)离离子子峰峰的的选选择择（1414N N和和1515N N的的峰峰比比2828N N、2929N N小小1010倍，选倍，选2828N N、2929N N、3030N N）。）。(4)(4)仪仪器器精精确确度度检检查查（检检查查去去O O2 2后后的的空空气气或或纯纯N N气）。气）。2.2.分析样品的制备：分析样品的制备：(1)(1)K K氏法（氏法（KjeidaliKjeidali）质谱分析常用法。质谱分析常用法。A.A.样样品品的的消消化化：（例例：0.050.05g g植植样样+10+10mlml浓浓H H2 2S0S04 4+3.3gSe:CuSO+3.3gSe:CuSO4 4:K:K2 2SOSO4 4为为1:10:1001:10:100混混合合催催化化剂剂样样液液清清亮亮再再消消煮煮5 5h h（土土）或或2 2h(h(植植)，温温度度120-140120-140。样样品品予予处处理理：水水杨杨酸酸硫硫酸酸法法：5 5g g干干土土或或0.50.5g g植植样样+12+12mlml水水杨杨酸酸：硫硫酸酸为为5050g g：1000ml1000ml溶溶液液中中放放置置3030minmin，再再加加2.52.5g g硫硫代代硫硫酸酸钠钠和和1515mlml水水，缓缓缓缓加加热热至至停停出出起起泡泡冷却冷却常规消化）。常规消化）。B.B.蒸馏：蒸馏：用用蒸蒸汽汽蒸蒸馏馏将将消消化化液液中中NHNH3 3分分离离出出来来，并测定总并测定总N N。方方法法：消消化化液液中中加加过过量量40%40%NaOHNaOH,释释放放的的NHNH3 3被被蒸蒸汽汽逐逐出出，经经冷冷凝凝后后被被2%2%硼硼酸酸吸吸收收，加加入入混混合合指指示示剂剂用用标标准准硫硫酸酸滴滴定定（设设置置一一个个标准液）。标准液）。此此步步骤骤将将NHNH3 3-N-N转转变变成成了了NHNH4 4+-N-N（铵铵态态N N），仪仪器器分分析析适适宜宜量量1 1mgNmgN/样样品品2-32-3ml(ml(浓浓缩缩或或稀稀释释)。(制备好的样品送交仪器分析制备好的样品送交仪器分析)以下在质谱仪上进行以下在质谱仪上进行C.C.将将NHNH4 4+-N-N转化为转化为N N2 2气气:在在真真空空条条件件下下，将将上上述述样样品品与与次次溴溴酸酸钠钠反反应应，放放出出N N气气（在在质质谱谱仪仪内内进进行行）详详见书见书1515N N章节。章节。制样时注意：制样时注意：1.1.所有试剂纯度要高。所有试剂纯度要高。2.2.消化要完全。消化要完全。3.3.防防止止样样品品间间交交叉叉污污染染（每每个个样样品品蒸蒸馏前用蒸馏馏前用蒸馏1515mlml乙醇洗器皿）。乙醇洗器皿）。4.4.“Y Y”型型管管及及内内部部反反应应抽抽气气须须彻彻底底，防其它气体干扰。防其它气体干扰。以以下下在在光光谱谱仪仪上上进进行行,可可用用液液体体样样品也可用干样品品也可用干样品(2).(2).杜马法（杜马法（DumasDumas）光谱分析中常用法光谱分析中常用法适用于含适用于含N N量低（少于量低（少于100 100 g g）的样品，光谱测量。的样品，光谱测量。方法：方法：A A在在放放电电管管中中装装入入样样品品，氧氧化化剂剂（CuOCuO）及及吸吸收收剂剂（CaOCaO）抽抽真真空空，抽抽完完后后熔熔封封放放电电管。管。在在马马福福炉炉中中燃燃烧烧0.5-30.5-3h h（560560）样样品品，（CaOCaO吸收吸收COCO2 2和和H H2 2O)O)以产生以产生N N2 2气气。B B冷却至室温后在光谱仪上测定冷却至室温后在光谱仪上测定 纯样品火焰为纯样品火焰为粉红色粉红色或或淡黄色淡黄色 有有COCO2 2呈呈白色白色，有水呈，有水呈黄色黄色）注意：注意：如如果果是是液液体体样样品品。需需用用PyrexPyrex玻玻璃璃管管（1 1cm cm 2mm2mm）吸吸满满样样液液，烘烘干后再放入放电管。干后再放入放电管。CuOCuO、CaOCaO使使用用前前用用700700高高温温烘烘干干除除去去COCO2 2，H H2 2O O，并并在在12-1812-18Kg/cmKg/cm2 2压力下制成棒状压力下制成棒状,备光谱分析备光谱分析 仪器分析方法步骤：仪器分析方法步骤：1 1、通电予热仪器、通电予热仪器1010分钟，分钟，打开打开光电倍增管高压。光电倍增管高压。2 2、放电管、放电管装入装入燃烧室固定架上。燃烧室固定架上。3 3、开开高频发生器电源，使放电管中样品放电发光。高频发生器电源，使放电管中样品放电发光。4 4、选选择择适适宜宜放放大大倍倍数数对对2828N N、2929N N、3030N N峰峰分分别别进进行行放大，在放大，在29702970A A0 0-2990A-2990A0 0之间扫描。之间扫描。5 5、放放下下记记录录笔笔，接接通通扫扫描描开开关关，划划出出2828N N、2929N N、3030N N峰高。峰高。6 6、求得求得平均峰高，平均峰高，计算计算1515N N丰度。丰度。七七1515N N实验结果计算实验结果计算 1414、1515的的质质量量比比2828、2929、3030的的小小1010倍倍，不参加运算不参加运算 当当1515N N丰度小于丰度小于5%:5%:R R=质质量量为为2828离离子子流流强强度度/质质量量为为2929离离子流强度子流强度 此时此时3030N N的流子离强度很小，的流子离强度很小，1.1.丰度丰度：A A=1/2R+1=1/2R+1100%100%(1)(1)当当1515N N丰度大于丰度大于5%5%R R=质质 量量 为为 2929离离 子子 流流 强强 度度/质质 量量 为为 3030离离 子子 流流 强强 度度 A A=2/R=2/R+2+2 100%100%或或者者由由质质量量为为2828、2929、3030的的峰峰值值直直接接算算出出：A A=29+230/2 29+230/2（28+29+30)28+29+30)100%100%以以下下以以植植物物材材料料实实验验为为例例进进行行计计算算，其其计计算算原原理理也也适适用用于于动动物物等等，共共同同的的条条件件是是在在一一个个相相对对封封闭闭系系统统内内开开展展实实验验。（若若是是用用3232P P等等实实验验，计计算算时时把把原原子子百百分分超超换换成成比强度即可）比强度即可）2.2.植样的原子百分超植样的原子百分超:a ap p a ap p =A-A=A-A自自 （2 2）（A A自自=0.365%=0.365%或空白实验值）或空白实验值）3.3.植物从肥料中摄取植物从肥料中摄取N N的的%:%:N Ndffdff 植植 物物 中中 N N有有 多多 少少%是是 来来 自自 于于 肥肥 料料（Percentage Percentage of of in in the the plant plant derived derived from from the the fertilizerfertilizer），可可以以是是根根、茎茎、叶叶、果实的任一果实的任一N Ndffdff N Ndffdff =a ap p/a af f100%100%（设设N N素素来来源源于于土土壤壤和肥料二方面）和肥料二方面）（3 3）afaf：肥料肥料N N的原子百分超（或动物饲料的原子百分超（或动物饲料N N的原的原子百分超，此时又多了一个动物排泄因素）。子百分超，此时又多了一个动物排泄因素）。上片解释见第五章第37片同位素稀释法4 4、植植物物从从土土壤壤中中摄摄取取N N的的%（Percentage Percentage of of in in the the plant plant tissue tissue derived derived from from the soilthe soil）:N Ndfsdfs N Ndfsdfs =1-=1-N Ndffdff (4)(4)5 5、植物中来自肥料的植物中来自肥料的N N量量:N Npfpf N Npfpf=植物总植物总N N量量a ap p/a af f （5 5）N Npfpf+N Npsps=植物中总植物中总N N量（已在定量（已在定N N中测定中测定,K K氏定氏定N N法）設总法）設总N N来源于来源于土壤土壤和和肥料，肥料，则：则：6.6.植物中来自土壤植物中来自土壤N N的量：的量：N Npsps N Npsps=总总N-N-N Np pf f (6)(6)7.7.N N素利用率：素利用率：R R=N Np pf f /N Nf f100%(7)100%(7)N Nf f：施入纯施入纯N N的总量的总量 8.8.土壤土壤A A值：值：A A值值=N Ndfsdfs/N NdffdffN Nf f (Kg/(Kg/公顷公顷)（8 8）A A值值：表表示示土土壤壤有有效效供供应应N N素素量量(用用A A值值可可以以解解释释为什么为什么某种土壤某种土壤适合于种植适合于种植某种植物某种植物)。(来自：来自：A A值值/N Ndfsdfs=N Nf f/N Ndffdff)9 9、N N素回收率：素回收率：R R回回 =已检出的已检出的N Nf f量量/N Nf f100%(9)100%(9)10 10、N N素损失率：素损失率：R R失失 =100%-=100%-R R回回 (10)(10)以上公式适用以上公式适用3232P P等放射性物质（以比强为单位）等放射性物质（以比强为单位）等计算。等计算。练练习习题题：蕃蕃茄茄实实验验地地中中施施用用1515N-N-尿尿素素纯纯N20Kg/N20Kg/亩亩，收收获获后后测测得得植植物物含含N N量量为为3030Kg/Kg/亩亩，植植物物样样品品的的1515N N丰丰度度为为0.67%0.67%，1515N-N-尿尿素素的的1515N N丰丰度度为为1.37%1.37%，设自然丰度为设自然丰度为0.37%0.37%，尿素的含，尿素的含N N量为量为40%40%。求：求：1 1、每亩施入尿素量？、每亩施入尿素量？2 2、肥料、肥料N N素的利用率？素的利用率？3.3.A A值值?解：解：apap=0.67-0.37=0.3%=0.67-0.37=0.3%afaf=1.37-0.37=1.0%=1.37-0.37=1.0%NdffNdff=apap/afaf=0.3/1.0=30%=0.3/1.0=30%NpfNpf=NpNpNdffNdff=30Kg/=30Kg/亩亩30%=930%=9Kg/Kg/亩亩 施入尿素量：施入尿素量：W=20/40%=W=20/40%=80Kg/80Kg/亩亩 肥料肥料N N素利用率：素利用率：R=R=NpfNpf/NfNf=9/20=9/20=45%45%A A值值=NdfsNdfs/NdffNdffNfNf=70%/30%=70%/30%20Kg/20Kg/亩亩=46.746.7Kg/Kg/亩亩（土土壤壤中中可可供供蕃蕃茄茄生生长长的的每每亩亩有有效效N-N-当当然然不不是是全全部部被被吸吸收收,A A值值愈愈大大说说明明土土壤的供壤的供N N能力愈强）能力愈强）下列研究方法：下列研究方法：1.测根瘤数目和干物质产量。早、有无？测根瘤数目和干物质产量。早、有无？2.氮素平衡法。十分烦琐。氮素平衡法。十分烦琐。3.比较固比较固N作物和非固作物和非固N作物总作物总N量差异。量差异。4.4.乙炔还原法。简单、灵敏。乙炔还原法。简单、灵敏。5.5.乙炔还原成乙烯，存在转换因子（乙炔还原成乙烯，存在转换因子（3个）。个）。1515N N示踪与生物固氮示踪与生物固氮(以下各方法简讲以下各方法简讲)工工业业固固氮氮（HaberHaber-Bosch-Bosch反反应应）：N N2 2+3H+3H2 2 催催化化剂剂/45/45，200200在气压在气压 2 2NHNH3 3生生物物固固氮氮：N N2 2+6H+6H+xATP xATP 6e6e-/固固氮氮酶酶 2NH3+xADP+xPi6.同位素法：同位素法：15N2还原法还原法（Burris,1941）:充充15N2密室进行密室进行NdfA=a样样/a气气100%固氮量固氮量=NdfA总总N N量量同同位位素稀释法素稀释法（J J、O O、LeggLegg等，等，19751975），），1515N N施入土壤施入土壤 NdfANdfA=1-=1-a a固固/a a非非A AN N值法值法（M M、FriedFried等，等，19751975），田间种固），田间种固N N、非固非固N N NdfANdfA=(As+=(As+AfixAfix-As)-As)NdfFNdfF/AfAf AsAs、AfAf、AfixAfix分别代表土壤、肥料、大豆有效分别代表土壤、肥料、大豆有效N N量。量。NdfFNdfF:来自肥料来自肥料N N素的比例。素的比例。八、八、1313C C示踪法示踪法1 1样品的制备：样品的制备：（1 1）样样品品碳碳转转化化为为BaCOBaCO3 3：干干氧氧化化法法（PreglPregl）:如上图如上图 湿湿 氧氧 化化 法法（Weinhouse Weinhouse 19481948）(2(2）BaCOBaCO3 3COCO2 2转转化化：BaCOBaCO3 3+0.5%+0.5%HClHCl:饱和饱和NaClNaCl(1:4)(1:4)(真空、冷却真空、冷却)2 2测测量量：COCO2 2在在质质谱谱中中经经电电子子轰轰击击产产生生多多种分子离子和原子离子。种分子离子和原子离子。1313C%=1/R+1C%=1/R+1100%R=45/44100%R=45/44其其 中中：4545示示 （1313C C1616O O1616O O）+和和（1212C C1616O O1717O O）+，4444示示 1212C C1616O O1616OO+（m/em/e）,（1212C C1616O O1717O O）+可可用用校正峰解决。校正峰解决。九九.1818O O示踪法：示踪法：样样品品制制备备：也也是是转转化化成成COCO2 2，很很少少用用O O2 2、N N2 2O O2 2、NONO2 2。如如：平平衡衡法法：H H2 21818O+CO+C1616O O2 2=H=H2 21616O+CO+C1818O O2 2 碳碳酸酸盐盐与与酸酸反反应应，直直接接放放出出C C1818O O2 2。硅硅酸酸盐盐（20002000真真空空炉炉）1818O O2 2和和C C反反应应成成C C1818O O2 2，1 1：1HgCl:Hg1HgCl:Hg（CNCN）2 2氧氧 化化 有有 机机 样样 品品（Aubar等等1955）测测定定：记记录录44（1212C C1616O O1616O O）+和和46461212C C1616O O1818OO+离离子子流强度：流强度：1818O%O%=1/2R+1100%R=44/46有有时时也也取取：R=32/34（O2样样品品）R=28/30（1212C C1616O O+）（）（1212C C1818O O）+十十.2 2H H示踪法：示踪法：样样品品制制备备：有有机机态态HHHH2 2O1000O1000锡锡丝丝H H2 2或直接把或直接把H H2 2O O引入质谱（低丰度不宜）引入质谱（低丰度不宜）测定：记录测定：记录33（HDHD）+和和22（H H2 2）+2 2H%=1/2R+1H%=1/2R+1100%R=2/3100%R=2/3 7
