欧蒙印迹法检测ANA抗核抗体 实验报告.pdf
实验实验 1 1：抗：抗 ANAANA 自身抗体的检测（欧蒙斑点法）自身抗体的检测（欧蒙斑点法）一、实验目的及原理一、实验目的及原理抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是一组针对细胞核成分的自身抗体。ANA 阳性提示患有自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、混合性结缔组织病、干燥综合症、全身性硬皮病、原发性胆汁性肝硬化等。根据细胞内各分子的理化特性和分布部位，ANA 可分为抗 DNA 抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体和抗其他细胞成分抗体。在本实验中，抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒（欧蒙印迹法）的检测模条上平行包被了高度纯化的自身抗原。用于体外定性检测人血清或血浆中的抗nRNP/Sm、Sm、SS-A（天然 SS-A 和 Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1)CENPB、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P 蛋白和 AMAM2 共 14 种不同抗原 IgG类抗体。欧蒙印迹法的实验原理如下：样本血清与包被抗原的检测膜条温育，如果标本为阳性血清，则血清中的自身抗体将与膜条相应位点上的自身抗原特异性结合。洗膜后添加碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗人 IgG（二抗），将与结合在膜条相应抗原位点上的自身抗体（一抗）结合，形成抗原-1st Ab-2nd Ab 复合物。最后，加入酶底物 NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-磷酸盐）显色，阳性血清在对应膜条抗原条带处原位可形成蓝紫色的化合物沉淀。二、实验材料二、实验材料1.包被抗原的检测膜条2.nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、PMScl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体 P 蛋白3.阳性对照：人 IgG，100 倍浓缩，4.酶结合物：碱性磷酸酶标记的羊抗人 IgG，10 倍浓缩，1x3ml5.样本缓冲液，直接使用，1x100ml6.清洗缓冲液，10 倍浓缩，1x 50ml7.底物液：NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-3-吲哚-磷酸盐），直接使用，130ml8.温育盘 2x8 槽三、实验步骤三、实验步骤（一）预处理试剂盒平衡至室温 30 分钟后使用，取出膜条。清洗缓冲液，10 倍稀释：30mL 清洗缓冲液+270mL DW，50ml/支分装。血清样本，使用前 101X 稀释：血清 210uL+21mL 样本缓冲液10mL/支，分装 2 支；按排一组作阳性对照：阳性对照+2ml 样本缓冲液。AKP-羊抗人 IgG，使用前 10 倍稀释：AKP-羊抗人 IgGmL+样本缓冲液10mL/支，分装 2 支。（二）正式处理1.预处理 5min用镊子取出膜条，数字面朝上放入温育槽中，每槽中加入样本缓冲液；常温 摇床震荡 5min。2.抗原和血清（1st 抗体）温育 30min枪头吸去槽内液体，在温育槽中分别加入已稀释血清，常温，摇床震荡30min。3.清洗 15min用枪头吸去槽内液体，在摇摆摇床上用 清洗缓冲液清洗膜条 3 次，每次 5min。4.加 10X 稀释的酶结合物（二抗），抗原-抗体-羊抗人 IgG（二抗）温育 30min吸去槽内液体，在槽内分别加入 ml 酶结合物。常温 摇床震荡 30min。5.清洗 15min用枪头吸去槽内液体，在摇摇床上用 清洗缓冲液清洗膜条 3 次，每次 5 分钟。6.加底物溶液，反应 10min吸去槽内液体，在槽内分别加入 ml 底物液。常温，摇床震荡 10min。7.蒸馏水终止反应吸去槽内液体，用蒸馏水清洗 3 次，次，1（三）判读结果/次。风干 15 min。膜条干后，肉眼观察条带颜色强度；对照膜条上包被抗原位置，决定阳性抗体的种类。质控带出现强的颜色反应说明实验操作正确。膜条包被抗原的位置上出现的白色条带应判为阴性；阳性反应在抗原包被区呈兰色或紫色条带。抗原带着色与质控带强度相同为强阳性、中到较强为阳性、非常弱为可疑、无色为阴性。四、实验结果四、实验结果第 8 组条带如图 1 所示（从左至右数第一列）。结果判读示意图如图 2 所示。图 1.本次实验膜条条带图 2.结果示意图根据结果示意图，本次实验在质控带上出现了深紫色条带，位于从上往下数的第一区域，说明实验操作正确。本组膜条上出现强阳性的条带有三条，分别位于从上往下数的第二区域（1条）和第九区域（2 条），条带呈深紫色。对照结果示意图，说明本实验所用患者血清的抗 SS-A、抗 Ro-52 以及抗核糖体 P 蛋白抗体为强阳性。膜条上出现弱阳性的条带有一条，位于从上往下数的第八区域，条带呈淡蓝色。对应结果示意图，可知本实验所用患者血清的抗 SS-B 抗体为弱阳性。另外，膜条从上往下数第四区域出现一条白色条带，所对应检测的抗体为抗dsDNA 抗体。根据结果判读原则，应判为阴性。五、分析与讨论五、分析与讨论（一）实验结果分析由上述结果判读发现，本实验所用患者血清的抗 SS-A、抗 Ro-52 以及抗核糖体 P 蛋白抗体为强阳性，抗 SS-B 抗体为弱阳性。SS-A 抗原属于小核糖核酸蛋白，参与 mRNA 转变为有翻译活性分子。抗 SS-A抗体常见于干燥综合症、（阳性率 40%-80%）、系统性红斑狼疮（30%-40%）、原发性胆汁性肝硬化（10-20%）。抗 Ro-52 是抗 SS-A 抗体的其中一类（抗 SS-A 包括抗 Ro52 和抗 Ro60 两种自身抗体），常见于干燥综合征、系统性红斑狼疮。抗 Ro-52如果阳性则提示复发或者优先于其它指标预警，起到预防提示作用。SS-B 抗原是细胞核中作为 RNA 多聚酶 III 的辅蛋白，研究表明 SS-B 抗原决定簇是 SS-A 抗原的一部分，故 SS-B 抗体常伴随 SS-A 抗体一起出现。抗 SS-B 抗体几乎仅见于干燥综合症（阳性率 40%-80%）和系统性红斑狼疮（10%-20%）的女性患者中。抗核糖体 P 蛋白抗体（ARPA），则是系统性红斑狼疮的特异性抗体。SLE 的活动性与ARPA的效价不具有相关性，对于有中枢神经系统症状、肾炎或肝炎的SLE 患者，ARPA的阳性率与整个 SLE 人群基本相同。因此，根据不同抗核抗体所提示的疾病，以及该患者的抗核抗体谱，初步推断该患者患有自身免疫疾病，并且可能是系统性红斑狼疮（SLE）。若要明确诊断 SLE，除了抗核抗体检测之外，还需要根据患者的临床表现（如皮肤狼疮、口鼻咽部溃疡），是否有肾脏、神经病变，是否有外周白细胞或淋巴细胞减少等信息，来进一步判断。在美国风湿协会（ACR）提出的 SLE 分类标准中，需同时根据临床分类标准和免疫学标准作出诊断。（二）关于实验操作及结果判读的讨论本次实验的膜条背景较浅，利于结果的判读。有资料显示，在清洗时间一定的情况下，欧蒙印迹法中使用的摇床类型对于背景颜色有所影响，优先使用垂直振荡的摇摆摇床。若使用水平振荡摇床，由于液体受力作用向两侧集中，形成典型的“哑铃状”液体分布，可能使得膜条中部的抗原和抗体反应性下降，或者膜条洗涤不充分，导致膜条背景加深，影响实验结果判读。作为核酸分子，dsDNA 抗原与其他蛋白质抗原具有完全不同的带电荷能力。因此，dsDNA 抗原包被的位置不易与血清样本中的其他物质结合。当样本为dsDNA 阴性时，抗原包被区域反应较弱或者无反应，而同一膜片上的其它区域由于吸附少量杂质导致背景加深，从而形成 dsDNA 条带发白的现象。出现上述实验结果时，样本可判断为明确可靠的阴性结果。【参考资料】王莉等,抗 Ro52 抗体和抗 Ro60 抗体的临床应用价值探讨.华西医学,2014.29(05):第 879-882 页.李圣楠与 黄慈波,系统性红 斑狼疮的 诊断 治疗进展.临床药物 治疗杂志,2010(01):第 6-10 页.王炜玮等,欧蒙免疫印迹法在实验操作中常见问题处理及结果评价.山西医药杂志,2015(05):第 521-523 页.
