实验五 小麦萌发前后淀粉酶活力的.ppt
实验五实验五 小麦萌发前后淀粉小麦萌发前后淀粉酶活力的比较酶活力的比较一、实验目的一、实验目的n1学习测定淀粉酶活力的方法。学习测定淀粉酶活力的方法。n2了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。二、实验原理二、实验原理n休眠种子中主要含有休眠种子中主要含有-淀粉酶淀粉酶，而，而-淀淀粉酶是在萌发过程中形成的。种子萌发粉酶是在萌发过程中形成的。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。n-淀粉酶水解非还原端的第二个淀粉酶水解非还原端的第二个-1,4-糖苷键，水解产物为糖苷键，水解产物为麦芽糖麦芽糖。u淀粉的水解产物淀粉的水解产物麦芽糖麦芽糖有还原性能与有还原性能与3 3，5-5-二二硝基水杨酸硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成试剂反应，使其还原生成红色红色3-3-氨氨基基-5-5-硝基水杨酸。硝基水杨酸。u在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。量表示酶活力。三、试剂三、试剂 n1.0.1标准麦芽糖溶液标准麦芽糖溶液20毫升：精确称量毫升：精确称量100毫克麦芽糖，用少量水溶解后，移入毫克麦芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。容量瓶中，加蒸馏水至刻度。n2pH6.9，0.02摩尔摩尔L磷酸缓冲液磷酸缓冲液100毫毫升升n31淀粉溶液淀粉溶液100毫升：毫升：1克可溶性淀粉溶克可溶性淀粉溶于于100毫升毫升0.02摩尔摩尔L磷酸缓冲液，其中含磷酸缓冲液，其中含有有0.006摩尔摩尔L氯化钠氯化钠。n413,5-二硝基水杨酸试剂二硝基水杨酸试剂:1g3,5-二硝基水杨酸溶于二硝基水杨酸溶于20毫升毫升2摩尔摩尔L的氢的氢氧化钠溶液和氧化钠溶液和50毫升水中；再加人毫升水中；再加人30克克酒石酸钾钠，定容至酒石酸钾钠，定容至100毫升。若溶液毫升。若溶液混浊，可过滤。混浊，可过滤。n51氯化钠溶液氯化钠溶液300毫升毫升n6海砂海砂5克克四、操作步骤四、操作步骤n1 1种子发芽：种子发芽：n小麦种子浸泡小麦种子浸泡2.5h后，放人后，放人25恒温箱内或恒温箱内或在室温下发芽。在室温下发芽。n 2 2 酶液提取：酶液提取：n取发芽第三天或第四天的幼苗取发芽第三天或第四天的幼苗15株，放人株，放人乳钵内，加适量石英砂，加乳钵内，加适量石英砂，加1氯化钠溶液氯化钠溶液10毫升，用力磨碎。在室温下放置毫升，用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅分钟，搅拌几次。将提取液离心（拌几次。将提取液离心（1500转转min）67分钟。分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。总体积。进行酶活力测定时，进行酶活力测定时，将酶提取液用将酶提取液用Ph6.9的磷酸缓冲液稀释的磷酸缓冲液稀释10倍。倍。n取干燥种子取干燥种子15粒作为对照（提取步骤同上）。粒作为对照（提取步骤同上）。n3 3酶活力测定：酶活力测定：n（1）取）取25毫升刻度试管毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂（各支。编号。按下表要求加人各试剂（各试剂须试剂须25预热预热10分钟）。分钟）。1（干种子）（干种子）2（湿种子）（湿种子）3（标准管）（标准管）4（空白管）（空白管）酶液酶液0.50.5-标准麦芽标准麦芽糖溶液糖溶液-0.5-淀粉溶液淀粉溶液1111蒸馏水蒸馏水-0.5n将各管混匀，放在将各管混匀，放在25，水浴中保温，水浴中保温3分钟后，分钟后，立即向各管中加人立即向各管中加人13，5-二二硝基水杨酸溶液硝基水杨酸溶液2毫升毫升。（？）（？）n（2）取出各试管，放人沸水浴中加热）取出各试管，放人沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至分钟。冷至室温，加水稀释至25毫升。毫升。将各管充分混匀。将各管充分混匀。n（3）用空白管作对照；在）用空白管作对照；在500nm处测处测定各管的光吸收值，记录结果。定各管的光吸收值，记录结果。n4 4计计 算算n本实验规定：本实验规定：25时时3min3min内水解淀粉释放内水解淀粉释放1mg1mg麦芽糖所需的酶量麦芽糖所需的酶量为为1 1个酶活力单位（个酶活力单位（U U）。）。n根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A标准标准A未知未知C标标准准C未知未知nC（酶液管浓度）（酶液管浓度）A酶酶C标准标准A标准标准n则则15粒种子或幼苗的总活力单位粒种子或幼苗的总活力单位=C酶酶N酶酶V酶酶nN为酶液的稀释倍数为酶液的稀释倍数nV为提取酶液的总体积为提取酶液的总体积
