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实验指导实验指导指导老师：习欠云指导老师：习欠云实验十一实验十一外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达实验目的实验目的 了解了解IPTGIPTG（异丙基（异丙基-D-D-硫代吡喃半乳糖）诱导硫代吡喃半乳糖）诱导的外源基因在大肠杆菌中的表达的原理，掌握外源的外源基因在大肠杆菌中的表达的原理，掌握外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测技术。基因在大肠杆菌中的表达及其检测技术。实验原理实验原理 将外源基因克隆在含有将外源基因克隆在含有laclac启动子的表达载体中，让其在大启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。肠杆菌中表达。没有加入没有加入IPTGIPTG诱导剂的时候，诱导剂的时候，laclac产生的阻遏蛋白与产生的阻遏蛋白与laclac操纵子结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，而只有表操纵子结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，而只有表达载体随大肠杆菌的增殖和复制：当加入达载体随大肠杆菌的增殖和复制：当加入IPTGIPTG后，阻遏蛋白不后，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则能与操纵基因结合，则DNADNA外源基因大量转录并高效表达。表达外源基因大量转录并高效表达。表达的蛋白可以通过的蛋白可以通过SDS-PAGESDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行初步鉴定。泳）进行初步鉴定。LacLac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNADNA分子分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacILacI)、启、启动基因动基因(P)(P)、操纵基因、操纵基因(O)(O)和编码和编码3 3个与乳糖利用有关的酶个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。的基因结构所组成。LacLac启动子受分解代谢系统的正调控启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(cataboliteCAP(catabolite gene gene activation protein)activation protein)因子和因子和cAMPcAMP来激活启动子，促使转来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生录进行。负调控则是由调节基因产生LacZLacZ阻遏蛋白，该阻阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTGIPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。乳糖启动子乳糖启动子实验内容实验内容材料：材料：大肠杆菌菌株大肠杆菌菌株DH5和和BL21以及表达载体以及表达载体PET-32PET-32（+）主要试剂：主要试剂：LB LB平板（含平板（含5050g/mlg/ml的卡那霉素），的卡那霉素），100mMIPTG,10mg/ml100mMIPTG,10mg/ml的溶菌酶（的溶菌酶（10mM Tris-10mM Tris-HCl,pH8.0HCl,pH8.0配制）。配制）。Amp Amp（氨苄青霉素）贮存液：用三蒸水配成（氨苄青霉素）贮存液：用三蒸水配成100mg/ml,100mg/ml,用用0.22m0.22m滤膜过滤除菌，分装滤膜过滤除菌，分装后后-20-20保存。保存。LB LB液体培养基：液体培养基：10g Trptone,5g Yest Extract,10g NaCl,10g Trptone,5g Yest Extract,10g NaCl,加去离子水定容至加去离子水定容至1000ml,1000ml,高压灭菌，冷却后高压灭菌，冷却后44保存。保存。LA LA液体培养基：液体培养基：10g Trptone,5g Yest Extract,10g NaCl,10g Trptone,5g Yest Extract,10g NaCl,加去离子水定容至加去离子水定容至1000ml,1000ml,高压灭菌，待灭菌好的培养基温的度降至高压灭菌，待灭菌好的培养基温的度降至6060左右时，加入左右时，加入AmpAmp至浓度至浓度100g/ml100g/ml，44保存。保存。LB LB固体培养基：在固体培养基：在LBLB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度液体培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5%1.5%（w wv)v)，高压灭菌，冷却至约，高压灭菌，冷却至约5050后分装如灭菌平皿中，后分装如灭菌平皿中，凝固后凝固后44保存。保存。LA LA固体培养基：待灭菌好的固体培养基：待灭菌好的LBLB固体培养基的温度降至固体培养基的温度降至6060左右时，加入左右时，加入AmpAmp至终浓度至终浓度100g/ml100g/ml，摇匀后分装入灭菌平，摇匀后分装入灭菌平皿中，凝固后皿中，凝固后44保存。保存。50 50TAE:750mlTAE:750ml去离子水中加入去离子水中加入242gTris,57.1ml 242gTris,57.1ml 乙酸，乙酸，NaNa2 2EDTA 37.2g,EDTA 37.2g,用去离子水定容至用去离子水定容至1000ml1000ml。IPTG IPTG（1mol1molL):8mlL):8ml去离子水溶解去离子水溶解2.3831gIPTG2.3831gIPTG后定容至后定容至10ml10ml，再用，再用0.220.22mm滤膜过滤除菌分装入滤膜过滤除菌分装入1.5ml Eppendenf1.5ml Eppendenf灭灭菌离心管中，菌离心管中，-20-20保存。保存。实验仪器与设备实验仪器与设备 空气摇床，生化生化陪养箱空气摇床，生化生化陪养箱 Eppendenf 5804R Eppendenf 5804R 低温高速离心机低温高速离心机 Eppendenf Gentrifuge 5410D Eppendenf Gentrifuge 5410D 台式高速离心机台式高速离心机 Eppendenf BiopHotometer Eppendenf BiopHotometer METTLER TOLEDO AB204-E METTLER TOLEDO AB204-E分析天平分析天平 TS-1 TS-1脱色摇床脱色摇床 超净工作台超净工作台 水浴摇床水浴摇床 垂直电泳槽垂直电泳槽 凝胶成像系统凝胶成像系统 操作步骤操作步骤1 1 大肠杆菌大肠杆菌BL-21BL-21感受态细胞的制备。感受态细胞的制备。2 2 重组质粒重组质粒pET-32pET-32（+）-actRBactRB转化到大肠杆菌转化到大肠杆菌BL-21BL-21细细胞。胞。3 3 将含有重组表达载体将含有重组表达载体pET-pET-3232（+）-actRBactRB和空表达载和空表达载体体pET-32(+)pET-32(+)的大肠杆菌的大肠杆菌BL21BL21划线接种在划线接种在LBLB平板上，平板上，3737培养过夜，直至平板上生出菌落。培养过夜，直至平板上生出菌落。4 4 挑取单菌落至挑取单菌落至5mlLB5mlLB液体培养基中，培养至液体培养基中，培养至OD600=0.6OD600=0.6左右，左右，44放置过夜。放置过夜。5 5 将将LB-PET-LB-PET-3232（+）-actRBactRB菌液接种到菌液接种到3mlLA3mlLA液体培养液体培养基中，基中，3737，200rpm200rpm振摇培养过夜。振摇培养过夜。6 6 取取100L100L培养过夜的菌液接种到培养过夜的菌液接种到3mlLA3mlLA液体培养液中，液体培养液中，3737，200rpm200rpm振摇培养至振摇培养至OD600OD600至至0.6-0.80.6-0.8时，加入时，加入1M1M的的IPTG,IPTG,使使IPTGIPTG终浓度分别为终浓度分别为1mM,1mM,置置3737摇床继续诱导培养摇床继续诱导培养6h6h，收集菌体置，收集菌体置-20-20保存备用。保存备用。7 7 另取不含目的基因片段的质粒另取不含目的基因片段的质粒pET-32pET-32（+）转化转化BL21BL21感感受态细胞做相同处理，加受态细胞做相同处理，加IPTGIPTG诱导诱导6h6h作对照。作对照。注意事项注意事项1 1 大肠杆菌的表达水平与大肠杆菌的表达水平与IPTGIPTG浓度、诱导时间、温度以及宿浓度、诱导时间、温度以及宿主菌的生长状体有关。当表达量不高时，可以调节主菌的生长状体有关。当表达量不高时，可以调节IPTGIPTG的的浓度、诱导时间和温度，甚至重新转化。浓度、诱导时间和温度，甚至重新转化。2 2 菌液的菌液的ODOD值要摇到值要摇到0.6-0.80.6-0.8，否则会直接影响到蛋白的表，否则会直接影响到蛋白的表达量。达量。思考题思考题1 1、哪些因素会影响大肠杆菌的表达？、哪些因素会影响大肠杆菌的表达？2 2、IPTGIPTG诱导蛋白表达原理？诱导蛋白表达原理？实验十二实验十二目标蛋白的目标蛋白的PAGE检测检测实验目的实验目的 了解蛋白质分离纯化及检测方法了解蛋白质分离纯化及检测方法实验原理实验原理 不同的蛋白质分子具有不同的电荷和分子量。蛋白质在强阴不同的蛋白质分子具有不同的电荷和分子量。蛋白质在强阴离子去污剂离子去污剂SDSSDS与某一还原剂（如二巯基乙醇）共同作用下并加热与某一还原剂（如二巯基乙醇）共同作用下并加热使蛋白质解离后，变性的蛋白质与使蛋白质解离后，变性的蛋白质与SDSSDS结合并因此而带负电荷，不结合并因此而带负电荷，不同的蛋白质结合同的蛋白质结合SDSSDS的量仅与分子量成正比而与氨基酸的序列无关，的量仅与分子量成正比而与氨基酸的序列无关，在在SDS-PAGESDS-PAGE电泳时，蛋白质在聚丙烯酰胺中的迁移率仅仅取决于电泳时，蛋白质在聚丙烯酰胺中的迁移率仅仅取决于蛋白质的分子量。蛋白质的分子量。聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联体聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联体N,NN,N-亚甲基亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成三维网状结构。凝胶电泳不仅双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成三维网状结构。凝胶电泳不仅具有分辨不同分子量蛋白质的作用，还具有浓缩作用。由于不连具有分辨不同分子量蛋白质的作用，还具有浓缩作用。由于不连续缓冲系统具有把样品中的续缓冲系统具有把样品中的SDS-SDS-多肽复合物全部浓缩于极小体积多肽复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而提高了分辨率。采用考马斯亮蓝快速染色，可以及的能力，从而提高了分辨率。采用考马斯亮蓝快速染色，可以及时观察电泳分离的效果。时观察电泳分离的效果。实验试剂实验试剂 30%30%（w w/v/v）凝胶贮存液：丙烯酰胺）凝胶贮存液：丙烯酰胺29g29g，亚甲基双丙烯酰，亚甲基双丙烯酰胺胺1g1g，加，加ddHddH2 2O O溶至溶至100ml100ml，用新华，用新华3 3号滤纸过滤，棕色瓶中号滤纸过滤，棕色瓶中44保存，（丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套和口保存，（丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套和口罩）。罩）。1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl、0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl、10%SDS10%SDS、10%10%过硫酸铵、过硫酸铵、TEMEDTEMED。Tris-Tris-甘氨酸电泳缓冲液，甘氨酸电泳缓冲液，pH8.3pH8.3，可配成，可配成5 5贮存液备用，贮存液备用，临用前稀释。临用前稀释。工作液工作液 5 5贮存液贮存液 Tris Tris碱碱 25mmol 25mmol/L Tris/L Tris碱碱 15.1g 15.1g 甘氨酸甘氨酸 250 250mmolmmol/L/L（pH8.3pH8.3）甘氨酸甘氨酸 94g 94g SDS 0.1%10%SDS 50ml SDS 0.1%10%SDS 50ml 加加ddHddH2 2O O定容至定容至1000ml1000ml 样品处理液样品处理液 Deionized water 3.8ml 0.5mol/L Tris-HCl pH6.8 1.0ml0.5mol/L Tris-HCl pH6.8 1.0ml Gglycerol 0.8ml Gglycerol 0.8ml 10%10%（w w/v/v）SDS 1.6mlSDS 1.6ml 2-mercaptoethanol 0.4ml 2-mercaptoethanol 0.4ml 1%1%（w w/v/v）bromophenol blue 0.4mlbromophenol blue 0.4ml染色液染色液 0.4%0.4%考马斯亮蓝考马斯亮蓝-R250-R250染色液染色液 甲醇甲醇 400ml 400ml 冰乙酸冰乙酸 100ml 100ml 考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250 1g R250 1g 加加ddHddH2 2O O定容至定容至1000ml1000ml脱色液脱色液 甲醇甲醇 400ml 400ml 冰乙酸冰乙酸 100ml 100ml ddH ddH2 2O 500mlO 500mlSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液配方聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液配方（1 1）30%30%凝胶贮备液：凝胶贮备液：29%29%丙烯酰胺，丙烯酰胺，1%1%亚甲基双丙烯酰胺，亚甲基双丙烯酰胺，用去离子水配制后用去离子水配制后0.450.45mm的硝酸纤维素膜过滤，的硝酸纤维素膜过滤，44避光避光保存。每隔几个与须重新配制。保存。每隔几个与须重新配制。（2 2）10%SDS10%SDS：用：用200ml200ml水溶解水溶解25g25g电泳级电泳级SDSSDS，加热到，加热到6868并并用磁力搅拌器搅拌至溶解，加入浓用磁力搅拌器搅拌至溶解，加入浓HClHCl调节调节pHpH值至值至7.27.2，再，再定容至定容至250ml250ml，室温保存。，室温保存。（3 3）10%10%过硫酸铵：在过硫酸铵：在5ml5ml水中溶解水中溶解0.5g0.5g过硫酸铵。（过硫酸铵。（APAP，新鲜配制）。新鲜配制）。（4 4）Tris-Tris-甘氨酸电泳缓冲液（甘氨酸电泳缓冲液（5 5）：在）：在900ml900ml去离子水中去离子水中溶解溶解15.1gTris15.1gTris碱和碱和94g94g甘氨酸，然后加入甘氨酸，然后加入50ml 10%50ml 10%电泳级电泳级SDSSDS贮存液，用去离子水定容至贮存液，用去离子水定容至1000ml1000ml后常温保存。后常温保存。（5)25)2SDSSDS凝胶上样缓冲液：在凝胶上样缓冲液：在40ml40ml去离子水中溶解去离子水中溶解1.211g Tris1.211g Tris碱、碱、20ml20ml甘油、甘油、4gSDS4gSDS、3.1gDTT3.1gDTT与与10mg10mg溴酚蓝，溴酚蓝，用用1mol/L HCl1mol/L HCl调节调节pHpH值至值至6.86.8后加入去离子水定容至后加入去离子水定容至100ml100ml，-80-80保存。保存。（6 6）考马斯亮蓝染色液：）考马斯亮蓝染色液：200ml200ml甲醇，甲醇，50ml50ml冰乙酸，冰乙酸，0.5g0.5g考考马斯亮蓝马斯亮蓝R250,250mlR250,250ml去离子水。用去离子水。用Whatman1Whatman1号滤纸过滤后室号滤纸过滤后室温无限保存。温无限保存。（7 7）脱色液）脱色液:250ml:250ml甲醇，甲醇，80ml80ml冰乙酸，冰乙酸，680ml680ml去离子水。去离子水。（8 8）1.5mol/L Tris-HCl1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8pH8.8）分离胶缓冲液：）分离胶缓冲液：18.165g 18.165g TrisTris碱，溶解于碱，溶解于40ml40ml水后用水后用1mol/L HCl1mol/L HCl调节调节pHpH值至值至8.88.8，加，加水定容至水定容至100ml100ml后用后用0.45m0.45m滤膜过滤滤膜过滤44保存。保存。（9 9）1mol/L Tris-HCl1mol/L Tris-HCl（pH6.8pH6.8）积层胶缓冲液：）积层胶缓冲液：12.11g 12.11g TrisTris，溶解于，溶解于40ml40ml水后用水后用1mol/L HCl1mol/L HCl调节调节pHpH值至值至6.86.8，加水，加水定容至定容至100ml100ml后用后用0.45m0.45m滤膜过滤滤膜过滤44保存。保存。实验操作实验操作（1 1）样品处理）样品处理 取取1ml1ml菌液，菌液，10000rpm10000rpm离心离心1min1min，弃上清，重悬于，弃上清，重悬于5050LL去离子水，加入去离子水，加入5050LL 2 2SDSSDS凝胶上样缓冲液，涡凝胶上样缓冲液，涡旋混匀，旋混匀，100100加热加热10min10min，10000rpm10000rpm离心离心3min3min备用。备用。（2 2）SDS-PAGESDS-PAGE凝胶的制备凝胶的制备 按下列配方组成配制按下列配方组成配制4ml 12%4ml 12%分离胶分离胶 12%12%的蛋白质的蛋白质SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离层配方聚丙烯酰胺凝胶分离层配方 成分成分 体积体积/mL/mL 水水 1.6 1.6 30%30%丙烯酰胺混合液丙烯酰胺混合液 1.32 1.32 1.5mol/L Tris 1.5mol/L Tris（pH8.8pH8.8）1 1 10%SDS 0.04 10%SDS 0.04 10%10%过硫酸铵过硫酸铵 0.04 0.04 TEMED 0.002 TEMED 0.002 一旦加入一旦加入TEMED,TEMED,混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃间混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃间隙中，注意为浓缩胶留有足够的空间（约隙中，注意为浓缩胶留有足够的空间（约1 1/3/3空隙体积）。轻轻在空隙体积）。轻轻在其顶层加入其顶层加入1ml1ml去离子水，阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作去离子水，阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用并磨平胶平面。用并磨平胶平面。聚合完成之后，倒掉覆盖在凝胶上层的水，用滤纸吸干凝胶顶聚合完成之后，倒掉覆盖在凝胶上层的水，用滤纸吸干凝胶顶层的残存液体。层的残存液体。按下列配方组成配制按下列配方组成配制1ml 5%1ml 5%浓缩胶浓缩胶 5%5%的蛋白质的蛋白质SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩层配方聚丙烯酰胺凝胶浓缩层配方 成分成分 体积体积/mL/mL 水水 0.675 0.675 30%30%丙烯酰胺混合液丙烯酰胺混合液 0.1675 0.1675 1.0mol/L Tris 1.0mol/L Tris（pH6.8pH6.8）0.125 0.125 10%SDS 0.01 10%SDS 0.01 10%10%过硫酸铵过硫酸铵 0.01 0.01 TEMED 0.001 TEMED 0.001 将浓缩胶灌入分离胶上面，插入梳子，垂直放置于室温下将浓缩胶灌入分离胶上面，插入梳子，垂直放置于室温下 浓缩胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳子。将凝胶放入浓缩胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳子。将凝胶放入电泳槽上，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子。电泳槽上，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子。（3 3）电泳）电泳 安装好电泳槽，把电泳槽置于冰盒内，将电极插头与适安装好电泳槽，把电泳槽置于冰盒内，将电极插头与适当的电极相连。当的电极相连。开始时电压为开始时电压为60V60V，染料进入分离胶后，将电压增加到，染料进入分离胶后，将电压增加到90V90V，继续电泳直到染料到达分离胶底部，断开电源。，继续电泳直到染料到达分离胶底部，断开电源。取下凝胶，将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中放摇床上缓取下凝胶，将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中放摇床上缓慢旋转慢旋转3-4h3-4h或过夜。或过夜。换掉并回收染色液。用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动换掉并回收染色液。用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动4-8h4-8h，其间换液，其间换液3-43-4次。继续脱色，直到满意为止。次。继续脱色，直到满意为止。用凝胶成像系统对凝胶进行照相和分析。用凝胶成像系统对凝胶进行照相和分析。注意问题注意问题（1）胶脱色不能脱的太久，虽然越脱越清楚，但脱的太久了，）胶脱色不能脱的太久，虽然越脱越清楚，但脱的太久了，弱带就看不见了，胶也会变的失真，这样的胶照出的照片是弱带就看不见了，胶也会变的失真，这样的胶照出的照片是很难被接受的。如果样品条带或点不是很浓，就不可以脱太很难被接受的。如果样品条带或点不是很浓，就不可以脱太久。但如果要拍照，最起码要保证底色脱完全，要不然照片久。但如果要拍照，最起码要保证底色脱完全，要不然照片效果也不会好的。效果也不会好的。（2）如果需要长时间脱色，注意要换脱色液）如果需要长时间脱色，注意要换脱色液,且量要足够且量要足够,否否则甲醇挥发很快则甲醇挥发很快,胶容易干卷胶容易干卷.把本底脱干净后可以把胶放水中把本底脱干净后可以把胶放水中保存保存.半个月应该没问题；半个月应该没问题；分子克隆分子克隆：长期保存可以在水：长期保存可以在水中加中加20%的甘油。也有站友经验：考染不能长时间保存，尤的甘油。也有站友经验：考染不能长时间保存，尤其是在水里，其是在水里，3天颜色就会溶到水里。具体情况要自己摸索了。天颜色就会溶到水里。具体情况要自己摸索了。胶一般应放胶一般应放20%的甘油中长久保存（见的甘油中长久保存（见“分子克隆分子克隆”）影响蛋白质电泳分离效果的因素影响蛋白质电泳分离效果的因素1 1、蛋白质样品中的盐浓度、蛋白质样品中的盐浓度 影响蛋白条带的迁移率和带型，影响蛋白条带的迁移率和带型，因此为消除盐浓度的影响，溶解蛋白质时最好用去离子水，因此为消除盐浓度的影响，溶解蛋白质时最好用去离子水，再加等量再加等量 2 2SDS-PAGESDS-PAGE样品缓冲液，必要时经过透析或进样品缓冲液，必要时经过透析或进行行Sephader G25Sephader G25过柱。过柱。2 2、SDSSDS质量质量 由于变性蛋白质是与由于变性蛋白质是与SDSSDS结合而带负电荷，蛋结合而带负电荷，蛋白质结合白质结合SDSSDS的量与蛋白质的分子量成正比，因此质量不的量与蛋白质的分子量成正比，因此质量不同的同的SDSSDS，相同的蛋白质样品，将可能出现不同的迁移率，相同的蛋白质样品，将可能出现不同的迁移率的电泳图谱。的电泳图谱。3 3、上样孔是否平齐、上样孔是否平齐 若上样孔不平齐，也影响蛋白质电泳若上样孔不平齐，也影响蛋白质电泳的迁移率的迁移率4 4、为防止相邻永道样品的扩散，而导致电泳条带的不整齐，、为防止相邻永道样品的扩散，而导致电泳条带的不整齐，如有空置的加样孔，须加等体积的空白如有空置的加样孔，须加等体积的空白1 1SDSSDS样品缓冲液。样品缓冲液。注意事项注意事项1 1、PAGEPAGE胶作用过程中注意积层胶和浓缩胶的胶作用过程中注意积层胶和浓缩胶的比列，否则会影响电泳效果。比列，否则会影响电泳效果。2 2、制胶过程中注意各种成分加入的先后顺序，、制胶过程中注意各种成分加入的先后顺序，保证制胶质量。保证制胶质量。3 3、上样时注意每孔的上样量防止样品间相互、上样时注意每孔的上样量防止样品间相互污染。污染。思考题思考题1 1、在、在PAGEPAGE电泳过程中浓缩胶和积层胶的作用电泳过程中浓缩胶和积层胶的作用分别是什么？分别是什么？2 2、样品为何用、样品为何用SDSSDS处理，且要煮沸？处理，且要煮沸？THE END