原核生物的转录及调控.ppt

原核生物的转录原核生物的转录及其调控及其调控RNA transcription and regulation in prokaryotes转录：在在DNADNA指指导的的RNARNA聚合聚合酶催化下，以催化下，以DNADNA链的一条的一条链为模板，按照碱基配模板，按照碱基配对原原则合成合成RNARNA链的的过程程。不不对称称转录：在：在DNADNA双双链分子中，分子中，转录通常只在通常只在DNADNA的一条的一条链上上进行，另一条行，另一条链则不能不能转录，但，但可能可能对转录起起调节作用，作用，这种种转录方式称不方式称不对称称转录。转录单位位：就是从启：就是从启动子到子到终止子的一段止子的一段DNADNA序序列。列。第一节第一节 转录概述转录概述一、基因的编码链和有意义链一、基因的编码链和有意义链模板模板链：用于用于转录RNARNA的的链称称为模板模板链，或，或负（）（）链，又称无，又称无义链。编码链：与模板：与模板链互互补的的DNADNA链称称为编码链，或正（）或正（）链，又称有，又称有义链。二、转录的基本要点二、转录的基本要点底物：底物：NTP；模板：反模板：反义链；方向：方向：53；酶：RNA pol；产物：物：RNA单链转录和复制：转录和复制：都是遗传信息的传递都是遗传信息的传递三、转录起始位点三、转录起始位点转录起点位点核苷酸为转录起点位点核苷酸为1 1。上游序列上游序列upstreamupstream ：转录起点的前面的序列：转录起点的前面的序列，用负数码（）表示，用负数码（）表示，起点前一个核苷酸为起点前一个核苷酸为1 1。下游序列下游序列downstreamdownstream：转录起点的后面的序列转录起点的后面的序列，用正数码（）表示。用正数码（）表示。没有编号为没有编号为的碱基。的碱基。第二节第二节 原核生物转录的相关酶类原核生物转录的相关酶类一、一、E.coli RNA聚合聚合酶E.coli只有一种聚合只有一种聚合酶；E.coli RNA pol全全酶由由5种种亚基基组成，即成，即2，480kD；2 构成核心构成核心酶，核心核心酶与与因子构成因子构成全全酶。E.coli RNA聚合酶的基本性质聚合酶的基本性质RNA polymerase in prok.Core EnzymeHolo Enzyme for elongationfor initiation依靠静电作用力依靠静电作用力依靠空间结构依靠空间结构非专一性与非特异非专一性与非特异DNA 结合结合专一性与专一性与 特异特异DNA结合结合半衰期；半衰期；60半衰期；数小时半衰期；数小时cover60bp Richard Burgess and Andrew Travers(1969)150 kD160 kD 70 kD 40 kDCartoon illustrating separation of the subunits of E.coli RNA polymerase by SDS-PAGE1、核心酶：催化磷酸二酯键的形成、核心酶：催化磷酸二酯键的形成亚基基：2个，功能多个，功能多样（核心（核心酶的的组建因子、建因子、促促进双双链的解开和重新聚合、启的解开和重新聚合、启动子子识别、促、促进RNA pol与与DNA 模板模板链上游上游转录因子因子结合）合）亚基基：1个，个，结合核苷酸底物，催化磷酸二合核苷酸底物，催化磷酸二酯键的形成；的形成；亚基基：碱性：碱性强，与模板，与模板链结合；合；二、二、RNA聚合酶各亚基的功能聚合酶各亚基的功能2、因子因子：Reusable；修修饰 RNA pol 的构型；的构型；识别启启动子，但无催化活性。子，但无催化活性。不同原核生物具有不同原核生物具有基本相同的核心酶基本相同的核心酶，但，但亚基亚基有所差别有所差别，决定了原核生物基因的选择性表达。，决定了原核生物基因的选择性表达。3、原核生物、原核生物RNA聚合酶抑制剂聚合酶抑制剂：利福平（利福平（Rifampin）：与：与细菌菌RNA pol 亚基基结合，阻碍合，阻碍转录的的起始起始作用；作用；利利链菌素菌素（streptolydigin）：与与细菌菌RNA pol 亚基基结合，抑制合，抑制转录的的延伸延伸。肝素肝素：与：与细菌菌RNA pol 亚基基结合，阻合，阻碍其与碍其与模板模板DNA的的结合合。第三节第三节 原核生物转录的过程原核生物转录的过程RNA的的转录包括包括promotion，elongation，termination 三三过程；程；从从promoter到到terminator称称为transcriptional unit；原核生物中的原核生物中的转录单位多位多为 polycistron；转录起始点起始点记为+1，其上游，其上游记为负值，下游，下游记为正正值。+1-10+10upstreamstart pointdownstream一、转录的起始一、转录的起始关关键：全：全酶能以能以很高的很高的亲和性和性结合在合在启启动子子promoter；启启动子子：RNA聚合聚合酶识别、结合并起始合并起始转录的一段的一段DNA序列。序列。promoter 由两个重要部分组成由两个重要部分组成（一）原核启动子的结构（一）原核启动子的结构-70 -40：up element（上游元件）上游元件）CAP-cAMP binding site -35 -10：core promoter（核心启动子）核心启动子）RNA pol.binding site基因表达调控的正控制位点基因表达调控的正控制位点CAP：Catabolite gene Activator ProteincAMP Acceptor Protein（cAMP受体蛋白受体蛋白）（分解代谢基因激活蛋白分解代谢基因激活蛋白）1、核心启动子：核心启动子：Sextama Box：（R site）TTGAC（Sextama Box）-35 site。RNA pol.loosely binding sitePribnow Box：TATAAT（pribnow Box）-10 site。RNA pol.firmly binding site（B site）Initiation site：+1 site。RNA transcriptional startpoint（I site）A/G-35(R)-10(B)+1(I)RNAlSextama Box与与Pribnow Box间间距距17bp，有有利利于于RNA pol启动启动l-35 Box or-10 Box mut.间距间距趋近趋近于于17 bp，up mutation间距间距远离远离于于17 bp，down mutation17bp的的间距间距比比17bp的的序列序列对转录更为重要对转录更为重要-35 Box and-10 Box mut.转录效率下降转录效率下降100倍倍 转录效率下降转录效率下降1000倍倍2、上游元件：上游元件：CAP-cAMP binding site（Activator region，AR）当：当：ARI+CAP-cAMP AR I：CAP-cAMP 的强结合位点（的强结合位点（-70 -50）AR II：CAP-cAMP 的弱结合位点（的弱结合位点（-50 -40）cooperative effect提高提高ARII 的结合效率的结合效率IR-70 ARI-40ARII IR-50 RNA pol AR II+CAP-cAMP 复合体：复合体：促使促使-35 box附近附近GC岛区的双螺旋结构稳定性降低，岛区的双螺旋结构稳定性降低，-10 box的解链温度降低，有利于转录启动的解链温度降低，有利于转录启动ARI ARII GC Island -35 -10 Null AR II RNA pol.into-10 Box but transcription off ARII+CAP-cAMPpromotionRNA pol.into-35 Boxinto-10 Boxstarting transcription RNA pol RNA pol-CTDCAP-cAMPARI ARIIARI ARIIActivation transcription Up element+CAP-cAMP RNA PolymeraseRNA Polymerase复合体复合体 CAP-cAMP CAP-cAMP 与与RNA PolymeraseRNA Polymerase的的-CTD结合，激活转录结合，激活转录（二）（二）原核基因转录的起始原核基因转录的起始1、因子的作用：因子的作用：降低降低全全酶与一般与一般DNA的的非非专一性一性结合力合力（20000倍倍）；）；增增强全全酶与启与启动子子R site、B site的的专一性一性结合力合力（100倍倍）；）；导致致RNA链的延伸的延伸缓慢慢Promoter与与 factor 间的结合专效性间的结合专效性决定了决定了 strong promoter&weak promoter；-35 box,-10 box的差异影响启的差异影响启动子与子与RNA pol 中中因子的因子的结合能力合能力；不同启不同启动子的子的-35，-10 box间存在存在较为保守的保守的标准序列（准序列（标准启准启动子）子）；factor is responsible for recognition of consensus sequence of promoter and only required for initiation.2、RNA pol与启动子的结合与启动子的结合因子因子识别启启动子上子上结合位点。合位点。RNA pol全全酶与与-35 box结合合封封闭型启型启动复合物复合物；酶向向-10 box移移动，并与之牢固，并与之牢固结合，促使合，促使-10 box及起始位点及起始位点处发生局部解生局部解链开放型开放型启启动复合物复合物；DNA解螺旋解螺旋扩展到展到-10 box下游下游17bp范范围。3、转录起始位点的决定、转录起始位点的决定酶与与-10 box 的的结合，决定了第一个起始碱合，决定了第一个起始碱基的基的选择。第一个被第一个被转录的碱基离的碱基离-10 box 的保守的保守T约69nts。mRNA的起始位点多的起始位点多为G，其次其次为A，很少很少为U,起始点核苷酸的两起始点核苷酸的两侧分分别为C 和和T。4、三元复合物的形成和、三元复合物的形成和因子的解离因子的解离RNA合成一开始，就形成合成一开始，就形成模板模板-RNA pol-RNA的的三元复合物三元复合物。因子解离，核心因子解离，核心酶与模板的与模板的亲和性下降到和性下降到非特异性非特异性结合的水平，合的水平，RNA pol在在DNA链上上变得容易移得容易移动，为链的延伸的延伸创造了条件；造了条件；游离的游离的因子可以重新因子可以重新进行功能循行功能循环。转录的起始转录的起始核心核心酶在在因子帮助下特异性因子帮助下特异性结合到合到DNA上；上；RNA pol与启与启动子子-35 box 结合，形成合，形成封封闭型起始型起始复合物复合物；酶滑滑动到到-10 box，转变成成为开放型起始复合物开放型起始复合物，启启动子活化，双子活化，双链解开，模板解开，模板链暴露，插入最初暴露，插入最初的的2个核苷酸；个核苷酸；酶继续加上开加上开头的几个的几个NTP，形成形成三元起始复合三元起始复合物物，在，在RNA链合成了合成了89个碱基后，个碱基后，因子解离，因子解离，转录开始。开始。Model of the interaction between E.coil RNA polymerase holoenzyme and a promoterDNAIncorporating the first few Nt二、原核生物转录的延伸二、原核生物转录的延伸RNA pol沿着模板沿着模板链移移动，RNA链不断延伸，不断延伸，并保持三元复合物的并保持三元复合物的结构；构；转录泡中的泡中的DNA螺旋前开、后合，螺旋前开、后合，RNA延延长，不断脱离不断脱离DNA；RNA链的延伸速度不是恒定的，在模板富含的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的区域，的区域，转录就会减慢就会减慢/停停顿。17bp螺旋解开长度螺旋解开长度12bpDNA-RNA复合体长度复合体长度影响影响RNA延伸速度的因素：延伸速度的因素：RNA pol；暂停信号停信号：导致致转录速度突然出速度突然出现变化的特化的特殊序列。殊序列。GC富集区富集区：产物物RNA不易不易释放；放；IR：产物形成茎物形成茎环结构，妨碍上游的模板恢构，妨碍上游的模板恢复双复双链。其他配基：其他配基：ppNpp、NusA蛋白。蛋白。NusA protein：69 Kd,acid protein RNApol-attaching factor Impel RNApol.pausing in terminator for 1-15 and waiting for Rho factor to stop transcription of RNA After initiation substituting NusA+core E antiterminationN protein utilization substanceNusA binds to polymerase,and N binds to both NusA and box B of the nut site region of the transcript,creating a loop in the growing RNA.This complex is relatively weak and can cause antitermination only at terminators near the nut site(These conditions exist only in vitro.).(Nut N binding site)antitermination N protein三、三、原核生物原核生物转录转录的终止的终止转录的的终止依止依赖于于RNA产物的特定序列；物的特定序列；原核和某些真核生物的原核和某些真核生物的终止子要求止子要求转录产物物RNA 3端具有端具有发夹的二的二级结构，茎部富构，茎部富有有GC序列；序列；终止子的分止子的分类：根据根据终止反止反应是否需要是否需要蛋白蛋白1、不依赖于、不依赖于因子的终止子（强终止子）因子的终止子（强终止子）结构特点构特点：RNA具有一个具有一个发夹结构（富含构（富含GC）和随后和随后polyU片段。片段。作用机制作用机制：RNA pol+发夹结构构 转录暂停停 后随后随杂合分子不合分子不稳定的定的poly(U-dA)RNA容容易从模板上脱落易从模板上脱落RNA-DNA-RNA pol 解聚解聚 转录终止止2、依赖于、依赖于因子的终止子（弱终止子）因子的终止子（弱终止子）因子因子：55kD，六聚体。能，六聚体。能够利用水解利用水解ATP释放的能量使放的能量使RNA从三元复合物中从三元复合物中释放出放出来；来；结构构：仍然具有茎：仍然具有茎环结构，但构，但GC碱基碱基对含含量量较少，下游也缺乏少，下游也缺乏polyU结构。构。1、2、3、终止类型终止类型回文序列回文序列后随序列后随序列不依赖不依赖因子的终止子因子的终止子富含富含GC富含富含U依赖依赖因子的终止子因子的终止子不富含不富含GC不富含不富含U第四节第四节 原核生物转录的调控原核生物转录的调控基因表达的基因表达的调控主要控主要发生在生在转录水平；水平；转录水平上的水平上的调控是最控是最为经济、灵活，又是最、灵活，又是最为重要、复重要、复杂的的调控；控；确定需要确定需要转录基因的起始位点；基因的起始位点；精精细调节基因表达的水平；基因表达的水平；cis factor 与与 trans factor 严格又灵活的互作；格又灵活的互作；保保证RNA pol的的连续转录，准确，准确终止。止。一、原核转录调控的相关概念一、原核转录调控的相关概念（一）（一）诱导和阻遏和阻遏：诱导：酶的合成取决于特定物的合成取决于特定物质（常（常为substrate）的存在。如培养基中乳糖的存在的存在。如培养基中乳糖的存在促促进了了E.coli的半乳糖苷的半乳糖苷酶的的合成合成；阻遏：阻遏：当培养基中某种物当培养基中某种物质（常（常为product）含量含量较高，高，细胞就关胞就关闭合成合成这种物种物质的能力。如培养的能力。如培养基中基中Trp的存在的存在抑制抑制了了E.coli Trp的的合成合成；（二）调控的效应物（二）调控的效应物v调节蛋白蛋白+小分子物小分子物质 原核操原核操纵子的子的诱导/阻阻遏。遏。这些小分子是基因表达的些小分子是基因表达的调节物物质-效效应物物。诱导物物（inducer）：与：与调节蛋白蛋白结合，使其从合，使其从DNA分子上脱落下来，分子上脱落下来，RNA pol开始开始转录。辅阻遏物阻遏物（co-repressor）：与：与调节蛋白蛋白结合，合，可以提高可以提高调节蛋白与操蛋白与操纵基因的基因的亲和性，和性，进而关而关闭结构基因的构基因的转录。（三（三）正调控和负调控正调控和负调控正正调控控：调节蛋白与操蛋白与操纵子子结合后合后促促进转录的的进行。行。负调控控：调节蛋白与操蛋白与操纵子子结合后合后抑制抑制转录的的进行。行。正、正、负调控都存在着控都存在着诱导和阻遏。和阻遏。positiveactiveinactiveInd.Rep.正调控正调控+诱导诱导 调节蛋白无活性调节蛋白无活性转录不转录不进行进行 诱导物诱导物+调节蛋白调节蛋白有活有活性调节蛋白性调节蛋白转录进行转录进行 正调控正调控+阻遏阻遏 调节蛋白有活性调节蛋白有活性转录进转录进行行 辅阻遏物辅阻遏物+调节蛋白调节蛋白无无活性调节蛋白活性调节蛋白转录不进行转录不进行negativeactiveinactive 阻遏蛋白有活性阻遏蛋白有活性转录转录不进行不进行 诱导物诱导物+阻遏蛋白阻遏蛋白无无活性阻遏蛋白活性阻遏蛋白转录进行转录进行 负调控负调控+诱导诱导 负调控负调控+阻遏阻遏阻遏蛋白无活性阻遏蛋白无活性转录转录进行进行 辅阻遏物辅阻遏物+阻遏蛋白阻遏蛋白有活性调节蛋白有活性调节蛋白转录不转录不进行进行Ind.Rep.Negative二、操纵子理论（二、操纵子理论（operon concept）定定义：原核生物基因表达和：原核生物基因表达和调控的控的单元。元。包括包括：结构基因：构基因：编码控制某一代控制某一代谢途径的相关的途径的相关的酶；调控元件控元件：是是调节结构基因构基因转录的一段的一段DNA序序列，包括启列，包括启动子和操子和操纵基因；基因；调节基因：其基因：其产物（物（调节蛋白）能蛋白）能够识别并并结合操合操纵基因，决定基因，决定结构基因的构基因的转录与否。与否。（一）一）lac操纵子（操纵子（lactose operon）：）：1、lac操操纵子的子的结构构调节基因（基因（I）：）：编码阻遏物（阻遏物（Repressor）。）。启启动子（子（Promoter，P）：）：RNA pol的的结合位点；合位点；操操纵基因（基因（Operator，O）：）：进入入结构基因的开关；构基因的开关；结构基因：构基因：Z（-半乳糖苷半乳糖苷酶）、Y（-半乳糖苷透半乳糖苷透过酶）、A（-半乳糖苷乙半乳糖苷乙酰基基转移移酶）；-半乳糖苷半乳糖苷酶：水解含：水解含-半乳糖苷半乳糖苷键的底物，的底物，如乳糖。如乳糖。-半乳糖苷透半乳糖苷透过酶：使外界的：使外界的-半乳糖苷能透半乳糖苷能透过E.coli细胞壁和原生胞壁和原生质膜膜进入入细胞内。胞内。-半乳糖苷乙半乳糖苷乙酰基基转移移酶：乙：乙酰CoA+-半乳糖半乳糖苷苷乙乙酰半乳糖。半乳糖。当当E.coli需要利用培养基里的乳糖需要利用培养基里的乳糖时，前，前2种种酶是必需的，而最后是必需的，而最后1种种酶则是非必需的。是非必需的。没没有有乳乳糖糖lacI编码的的阻阻遏遏蛋蛋白白具具有有活活性性牢牢固固结合合到到操操纵基基因因O上上结合合在在启启动区区的的RNA pol不不能能通通过Z、Y、A不能不能转录（和表达）（和表达）2、lac操纵子的负向调控机制操纵子的负向调控机制 负调控负调控+诱导诱导 加入乳糖加入乳糖乳糖（乳糖（诱导物）与阻遏蛋白物）与阻遏蛋白结合合阻遏蛋阻遏蛋白构象白构象变化化 阻遏蛋白从操阻遏蛋白从操纵基因上脱落基因上脱落 RNA pol开始开始Z、Y、A基因的基因的转录表达表达乳糖被利用乳糖被利用 3、lac操纵子操纵子CAP的转录激活作用的转录激活作用 正调控正调控CAP：二聚体，可同：二聚体，可同时与与DNA、cAMP结合；合；G存在存在细胞内胞内cAMPCAP二聚体不能二聚体不能单独与独与DNA结合合lac 操操纵子关子关闭G缺乏缺乏细胞内胞内cAMP CAP与与cAMP结合合 CAP-cAMP复合物复合物+lac 操操纵子启子启动子上游子上游 DNA链发生生90o弯曲弯曲 增增强RNA pol与启与启动子的子的结合合 lac 操操纵子打开子打开 Z、Y、A基因基因转录、表达、表达CAPv乳糖操纵子的协同调节乳糖操纵子的协同调节(coordinate regulation)负向调节与正性向调节协同合作负向调节与正性向调节协同合作*阻遏蛋白封闭转录时，阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用不发挥作用*如没有如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白从加强转录，即使阻遏蛋白从lacO上上s释放仍无转录活性释放仍无转录活性结论：结论：lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖缺乏葡萄糖（二）（二）trp操纵子操纵子Trp的合成：一系列的合成：一系列酶促反促反应的的结果（分支酸果（分支酸 邻氨基苯甲酸氨基苯甲酸 吲哚甘油磷酸甘油磷酸 Trp）；1、trp操操纵子的阻遏系子的阻遏系统转录起始的起始的调节有有Trp：Trp结合并激活阻遏蛋白合并激活阻遏蛋白，阻断阻断转录；无无Trp：阻遏蛋白无活性，操：阻遏蛋白无活性，操纵子基因开始子基因开始转录。2、trp操纵子的弱化系统操纵子的弱化系统转录提前终止的调节转录提前终止的调节（1）衰减子（）衰减子（attenuator）：）：定定义：提前：提前终止止转录，调节基因表达的功能基因表达的功能区域；区域；位置：位置：结构基因上游前构基因上游前导区（区（trpL）；）；大小：大小：162Nts；结构：茎构：茎环结构构+polyU，是不依是不依赖因子的因子的终止止结构构衰减子结构衰减子结构（2）前导肽）前导肽定定义：前前导序列（序列（trpL）可以）可以产生一个含有生一个含有14个个AA的多的多肽，在翻，在翻译水平上水平上调控前控前导区区转录的的终止。止。这个假个假设的多的多肽被称被称为前前导肽。证据：据：前前导肽编码区区+trpE 5端端 融合蛋白融合蛋白质（具有与前（具有与前导肽同同样的的N端序列）。端序列）。结构特点：构特点：有相有相邻的的2个个Trp密密码子（与其他具子（与其他具有衰减子的操有衰减子的操纵子相似）子相似）（3）转录衰减机制）转录衰减机制 依赖于转录和翻译的紧密偶联依赖于转录和翻译的紧密偶联Trp少少tRNATrp少少翻译通过翻译通过2个相邻个相邻Trp密码子密码子的速度很慢的速度很慢当当4区被转录完成时，核糖体才进区被转录完成时，核糖体才进行到行到1区区前导区形成前导区形成2-3配对（不能形成配对（不能形成3-4配对配对的终止结构）的终止结构）转录继续进行；转录继续进行；Trp多多 tRNATrp多多核糖体核糖体顺利通利通过2个相个相邻的的Trp密密码子子 4区被区被转录之前，核糖体就达到之前，核糖体就达到2区区 3-4区配区配对形成富含形成富含GC的茎的茎环结构构转录停止停止 trp操操纵子中的子中的结构基因被关构基因被关闭，不再合成，不再合成Trp 3、衰减作用的重要性、衰减作用的重要性衰减作用（衰减作用（10倍）与阻遏作用（倍）与阻遏作用（70倍）倍）协调作作用能大大增用能大大增强对Trp操操纵子的子的调节作用（作用（700倍）倍）。目前目前认为：当：当Trp高高时，阻遏从有活性向无，阻遏从有活性向无活性活性转变得比得比较慢，需要衰减作用来慢，需要衰减作用来较快地作快地作出反出反应，才能，才能维持培养基中适当的持培养基中适当的Trp水平。水平。自然界中也存在着不同自然界中也存在着不同类型的合成体系，型的合成体系，如如His操操纵子子，拥有在功能上与有在功能上与trp操操纵子子完全相同的衰减子（能完全相同的衰减子（能够形成一个形成一个3个碱个碱基配基配对的区域）。但的区域）。但His操操纵子没有阻遏子没有阻遏体系，完全受衰减子体系，完全受衰减子调节。