实验六、七 聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离血清蛋白.ppt

实验六实验六 聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离血清蛋白质血清蛋白质 指导教师指导教师刘建昌、池雪林刘建昌、池雪林一、目的一、目的n n1、掌握聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳的原、掌握聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳的原理、操作方法。理、操作方法。n n2、学会用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋、学会用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。白质。二、原理二、原理n n“不连续系统不连续系统不连续系统不连续系统”最大的特点在于大大提高了样品最大的特点在于大大提高了样品最大的特点在于大大提高了样品最大的特点在于大大提高了样品分离的分辨率，这种电泳的主要特点是：（分离的分辨率，这种电泳的主要特点是：（分离的分辨率，这种电泳的主要特点是：（分离的分辨率，这种电泳的主要特点是：（1 1）使）使）使）使用两种不同浓度的凝胶系统；（用两种不同浓度的凝胶系统；（用两种不同浓度的凝胶系统；（用两种不同浓度的凝胶系统；（2 2）配制）配制）配制）配制 两种凝两种凝两种凝两种凝胶的缓冲溶液成分及胶的缓冲溶液成分及胶的缓冲溶液成分及胶的缓冲溶液成分及PHPH值不同；（值不同；（值不同；（值不同；（3 3）配胶缓冲）配胶缓冲）配胶缓冲）配胶缓冲液与电泳槽中电泳缓冲液的成分、液与电泳槽中电泳缓冲液的成分、液与电泳槽中电泳缓冲液的成分、液与电泳槽中电泳缓冲液的成分、PHPH值也不相同。值也不相同。值也不相同。值也不相同。在实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度在实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度在实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度在实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶，成胶的缓冲液是的大孔胶，称为浓缩胶，成胶的缓冲液是的大孔胶，称为浓缩胶，成胶的缓冲液是的大孔胶，称为浓缩胶，成胶的缓冲液是Tris-Tris-HCLHCL，PH6.7PH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称；下层胶则是高浓度的小孔胶，称；下层胶则是高浓度的小孔胶，称；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶，成胶的缓冲液是为分离胶，成胶的缓冲液是为分离胶，成胶的缓冲液是为分离胶，成胶的缓冲液是Tris-HCL,PH8.9Tris-HCL,PH8.9。电。电。电。电极缓冲液则是极缓冲液则是极缓冲液则是极缓冲液则是Tris-Tris-甘氨酸，甘氨酸，甘氨酸，甘氨酸，PH8.3PH8.3。可见，凝胶浓。可见，凝胶浓。可见，凝胶浓。可见，凝胶浓度、成胶成分、度、成胶成分、度、成胶成分、度、成胶成分、PHPH值与电泳缓冲液系统各不相同，值与电泳缓冲液系统各不相同，值与电泳缓冲液系统各不相同，值与电泳缓冲液系统各不相同，形成了一个不连续系统。形成了一个不连续系统。形成了一个不连续系统。形成了一个不连续系统。n n在不连续系统中电泳时，甘氨酸、蛋白质、盐酸在不连续系统中电泳时，甘氨酸、蛋白质、盐酸在不连续系统中电泳时，甘氨酸、蛋白质、盐酸在不连续系统中电泳时，甘氨酸、蛋白质、盐酸中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子，形成离中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子，形成离中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子，形成离中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子，形成离子流向阳极泳动。当电极缓冲液（子流向阳极泳动。当电极缓冲液（子流向阳极泳动。当电极缓冲液（子流向阳极泳动。当电极缓冲液（pH8.3pH8.3）中的甘）中的甘）中的甘）中的甘氨酸离子进入浓缩胶时，氨酸离子进入浓缩胶时，氨酸离子进入浓缩胶时，氨酸离子进入浓缩胶时，pHpH值降到接近于甘氨酸值降到接近于甘氨酸值降到接近于甘氨酸值降到接近于甘氨酸等电点（等电点（等电点（等电点（5.975.97），于是甘氨酸的解离度突然降低，），于是甘氨酸的解离度突然降低，），于是甘氨酸的解离度突然降低，），于是甘氨酸的解离度突然降低，所带电荷明显减少，迁移率减慢。样品中蛋白质所带电荷明显减少，迁移率减慢。样品中蛋白质所带电荷明显减少，迁移率减慢。样品中蛋白质所带电荷明显减少，迁移率减慢。样品中蛋白质成分也进入浓缩胶，成分也进入浓缩胶，成分也进入浓缩胶，成分也进入浓缩胶，pHpH值的改变虽对其解离度有值的改变虽对其解离度有值的改变虽对其解离度有值的改变虽对其解离度有影响，但比对甘氨酸小得多，其迁移率比甘氨酸影响，但比对甘氨酸小得多，其迁移率比甘氨酸影响，但比对甘氨酸小得多，其迁移率比甘氨酸影响，但比对甘氨酸小得多，其迁移率比甘氨酸要大，而且浓缩胶的胶孔较大对蛋白质分子不会要大，而且浓缩胶的胶孔较大对蛋白质分子不会要大，而且浓缩胶的胶孔较大对蛋白质分子不会要大，而且浓缩胶的胶孔较大对蛋白质分子不会造成阻碍。浓缩胶中的造成阻碍。浓缩胶中的造成阻碍。浓缩胶中的造成阻碍。浓缩胶中的Tris-HClTris-HCl中中中中ClCl离子则全部离子则全部离子则全部离子则全部解离，其迁移率最快。于是在浓缩胶中各种离子解离，其迁移率最快。于是在浓缩胶中各种离子解离，其迁移率最快。于是在浓缩胶中各种离子解离，其迁移率最快。于是在浓缩胶中各种离子的迁移率形成：甘氨酸的迁移率形成：甘氨酸的迁移率形成：甘氨酸的迁移率形成：甘氨酸蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质溴酚蓝溴酚蓝溴酚蓝溴酚蓝ClCl离离离离子的顺序。子的顺序。子的顺序。子的顺序。n n甘氨酸分子进入浓缩胶后解离度的下降，造成移动甘氨酸分子进入浓缩胶后解离度的下降，造成移动甘氨酸分子进入浓缩胶后解离度的下降，造成移动甘氨酸分子进入浓缩胶后解离度的下降，造成移动离子流的突然缺失，出现电流减少电导率下降，然离子流的突然缺失，出现电流减少电导率下降，然离子流的突然缺失，出现电流减少电导率下降，然离子流的突然缺失，出现电流减少电导率下降，然而整个电泳系统中其他部分的电流仍维持不变，根而整个电泳系统中其他部分的电流仍维持不变，根而整个电泳系统中其他部分的电流仍维持不变，根而整个电泳系统中其他部分的电流仍维持不变，根据电导及电位梯度成反比，于是在前导离子据电导及电位梯度成反比，于是在前导离子据电导及电位梯度成反比，于是在前导离子据电导及电位梯度成反比，于是在前导离子ClCl与慢与慢与慢与慢离子甘氨酸离子之间突然形成了较高的局部电位梯离子甘氨酸离子之间突然形成了较高的局部电位梯离子甘氨酸离子之间突然形成了较高的局部电位梯离子甘氨酸离子之间突然形成了较高的局部电位梯度。处在这个局部高电位梯度区域中的血浆蛋白质度。处在这个局部高电位梯度区域中的血浆蛋白质度。处在这个局部高电位梯度区域中的血浆蛋白质度。处在这个局部高电位梯度区域中的血浆蛋白质各成分，在高电场作用下迅速以不同的速度泳向前各成分，在高电场作用下迅速以不同的速度泳向前各成分，在高电场作用下迅速以不同的速度泳向前各成分，在高电场作用下迅速以不同的速度泳向前导导导导ClCl离子区域。当到达前导离子区域。当到达前导离子区域。当到达前导离子区域。当到达前导ClCl离子区域时因不缺少离子区域时因不缺少离子区域时因不缺少离子区域时因不缺少离子，大的电场强度减弱，离子移动速度急速减慢离子，大的电场强度减弱，离子移动速度急速减慢离子，大的电场强度减弱，离子移动速度急速减慢离子，大的电场强度减弱，离子移动速度急速减慢下来，结果在甘氨酸和下来，结果在甘氨酸和下来，结果在甘氨酸和下来，结果在甘氨酸和ClCl离子之间的蛋白质样品就离子之间的蛋白质样品就离子之间的蛋白质样品就离子之间的蛋白质样品就按其分子的大小浓缩成层。蛋白质样品浓缩了好几按其分子的大小浓缩成层。蛋白质样品浓缩了好几按其分子的大小浓缩成层。蛋白质样品浓缩了好几按其分子的大小浓缩成层。蛋白质样品浓缩了好几百倍，且蛋白质各成分也按一定的顺序排列成层。百倍，且蛋白质各成分也按一定的顺序排列成层。百倍，且蛋白质各成分也按一定的顺序排列成层。百倍，且蛋白质各成分也按一定的顺序排列成层。n n当当当当离离离离子子子子流流流流继继继继续续续续向向向向前前前前，进进进进入入入入以以以以pH8.9pH8.9缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液配配配配制制制制的的的的小小小小孔孔孔孔胶胶胶胶时时时时，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子在在在在小小小小孔孔孔孔胶胶胶胶里里里里遇遇遇遇到到到到阻阻阻阻力力力力，迁迁迁迁移移移移率率率率减减减减慢慢慢慢，同同同同时时时时在在在在pH8.9pH8.9条条条条件件件件下下下下，甘甘甘甘氨氨氨氨酸酸酸酸又又又又充充充充分分分分解解解解离离离离，其其其其带带带带电电电电量量量量增增增增加加加加，消消消消除除除除了了了了离离离离子子子子流流流流缺缺缺缺失失失失的的的的现现现现象象象象，小小小小分分分分子子子子的的的的甘甘甘甘氨氨氨氨酸酸酸酸离离离离子子子子赶赶赶赶上上上上了了了了蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质。凝凝凝凝胶胶胶胶各各各各部部部部分分分分恢恢恢恢复复复复具具具具有有有有恒恒恒恒定定定定的的的的电电电电场场场场强强强强度度度度，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的分分分分离离离离完完完完全全全全按按按按一般区带电泳方式进行。一般区带电泳方式进行。一般区带电泳方式进行。一般区带电泳方式进行。n n不不不不连连连连续续续续电电电电泳泳泳泳最最最最主主主主要要要要的的的的优优优优点点点点就就就就是是是是使使使使蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质样样样样品品品品经经经经浓浓浓浓缩缩缩缩胶胶胶胶后后后后，形形形形成成成成紧紧紧紧密密密密地地地地压压压压缩缩缩缩层层层层进进进进入入入入分分分分离离离离胶胶胶胶。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质各各各各成成成成分分分分预预预预先先先先分分分分开开开开且且且且压压压压缩缩缩缩成成成成层层层层，可可可可以以以以减减减减少少少少在在在在电电电电泳泳泳泳时时时时由由由由于于于于自自自自由由由由扩扩扩扩散散散散而而而而造造造造成成成成的的的的区区区区带带带带相相相相互互互互重重重重叠叠叠叠，这这这这样样样样就就就就是是是是提高了电泳的分辨能力。提高了电泳的分辨能力。提高了电泳的分辨能力。提高了电泳的分辨能力。三、试剂及器材三、试剂及器材n n（1 1）制备两种胶的贮存液：见操作。）制备两种胶的贮存液：见操作。）制备两种胶的贮存液：见操作。）制备两种胶的贮存液：见操作。n n（2 2）电极缓冲溶液）电极缓冲溶液）电极缓冲溶液）电极缓冲溶液 取甘氨酸取甘氨酸取甘氨酸取甘氨酸28.8g28.8g及及及及Tris6gTris6g分别溶解后，加分别溶解后，加分别溶解后，加分别溶解后，加蒸馏水到蒸馏水到蒸馏水到蒸馏水到1000ml1000ml，为，为，为，为pH8.5pH8.5。用前稀释。用前稀释。用前稀释。用前稀释1010倍。倍。倍。倍。n n（3 3）染色液：）染色液：）染色液：）染色液：0.25g0.25g考马氏亮蓝考马氏亮蓝考马氏亮蓝考马氏亮蓝R250,R250,加入加入加入加入454ml454ml甲醇水溶液甲醇水溶液甲醇水溶液甲醇水溶液和和和和46ml46ml冰醋酸。冰醋酸。冰醋酸。冰醋酸。n n（4 4）脱色液：）脱色液：）脱色液：）脱色液：75ml75ml冰醋酸、冰醋酸、冰醋酸、冰醋酸、875ml875ml蒸馏水与蒸馏水与蒸馏水与蒸馏水与50ml50ml甲醇混合。甲醇混合。甲醇混合。甲醇混合。n n（5 5）凝胶电泳玻管：选内径）凝胶电泳玻管：选内径）凝胶电泳玻管：选内径）凝胶电泳玻管：选内径5 56mm6mm、外径、外径、外径、外径7 78mm8mm、长、长、长、长8080100mm100mm光滑均匀的玻璃管。光滑均匀的玻璃管。光滑均匀的玻璃管。光滑均匀的玻璃管。n n（6 6）5 510ml10ml注射器注射器注射器注射器n n（7 7）10cm10cm长注射器针头（长注射器针头（长注射器针头（长注射器针头（7 7号）号）号）号）n n（8 8）100l100l微量取样器。微量取样器。微量取样器。微量取样器。n n（9 9）圆盘电泳槽）圆盘电泳槽）圆盘电泳槽）圆盘电泳槽n n（1010）0.05%0.05%溴酚蓝溴酚蓝溴酚蓝溴酚蓝 四、操作四、操作 n n1、凝胶柱的制备、凝胶柱的制备 n n将将将将洗洗洗洗净净净净烘烘烘烘干干干干的的的的玻玻玻玻璃璃璃璃管管管管一一一一端端端端插插插插入入入入疫疫疫疫苗苗苗苗瓶瓶瓶瓶的的的的橡橡橡橡皮皮皮皮帽帽帽帽中中中中，或或或或用用用用其其其其他他他他材材材材料料料料将将将将玻玻玻玻璃璃璃璃管管管管一一一一端端端端封封封封闭闭闭闭。将将将将封封封封闭闭闭闭的的的的一一一一端端端端朝朝朝朝底底底底垂垂垂垂直直直直放放放放于桌面支架上。于桌面支架上。于桌面支架上。于桌面支架上。n n按按按按表表表表6-16-1先先先先配配配配制制制制分分分分离离离离胶胶胶胶，在在在在50ml50ml干干干干燥燥燥燥小小小小烧烧烧烧杯杯杯杯中中中中按按按按比比比比例例例例加加加加入入入入1 1、2 2号号号号溶溶溶溶液液液液及及及及蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏水水水水，放放放放入入入入干干干干燥燥燥燥器器器器中中中中，用用用用水水水水泵泵泵泵或或或或抽抽抽抽气气气气机机机机抽抽抽抽气气气气至至至至溶溶溶溶液液液液中中中中无无无无气气气气泡泡泡泡冒冒冒冒出出出出为为为为止止止止。取取取取出出出出，加加加加入入入入新新新新配配配配制制制制的的的的过过过过硫硫硫硫酸酸酸酸铵铵铵铵，用用用用玻玻玻玻璃璃璃璃棒棒棒棒混混混混匀匀匀匀，及及及及时时时时用用用用皮皮皮皮头头头头滴滴滴滴管管管管吸吸吸吸取取取取胶胶胶胶液液液液灌灌灌灌入入入入玻玻玻玻璃璃璃璃管管管管内内内内约约约约6.5cm6.5cm高高高高。然然然然后后后后立立立立即即即即顺顺顺顺管管管管壁壁壁壁加加加加入入入入5 510mm10mm高高高高的的的的水水水水层层层层，以以以以隔隔隔隔离离离离空空空空气气气气加加加加速速速速凝凝凝凝胶胶胶胶的的的的过过过过程程程程。待待待待30min30min既既既既凝凝凝凝聚聚聚聚成成成成胶胶胶胶，此此此此时时时时胶胶胶胶与与与与水水水水之之之之间间间间形形形形成成成成一一一一条条条条明明明明显显显显的的的的界界界界线线线线。倒倒倒倒出出出出胶胶胶胶面上的水，也可用滤纸条吸干。面上的水，也可用滤纸条吸干。面上的水，也可用滤纸条吸干。面上的水，也可用滤纸条吸干。100ml溶液中的含量溶液中的含量溶液混合比例溶液混合比例1号号1mol/L HClTrisTEMED用用浓浓HCl调调至至pH8.948.0ml36.6g0.23ml分离胶分离胶1号号 1份份2号号 2份份H2O 1份份 （抽气）（抽气）3号号 4份份凝胶凝胶浓浓度度7.5%，pH8.92号号AcrBis30.0g0.8g3号号过过硫酸硫酸铵铵0.3g100ml溶液中的含量溶液中的含量溶液混合比例溶液混合比例4号号1mol/L HClTrisTEMED用用浓浓HCl调调至至pH6.7约约48.0ml5.98g0.46ml分离胶分离胶4号号 1份份5号号 2份份7号号 4份份 （抽气）（抽气）6号号 1份份凝胶凝胶浓浓度度2.5%，pH6.75号号AcrBis10.0g2.5g6号号核黄素核黄素4.0mg7号号蔗糖蔗糖40.0gn n按按表表6-1配配制制浓浓缩缩胶胶，在在抽抽气气后后加加入入核核黄黄素素，混混匀匀。先先用用部部分分胶胶液液冲冲洗洗分分离离胶胶面面，倒倒出出，在在立立即即灌灌入入余余下下的的浓浓缩缩胶胶约约1cm高高，再再沿沿管管壁壁加加入入缓缓缓缓加加入入蒸蒸馏馏水水约约0.5cm高高度度，放放置置约约30分分钟钟左左右右。此此时时可可见见浓浓缩缩胶胶呈呈一一层层明明显显的的灰灰白白色色胶胶柱柱。除除去去水水层层，用用电电极极缓缓冲冲液液洗洗涤涤胶胶面面，吸吸弃弃，再再用用电电极缓冲液加满至管顶，即可上样电泳。极缓冲液加满至管顶，即可上样电泳。2加样加样 取取新新鲜鲜血血清清（动动物物或或人人）5l，加加40%蔗蔗糖糖5l和和溴溴酚酚蓝蓝5l，放放置置在在干干净净的的白白瓷瓷板板孔孔中中，混混匀匀。用用微微量量取取样样器器吸吸取取样样品品，让让针针头头穿穿过过胶胶面面上上的的缓缓冲冲液液，缓缓慢慢推推动动取取样样器器，使使样样品品慢慢慢慢落落在在胶胶面面上上。推推动动取取样样器器时时不不宜宜过过猛猛，以以免免样样品品和和缓缓冲冲液液混合。混合。3电泳电泳 将已加好样品的凝胶管，轻轻除去下端的皮将已加好样品的凝胶管，轻轻除去下端的皮将已加好样品的凝胶管，轻轻除去下端的皮将已加好样品的凝胶管，轻轻除去下端的皮塞或封闭物，将管插入圆盘电泳槽孔中，管要插塞或封闭物，将管插入圆盘电泳槽孔中，管要插塞或封闭物，将管插入圆盘电泳槽孔中，管要插塞或封闭物，将管插入圆盘电泳槽孔中，管要插得垂直。插好后加入少量电极缓冲液于槽中，检得垂直。插好后加入少量电极缓冲液于槽中，检得垂直。插好后加入少量电极缓冲液于槽中，检得垂直。插好后加入少量电极缓冲液于槽中，检查是否漏水。如不漏水即可加足电极缓冲液，至查是否漏水。如不漏水即可加足电极缓冲液，至查是否漏水。如不漏水即可加足电极缓冲液，至查是否漏水。如不漏水即可加足电极缓冲液，至少要淹没过凝胶管顶部。电泳槽下槽中也加入电少要淹没过凝胶管顶部。电泳槽下槽中也加入电少要淹没过凝胶管顶部。电泳槽下槽中也加入电少要淹没过凝胶管顶部。电泳槽下槽中也加入电极缓冲液，至少要淹没电极。然后接通电源，负极缓冲液，至少要淹没电极。然后接通电源，负极缓冲液，至少要淹没电极。然后接通电源，负极缓冲液，至少要淹没电极。然后接通电源，负极在上，正极在下。电泳初期电压控制在极在上，正极在下。电泳初期电压控制在极在上，正极在下。电泳初期电压控制在极在上，正极在下。电泳初期电压控制在80V80V，待样品进入分离胶后，加大电压到待样品进入分离胶后，加大电压到待样品进入分离胶后，加大电压到待样品进入分离胶后，加大电压到160V160V，继续电，继续电，继续电，继续电泳。当指示剂到达距管底泳。当指示剂到达距管底泳。当指示剂到达距管底泳。当指示剂到达距管底1cm1cm处时停止电泳，关处时停止电泳，关处时停止电泳，关处时停止电泳，关闭电源。闭电源。闭电源。闭电源。4、剥胶、剥胶 倒出电极缓冲液，取出凝胶玻璃管。用倒出电极缓冲液，取出凝胶玻璃管。用带长注射针头（带长注射针头（10cm）的注射器吸满水，）的注射器吸满水，针头插入玻璃管壁与凝胶之间，边插入边针头插入玻璃管壁与凝胶之间，边插入边推水，并使针头沿管壁转动，直到针头插推水，并使针头沿管壁转动，直到针头插到头。这样凝胶柱即可脱离玻璃管滑出。到头。这样凝胶柱即可脱离玻璃管滑出。若仍不自动滑出，可用洗耳球轻轻把凝胶若仍不自动滑出，可用洗耳球轻轻把凝胶柱吹出。但不能用力过大，以免凝胶滑出柱吹出。但不能用力过大，以免凝胶滑出过猛而断裂。过猛而断裂。5染色染色 将取出的凝胶柱放入大试管或平皿中，加入将取出的凝胶柱放入大试管或平皿中，加入将取出的凝胶柱放入大试管或平皿中，加入将取出的凝胶柱放入大试管或平皿中，加入染色液，染色染色液，染色染色液，染色染色液，染色202030min30min。倒处染色液并回收，。倒处染色液并回收，。倒处染色液并回收，。倒处染色液并回收，换成脱色液漂洗，多次更换脱色液或放在换成脱色液漂洗，多次更换脱色液或放在换成脱色液漂洗，多次更换脱色液或放在换成脱色液漂洗，多次更换脱色液或放在3737处加热促进脱色，直至无蛋白区带处背景的颜处加热促进脱色，直至无蛋白区带处背景的颜处加热促进脱色，直至无蛋白区带处背景的颜处加热促进脱色，直至无蛋白区带处背景的颜色腿净，可见清晰的血清蛋白质电泳图谱为止。色腿净，可见清晰的血清蛋白质电泳图谱为止。色腿净，可见清晰的血清蛋白质电泳图谱为止。色腿净，可见清晰的血清蛋白质电泳图谱为止。电泳结果可用扫描仪扫描记录或拍照。凝电泳结果可用扫描仪扫描记录或拍照。凝电泳结果可用扫描仪扫描记录或拍照。凝电泳结果可用扫描仪扫描记录或拍照。凝胶柱在胶柱在胶柱在胶柱在7%7%的醋酸溶液中可长期保存。的醋酸溶液中可长期保存。的醋酸溶液中可长期保存。的醋酸溶液中可长期保存。