WesternBlot实验技术学习.pptx
Western BlotWestern Blot实验原理实验原理Western Blot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是把通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白质变为可见、可分析的灰色条带，通过分析条带的位置和条带着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。Western Blot 应用：研究检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究AMPK2（分子量：63KD）第1页/共32页第一页，编辑于星期日：八点 七分。Western Blot 的具体步骤（一）蛋白样品制备（二）蛋白含量的测定（三）凝胶 电泳（四）转膜 （五）封闭（六）免疫反应（七）化学发光，显影，定影（八）凝胶图像分析第2页/共32页第二页，编辑于星期日：八点 七分。（一）（一）蛋白样品制备蛋白样品制备以体外培养的贴壁细胞样本为例，对其进行总蛋白提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、每瓶细胞加 3ml 4预冷的 PBS（0.01M pH7.27.3）。平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。3、按 1ml 裂解液加 10 l PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）第3页/共32页第三页，编辑于星期日：八点 七分。（一）蛋白样品制备4、每瓶细胞加 400 l 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、于 4下 12000rpm 离心 5min。（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清液分装转移至离心管中放于20保存。第4页/共32页第四页，编辑于星期日：八点 七分。（二）（二）蛋白含量的测定蛋白含量的测定 步骤：1.将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用）2.算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B），（A液：B液=50:1，一般配多些，如60孔，A液12000ul，B液240ul）3.将样品稀释到一定倍数才能定量，（10倍，20倍，30倍），每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍），做三个重复则需要60ul，一般配80ul第5页/共32页第五页，编辑于星期日：八点 七分。（二）蛋白含量的测定4.配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml，若配200ul 的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ul PBS溶液5.将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0，1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到20ul6.每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差7.将加好的96孔板放在37下孵育30分钟第6页/共32页第六页，编辑于星期日：八点 七分。（二）蛋白含量的测定8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量（ml）为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。（R2 0.98才有用,酶标仪操作:两个箭头图标,1是结果,2是保存）9.计算蛋白含量（注意定量样品已经稀释了10倍）第7页/共32页第七页，编辑于星期日：八点 七分。（三）凝胶电泳凝胶成份：丙烯酰胺：形成聚合物链 N,N-亚甲双丙烯酰胺：形成纵向架桥（cross-linkage）SDS过硫酸铵(APS)：助凝剂TEMED:催化剂H2O仪器：仪器：电泳缓冲液：Tris-甘氨酸溶液第8页/共32页第八页，编辑于星期日：八点 七分。（三）凝胶电泳 1、制胶玻璃板用自来水刷洗干净，再用双蒸水冲洗一遍，在烘箱中烘干，垂直放在制胶架上根据蛋白质分子量大小，配置所需分离胶，用1ml移液抢灌胶配制浓缩胶，并灌在分离胶上面，插入梳齿，注意避免气泡，放入37烘箱中30min 需紧密固定！第9页/共32页第九页，编辑于星期日：八点 七分。（三）（三）凝胶电泳凝胶电泳 1、制胶、制胶第10页/共32页第十页，编辑于星期日：八点 七分。浓缩分离胶5%pH6.810%pH8.8蛋白质在进入分离胶以前，先被浓缩成一条细线，使每个蛋白的起跑线相同，提高解析度。pH不连续凝胶不连续缓冲液成分不连续特点：11 不连续系统第11页/共32页第十一页，编辑于星期日：八点 七分。（三）凝胶 电泳 2.上样上样 1.上样前煮沸样品2.每孔上样量为100-150 g蛋白；根据目的蛋白的表达情况的不同而有所变化。3.Marker:6-8ul第12页/共32页第十二页，编辑于星期日：八点 七分。（三）凝胶电泳 3.电泳将凝固后的凝胶玻璃板上方的梳子取下，注意不要弄破胶表面将凝胶玻璃板固定于电泳槽中倒入配制的电泳液，使电泳液盖过玻璃板内加入已处理的样品，根据蛋白表达量调整上样体积盖紧电泳槽，确保各边缘紧密吻合，防止漏液第13页/共32页第十三页，编辑于星期日：八点 七分。（三）凝胶电泳 3.电泳电泳电泳条件：推荐：浓缩胶 80V 3545min 分离胶 120V 4575min第14页/共32页第十四页，编辑于星期日：八点 七分。（三）凝胶 电泳 4.染色染色 SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色第15页/共32页第十五页，编辑于星期日：八点 七分。（四）转膜 原理：原理：蛋白因结合SDS而带电荷，转膜即在电场作用下从胶中转至膜上的过程。注：下层滤纸必须用新的。第16页/共32页第十六页，编辑于星期日：八点 七分。（四）（四）转膜转膜 半干转半干转湿湿 转转半干式转膜速度快，适合与小分子量蛋白湿式成功率高并特别适合用于分子量大于 100KD的蛋白两种方法的转膜液不同！方法方法仪器仪器特点特点第17页/共32页第十七页，编辑于星期日：八点 七分。（四）（四）转膜转膜剪裁PVDF膜，放入培养皿中，用无水甲醇浸泡在托盘中倒入少量湿转液，切胶，将切好的目的条带放在转膜架上，将PVDF膜覆盖在胶带上，间隙不可出现气泡将转膜架插入黑红色架子上，放入电泳槽中，倒入湿转液，槽内放满冰块，盖紧电泳槽，电泳槽外围放满冰块第18页/共32页第十八页，编辑于星期日：八点 七分。（四）（四）转膜转膜第19页/共32页第十九页，编辑于星期日：八点 七分。（四）（四）转膜转膜转膜条件：推荐：4，电流、时间根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。（推荐放入冰水混合物中转印，散热更快）第20页/共32页第二十页，编辑于星期日：八点 七分。21 4.4.转膜后确认u丽春红可逆染色，检测转膜效率。与下游WB检测完全兼容，无任何干扰。u蛋白预染Marker实时监测分子量参照与目的蛋白同时转移至印迹膜上，检测转膜效率。丽春红染色结果 （四）转膜第21页/共32页第二十一页，编辑于星期日：八点 七分。（五）封闭 封闭条件：封闭2 hour，然后用 TBST洗35min，进入下一步抗体的孵育。为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭。因为封闭液本身就是蛋白，封闭就相当于把那些太容易发生非特异结合的位点先给堵上了。常用的封闭液：脱脂奶粉（5）BSA（5）不能用于磷酸化蛋白！很多人的经验是：脱脂牛奶封闭后背景比较干净，而检测磷酸化蛋白则用BSA（因脱脂牛奶含有较多的磷酸化蛋白，会干扰的）。第22页/共32页第二十二页，编辑于星期日：八点 七分。（六）免疫反应1.一抗一抗 抗体与牛奶比例：1:2000；特殊者按照抗体说明书建议的稀释倍数；抗体孵育时间：4过夜（可根据不同指标适当延长一抗孵育时间）；保持适当的摇动使抗体与膜的结合均匀；使用后的一抗可重复回收利用1-3次，重复利用时需加入原有计量一半的抗体。第23页/共32页第二十三页，编辑于星期日：八点 七分。（六）免疫反应2.二抗二抗 与二抗杂交后，放于摇床上，室温（25左右）2h。TBST洗涤3次，每次5分钟。注：1.抗体与牛奶比例：1:5000，抗小鼠抗小鼠抗兔抗兔抗大鼠抗大鼠抗人抗人抗山羊抗山羊抗鸡抗鸡抗豚鼠抗豚鼠抗马抗马第24页/共32页第二十四页，编辑于星期日：八点 七分。（七）化学发光，显影，定影显色方法显色方法代表类型代表类型特点特点酶促底物发光法 BCIP/NBT显色稳定性好，灵敏度较高（250pg），背景一般，成像性较差。BCIP对人体有刺激性，NBT对人体有害，请注意适当防护。化学发光法（推荐使用）ECL发光法稳定性好，灵敏度高（10-12g），背景可以很低，成像性好，且可以重复标记，第25页/共32页第二十五页，编辑于星期日：八点 七分。（八）凝胶图像分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。常用灰度值分析软件：Image J、Quantity One、Image-Pro Plus等。第26页/共32页第二十六页，编辑于星期日：八点 七分。SDS-PAGE电泳常见问题分析常见问题分析第27页/共32页第二十七页，编辑于星期日：八点 七分。高背景第28页/共32页第二十八页，编辑于星期日：八点 七分。条带弱第29页/共32页第二十九页，编辑于星期日：八点 七分。其 他第30页/共32页第三十页，编辑于星期日：八点 七分。第31页/共32页第三十一页，编辑于星期日：八点 七分。感谢您的观看。第32页/共32页第三十二页，编辑于星期日：八点 七分。
