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教学过程教学内容时间分配和媒体选择3、吸附法 聚酰胺对于黄酮类化合物（多元酚类）是比较理想的吸附剂，因其具有多个酰胺基，在水溶液中与酚羟基通过氢键结合而被吸附，一些不被吸附的化合物则随水流去。将吸附有黄酮类化合物的聚酰胺用不同浓度的乙醇、丙酮以及碱水洗脱，此法也可达到粗分的目的。 例如：银杏叶黄酮的提取多采用吸附树脂的方式进行。4、超临界流体萃取法 以CO2为单一流体萃取极性较低的游离黄酮或黄酮的碳苷类； 在CO2中加入水、乙醇等作为夹带剂，萃取极性较高的黄酮或黄酮苷类例如：从甘草中提取黄酮类化合物，以CO2为单一流体可萃取极性较低的干草查耳酮A、B，在CO2-水-乙醇溶剂体系则可提取极性较高的甘草素与异甘草素。二、分离概述：植物体内往往含有多种黄酮类化合物，称为总黄酮，它们之间或是异构体，或是生物合成过程中的中间产物。对于各种黄酮类化合物的分离主要利用其极性的大小、酸性的强弱以及分子中能否螯合金属离子的结构进行分离。 现将较常用的方法介绍如下： （一）柱色谱法分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。此外，也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。1. 硅胶柱色谱：此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。 硅胶中混存少量金属离子，应预先用浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。 分离黄酮苷元时，用氯仿-甲醇混合溶剂做移动相； 分离黄酮苷时，用氯仿-甲醇-水或乙酸乙酯-丙酮-水做移动相。2. 聚酰胺柱色谱：对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较为理想的吸附剂,具有分离效果好、吸附容量大的特点。 可用于分离各种类型的黄酮类化合物，包括苷与苷元、查耳酮与二氢黄酮等 分离的机理: 主要为氢键吸附 ，其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。40min教学过程教学内容时间分配和媒体选择黄酮类化合物在聚酰胺柱上的吸附规律如下:a. 一般而言，酚羟基数目越多，吸附力越强；b. 如酚羟基所处的位置易形成分子内氢键，则吸附力减小。c. 分子内芳香程度越高、共轭双键越多，则吸附力增强:总之，一般吸附规律如下：黄酮醇> 黄酮 > 二氢黄酮醇 > 异黄酮 黄酮类化合物从聚酰胺柱上的洗脱规律如下:a. 不同类型黄酮化合物，先后流出顺序为：异黄酮 >二氢黄酮醇 >黄酮 >黄酮醇b. 相同苷元，洗脱先后顺序为：叁糖苷> 双糖苷> 单糖苷> 苷元c. 母核上增加羟基，洗脱速度即相应下降；d. 羟基数目相同时，因羟基位置对吸附力有影响而导致下列洗脱顺序： 邻位羟基黄酮 > 对位（或间位）羟基黄酮（聚酰胺对其吸附力较大！）e. 查耳酮比相应二氢黄酮难于洗脱。因为吸附力：查耳酮 > 二氢黄酮; 黄 酮 > 二氢黄酮f.洗脱能力与介质有关(各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力的强弱顺序): 水 < 甲醇或乙醇 < 丙酮 < 稀NaOH水溶液或氨水< 甲酰胺 < 二甲基甲酰胺 < 尿素水溶液因为聚酰胺与各类化合物在水中形成氢键的能力最强，在有机溶剂中较弱。 聚酰胺色谱用于黄酮与其苷的分离时，若用含水移动相（甲醇/水），则聚酰胺对苷元的吸附力较强，如以有机溶剂（氯仿/甲醇）做移动相，则相反。 聚酰胺色谱的缺点：速度较慢、低分子量杂质（即酰胺的低聚物）混入的问题等。 以上两种吸附剂是最常用的。例如：日本学者高木修造等利用硅胶柱色谱（氯仿-甲醇做洗脱剂）和聚酰胺色谱（水/甲醇做洗脱剂）配合分离，从黄芩中分离出11种黄酮类化合物。 3. 葡聚糖疑胶(Sephadex gel)柱色谱： 对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶： Sephadex G（适用于水溶性成分分离）和 Sephadex LH-20（可用于亲脂性成分分离）分离机理: 分离黄酮苷元时，吸附作用为主导，这种吸附力来自分子间的氢键，取决于游离酚羟基的数目； 分离黄酮苷时，分子筛作用为主导, 取决于分子量的大小。 例如：5，7，4-三羟基黄酮、3，5，7，3，4-五枪击黄酮，3，5，7，3，4，5-六羟基黄酮。其洗脱顺序为：5，7，4-三羟基黄酮 > 3，5，7，3，4-五羟基黄酮 >3，5，7，3，4，5-六羟基黄酮。40min教学过程教学内容时间分配和媒体选择 p186表5-5说明： 苷元的羟基数越多，吸附能力越强，越难以洗脱； 苷所连接糖越多，分子量越大，越先洗脱（葡聚糖的分子筛性所决定！） 常用洗脱剂： 碱性水溶液（氨水）、含盐水溶液（NaCl） 醇（如甲醇）及含水醇（甲醇/水） 其它溶剂：含水丙酮、甲醇氯仿等（二）梯度pH萃取法1、适用范围：适合于酸性强弱不同的黄酮苷元的分离。2、原理：根据黄酮类苷元酚羟基数目及位置不同其酸性强弱也不同的性质，可以将总黄酮溶于有机溶剂（如乙醚）后，依次用5%NaHCO3、5%Na2CO3、0.2%NaOH及4%NaOH水溶液萃取，将黄酮按较强酸性至较弱酸性的顺序达到分离的目的。3、分离规律如下：酸性： 7，4-二OH > 7-或4-OH > 一般OH > 5-OH（溶于）： 5%NaHCO3液 5%Na2CO3液 0.2%NaOH液 4%NaOH液（三）根据分子中某些特定官能团进行分离1、铅盐沉淀法：适用于具有邻二酚羟基的分的分离 具有邻二酚羟基的黄酮成分，可被中性醋酸铅沉淀； 不含邻二酚羟基结构的黄酮成分，可被碱性醋酸铅沉淀。2、硼酸络合法：具有邻二酚羟基的黄酮可与硼酸络合，生成物易溶于水，借此可与不含邻二酚羟基结构的黄酮成分分离。3、脱铅方法 H2S法：铅盐沉淀悬浮于乙醇中，通入H2S进行复分解，滤去PbS沉淀，可得黄酮类成分。该法缺点是初生态的PbS沉淀具有较高的吸附性。 现通用法：使用硫酸盐或磷酸盐，或使用阳离子交换树脂脱铅。 在实际工作中，常将上述柱色谱法与各种经典方法相互配合应用，以达到较好的分离效果。三、提取分离实例从柠檬果皮中分离降血压有效成分 柠檬果皮2kg搅碎热水浸取（采用溶剂法提取） 滤液浓缩后加3倍量乙醇（沉淀多糖与蛋白质等） 水提取物 hexane(己烷)提取（脱脂） n-BuOH提取（萃取黄酮苷，如用极性小的乙酸乙酯或乙醚则萃取黄酮苷元）n-BuOH提取物加碱式醋酸铅（沉淀黄酮类成分） 黄色铅盐沉淀碳酸氢钠（脱铅） 滤液教学过程教学内容时间分配和媒体选择 6MHCl调pH=5（沉淀黄酮类成分）n-BuOH提取得粗黄酮类凝胶过滤不同pH水洗（自弱酸性到弱碱性） 不同部分反复柱层析反复重结晶得不同单体。 四、含黄酮类化合物中药实例1.黄芩 黄芩的根为清热解毒的常用中药 所含黄酮类化合物: 黄芩苷(含4-5.2%)、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等二十余种 黄芩苷: 黄芩的主要有效成分,有抗菌消炎作用。黄芩苷是成药银黄片的主要成分，银黄片有降转氨酶作用。 黄芩苷的理化性质 a. 淡黄色针晶 b. 几乎不溶于水,难溶于甲醇,乙醇,丙酮,可溶于热乙酸 c. 遇三氯化铁显绿色. d. 遇醋酸铅生成橙红色沉淀. e. 溶于碱及氨水，初为黄色，不久则变为黑棕色. f. 水解后生成的黄芩素,易被氧化转为绿色醌类衍生物而显绿色.-保存和炮制不当导致黄芩变绿的原因. 黄芩苷 黄芩素(黄色) 绿色 10min教学过程教学内容时间分配和媒体选择2. 槐花米 (Sophora japonica L.的花蕾) 含有芦丁（含量高达23.5%,开花后降至13.0%）,槲皮素,皂苷和多糖粘液质等. 芦丁: 槐花米的有效成分，用于治疗毛细血管脆性引起的出血症,并用作高血压的辅助治疗剂. 芦丁在植物界中存在广泛.除槐花米外, 芦丁在植物界中存在广泛，如荞麦叶、烟叶和蒲公英中含量也较高,可作为提取芦丁的原料. 芦丁：a. 浅黄色粉末或极细微淡黄色针晶，含三分子结晶水. b. 加热至185oC以上熔融并分解. c. 几乎不溶于冷水，可溶于乙醇、吡啶、丙酮、乙酸乙酯等，不溶于苯、乙醚,氯仿、石油醚等.d. 易溶于碱液中，酸化后又析出. e. 暴露空气中能缓缓分解变为暗褐色. f. 加热提取时加少量硼砂可保护邻二酚羟基.3. 陈皮(Citrus aurantium L.) 无色细针状晶体, 略有苦味. 提取原料常用陈皮或小青皮. 多作成甲基橙皮苷供药用，治疗冠心病药物-脉通-的重要原料 教学过程教学内容时间分配和媒体选择七、黄酮类化合物的检识与结构鉴定（一）黄酮类化合物的检识 1、颜色：黄酮（醇）类黄色 查耳酮橙黄色 二氢黄酮（醇）、异黄酮无色或微黄色 2、显色反应： 盐酸镁粉、NaBH4、AlCl3、醋酸铅等 (二) 色谱法在黄酮类鉴定中的应用1.纸色谱苷元：分配色谱。流动相：BAW系统。苷：双向纸色谱。第一向：醇性溶剂展开，例如BAW系统，化合物极性大，吸附强。第二向：水类溶剂展开，例如2-6%醋酸水，化合物极性大，吸附弱。Rf与结构的关系：（1）水类溶剂展开时，平面型分子（黄酮、黄酮醇、查耳酮）几乎停留原点不动，非平面型分子（二氢黄酮、二氢查耳酮）Rf较大。（2）醇性溶剂展开时，同一类型苷元，羟基越多，Rf越小。（3）醇性溶剂展开时，羟基被甲氧基取代，Rf增大。（4）醇性溶剂展开时，羟基糖苷化，极性增大，Rf下降。（2）（3）（4）用酸水展开时，上述顺序颠倒。2.TLC：主要指吸附薄层，常用硅胶TLC，聚酰胺TLC。硅胶TLC：鉴定弱极性化合物。聚酰胺TLC：分离大多数黄酮及苷类，适用范围广，分离效果好。常用的薄层色谱显色方法： 1）紫外灯下观察； 2）氨蒸气处理后观察颜色变化 3）2 AlCl3甲醇溶液（紫外灯下观察）（三）紫外可见光谱在黄酮类化合物鉴定中的应用一般程序： 测定样品在甲醇中的紫外可见谱以了解母核类型； 在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后，测紫外可见光谱，以了解样品的羟基取代情况； 1. 黄酮类化合物在甲醇溶液中的UV光谱特征 benzoyl cinnamoyl(峰带II，220-280 nm) （峰带I，300-400 nm） 主要反映A环取代情况 主要反映B环取代情况 主要包含A环的苯甲酰基和主要包含B环的桂皮酰基组成了黄酮类化合物的交叉共轭体系，使黄酮类主要有两个紫外吸收带，带（300-400nm）-由桂皮酰基系统引起，主要反应B环取代情况；带（220-280 nm）-由苯甲酰基系统引起，主要反应A环取代情况。（1）黄酮、黄酮醇：在200-400 nm之间出现两个主要吸收峰，二者峰形相似，但带位置不同，可据此进行分类。在黄酮及黄酮醇母核上，如7-及4位引入羟基、甲氧基等供电基，将促进结构重排，引起相应吸收带红移，通常，整个母核上氧取代程度越高，带越向长波方向位移。的峰位主要受A-环氧取代程度的影响，B-环的取代基对其峰位影响甚微，但可影响它的形状。当B环有3，4-二氧取代时，带将为双峰。（2）查耳酮及橙酮类：共同特征是带很强，为主峰；带较弱，为次强峰。查耳酮中，带位于220270 nm，带位于340390 nm；橙酮中，常显现34个吸收峰，但主要吸收峰一般位于370430 nm。（2） 异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇 这三类化合物中，除有由A-环苯甲酰系统引起的带吸收外，因B环不与吡喃酮环上的羰基共轭（或共轭很弱），故带很弱。5min教学内容时间分配和媒体选择 在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后，测紫外可见光谱，以了解样品的羟基取代情况； 1. 黄酮类化合物在甲醇溶液中的UV光谱特征 benzoyl cinnamoyl(峰带II，220-280 nm) （峰带I，300-400 nm） 主要反映A环取代情况 主要反映B环取代情况 主要包含A环的苯甲酰基和主要包含B环的桂皮酰基组成了黄酮类化合物的交叉共轭体系，使黄酮类主要有两个紫外吸收带，带（300-400nm）-由桂皮酰基系统引起，主要反应B环取代情况；带（220-280 nm）-由苯甲酰基系统引起，主要反应A环取代情况。（1）黄酮、黄酮醇：在200-400 nm之间出现两个主要吸收峰，二者峰形相似，但带位置不同，可据此进行分类。在黄酮及黄酮醇母核上，如7-及4位引入羟基、甲氧基等供电基，将促进结构重排，引起相应吸收带红移，通常，整个母核上氧取代程度越高，带越向长波方向位移。的峰位主要受A-环氧取代程度的影响，B-环的取代基对其峰位影响甚微，但可影响它的形状。当B环有3，4-二氧取代时，带将为双峰。（2）查耳酮及橙酮类：共同特征是带很强，为主峰；带较弱，为次强峰。查耳酮中，带位于220270 nm，带位于340390 nm；橙酮中，常显现34个吸收峰，但主要吸收峰一般位于370430 nm。（3） 异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇 这三类化合物中，除有由A-环苯甲酰系统引起的带吸收外，因B环不与吡喃酮环上的羰基共轭（或共轭很弱），故带很弱。教学内容时间分配和媒体选择主要根据带I、带II的峰位、形状 进行结构推测 2. 加入诊断试剂后引起的位移及其在结构鉴定中的意义 诊断试剂： NaOMe, NaOAc, NaOAc/H3BO3; AlCl3, AlCl3/HCl 1） NaOMe： ：是一种强碱，使黄酮母核上的所有羟基产生某种程度的离子化，相应吸收峰红移。对黄酮及黄酮醇紫外光谱的影响用来检查游离的3及4-羟基。如加入甲醇钠后带红移4060 nm，强度不降，示有4-羟基；红移5060 nm，强度下降，示有3-羟基，但无4-羟基；若吸收谱随时间延长而衰退，示有对碱敏感的取代图式。教学内容时间分配和媒体选择2） NaOAc： 市售醋酸钠因含微量醋酸，碱性较弱，只能使黄酮母核上酸性较强的7-羟基离解，并影响峰带红移。如加入醋酸钠（未熔融）后带红移5 20nm，示有7-羟基。 NaOAc熔融处理后，碱性增强。3）NaOAc/H3BO3 在醋酸钠的碱性存在下，硼酸可与分子中的邻二酚羟基络合，引起相应吸收带红移。醋酸钠/硼酸: 谱带红移12 30nm，示B环有邻二酚羟基；带红移5 10nm，示A环有邻二酚羟基。4）AlCl3, AlCl3/HCl分子中有邻二酚羟基、3-羟基-4-酮基或5-羟基-4-酮基时，可与三氯化铝络合，引起相应吸收带红移. 铝络合物的相对稳定性： 黄酮醇3-OH > 黄酮5-OH > 二氢黄酮5-OH > 邻二酚OH > 二氢黄酮醇3-OH 邻二酚羟基和二氢黄酮醇5-OH在酸性条件下不与AlCl3络合；但不在酸性条件下，五者皆与Al3+络 合；形成络合物越稳定，红移越多。a. AlCl3/HCl与AlCl3中光谱比较§相同时，无邻二酚羟基；§不同时： B环有邻二酚羟基，带I 紫移3040nm； A，B环同时有邻二酚羟基，带I 紫移5060nm。b. AlCl3/HCl与MeOH中光谱比较§相同时，示无3-OH或5-OH。§不同时：只有5-OH，无3-OH时，带I 红移3355nm； 5-OH，6-氧代时，带I 红移1720nm；同时有5-OH，3-OH时，带I 红移5060nm； 只有3-OH时，带I 红移60nm。教案首页授课题目第五章 黄酮类化合物（3）授课形式讲 授授课时间2006.4.8授课学时2教学目的与 要 求1、掌握UV、NMR、MS在黄酮类化合物结构测定中的应用2、了解化学法在黄酮类结构测定中的应用基本内容黄酮类化合物的检识与结构鉴定1、色谱的应用2、紫外光谱的应用（重点）3、1H-MR谱的应用（重点）4、13C-NMR谱的应用（重点）5、MS谱的应用；6、结构研究实例重 点难 点紫外光谱的应用（重点）1H-MR谱的应用（重点、难点）主要教学媒 体主 要 外语 词 汇Benzoyl，cinnamoyl有关本内容的新进展主要参考资料或相关网站天然药物化学学习指导(人民卫生出版社)，吴继洲主编。系、教研室审查意见课后体会教学内容时间分配和媒体选择（四）氢核磁共振在黄酮类结构分析中的应用 C环质子信号可用于判断母核结构，二氢黄酮类化合物2，3位之间为单键，质子信号处于较高场（化学位移值小）；苯环质子如处于邻位，偶合常数较大，为9.0 Hz左右，如处于间位，偶合常数较小，为2.5 Hz左右。* 常用溶剂： 氘代氯仿：1H d 7.25, 13C d 76.9 氘代二甲基亚砜：1H d 2.62； 13C d 39.6 氘代吡啶：1H d 7.28，7.67，8.62； 13C d 123.7，135.9，149.8* 3，5，7三羟基黄酮（DMSOd6） 5-OH: d 12.40; 7-OH: d 10.93 3-OH: d 9.70; 重水置换1. A环质子 1）5，7-二羟基黄酮类： H6、H8 5.70 6.90 d （2.5Hz） H6（高场）< H8（低场） 7-O-糖苷 向低场位移2）7-羟基黄酮类： H5 8.0左右d（9.0Hz） H6 dd（9.0Hz，2.5Hz） H8 d （2.5Hz）H-6、H-8较5, 7-二OH黄酮低场，且相互位置可能颠倒25min教学内容时间分配和媒体选择2. B环质子 1）4-氧取代黄酮类： H2/6、H3/5：6.507.90 d （8.5 Hz），比A环质子稍低的磁场区H3/5（高场）< H2/6（低场） 2）3',4-二氧取代黄酮及黄酮醇类： H5：6.707.10 d （8.5Hz）；H2：7.207.90 d （2.5Hz）；H6：7.207.90 dd （8.5Hz、2.5Hz） H-2受C环负屏蔽和3-OR屏蔽作用，H-6 也受C环负屏蔽作用，而H-5则仅受4-OR屏蔽作用。故由低场到高场的顺序为：H-6® H-2 ®H-5。 但有时也会发生H-2和H-6重叠的现象。 3）3,4-二氧取代异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇类 H2、H5、H6：6.707.10 多重峰 （常常为两组峰），C环对其影响很小 4）3',4,5-三氧取代黄酮类： 若R1=R2=R3=H，则H-2,6为单峰， d 6.7-7.5 若上述条件不成立，则H-2,6分别为二重峰 （J=2Hz）教学内容时间分配和媒体选择3. C环质子 其所示特征是区别各类型黄酮类化合物的主要依据。  H-2H-3黄酮类 s，6.30异黄酮类s，7.607.80 8.508.70（DMSO） 二氢黄酮dd，5.20（Jtrans =11.0Hz） （Jcis =5.0Hz）dd，2.80（17.0、11Hz） 或（17.0、5.0 Hz）二氢黄酮醇3-O-糖d，4.90（Jtrans =11.0Hz）d, 5.005.60d,4.30(Jtrans =11.0Hz)d, 4.304.60查耳酮d，7.307.70（17.0Hz）d，6.707.40（17.0Hz）橙酮（=CH-）s，6.506.70 6.376.94 （DMSO） 4. 糖上的质子 糖的端基氢较其它糖区质子位于较低磁场区。4. 甲氧基上的质子： 3.504.1 5. C6-、C8-CH3质子 异黄酮：C6-CH3：2.042.27； C8-CH3：2.142.45教学内容时间分配和媒体选择（五）碳核磁共振在黄酮类化合物结构鉴定中的应用113C-NMR信号归属的一般方法： 1）与模型化合物如苯乙酮、桂皮酸及其衍生物的光谱进行比较。 2） 用经验的简单芳香化合物的取代基位移加和规律进行计算。2骨架类型的判断3黄酮类化合物取代图示的确定方法 1） 取代基位移的影响黄酮母核上引入羟基或甲氧基取代时，将使碳信号大幅度向低场位移，邻、对位向高场位移，间位也向低场位移，但幅度较小；通常:A环上引入取代基，位移效应只影响A环，B环上引入取代基，位移效应只影响B环。5min教学内容时间分配和媒体选择2）5，7-二羟基黄酮类中C-6和C-8信号的特征 一般 d 90.0100.0，C-6 > C-82）黄酮类化合物O-糖苷中糖的连接位置（1）糖的苷化位移及端基碳的信号：酚性苷中，糖上端基碳的苷化位移约为+4.0+6.0。（2）苷元的苷化位移：苷元糖苷化后Ispo-碳原子向高场位移，其邻位及对位碳原子则向低场位移，且对位碳原子的位移幅度大且恒定。（六）质谱在黄酮类结构测定中的应用 （本部分自学） 医学全在线 国内大型医学考试网站。致力于为中国医务工作者提供动力，专注于医学考试培训、医学人文发展、医药数据标准建设。联系： 邮箱： med126