水稻转基因组织培养步骤的具体事宜.doc
农杆菌介导的转化一 试剂16-BA (6-BenzylaminoPurine)Sigma Cat No. B-58982KT (Kinetin)Sigma Cat No. K-07533NAA (Napthalene acetic acid)Sigma Cat N-06404IAA (Indole-3-acetic acid)Sigma Cat No. I-514852,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)Sigma Cat No. D-84076KanamycinUSB Cat No. 179247CH (Casein Enzymatic Hydrolysate)Sigma Cat No. C-72908Hn (hygromycin B)GiBco BRL Cat No. 10687-0109Cn (Carbenicillin)国产分装10Nicotinic acidSigma Cat No. N-076511Pyridoxine HClSigma Cat No. P-866612Thiamine HClSigma Cat No. T-390213InositolSigma Cat No. I-301114PhytagelSigma Cat No. P-816915Dimethyl Sulfoxide-DMSOSigma Cat No. D-587916X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside)Sigma Cat No. B-378317AS (Acetosringone)Aldrich chem., CO 01531 EG二 溶液1. MSmaxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO41.7gMgSO47H2O3.7gCaCl22H2O4.4g 或 CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。2. MSmin母液(100×)KI0.083gH3BO30.62gMnSO4 4H2O2.23g 或 MnSO4 H2O 1.69gZnSO4 7H2O0.86gNa2MoO4 2H2O0.025gCuSO4 5H2O0.0025gCoCl2 6H2O0.0025g注意：Na2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合。加dH2O定容到1000ml室温保存。3. N6max母液(10×)KNO328.3gKH2PO44.0g(NH4)2SO44.63gMgSO4 7H2O 1.85gCaCl2 2H2O1.66g 或 CaCl21.25g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。4. N6 min母液(100×)KI0.08gH3BO30.16gMnSO4 4H2O0.44g 或 MnSO4 H2O0.3335gZnSO4 7H2O0.15g加dH2O定容到1000ml室温保存。5. Fe2+-EDTA(100×)取一个烧杯加300ml dH2O以及FeSO4 7H2O 2.78g；在另一个烧杯中也加300ml dH2O加热到70后加入Na2 EDTA 2H2O 3.73g；待到两种药品都溶解了，混合，70保温2hr，然后加dH2O定容到1L，4保存。6. 维生素(100×) Nicotinic acid0.1gPyridoxine HCl (VB6)0.1gThiamine HCl (VB1)0.1gGlycine0.2gInositol10g加dH2O定容到1000ml 4保存。7. AAmax母液(10×)KCl29.50gNaH2PO41.50g 或 NaH2PO4 2H2O 1.95gMgSO4· 7H2O2.50gCaCl2 2H2O1.50g 或 CaCl21.13g 加dH2O定容到1000ml室温保存。8. AA min母液(1000×)MnSO4 H2O1.0gH3BO30.3gZnSO4 7H2O0.2gKI0.075gNaMoO4 2H2O0.025gCuSO4 5H2O0.0025gCoCl2 6H2O0.0025gNa2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合，加dH2O定容到1000ml室温保存。9. 2,4-D母液(1mg/ml)2,4-D100 mg先加1.0 ml 1N KOH 摇5min，然后加10ml H2O 继续摇直到2,4-D溶解，加水定容到100 ml室温保存。10. 6-BA母液(1mg/ml)6-BA100mg加1.0 ml 1N KOH摇直到6-BA溶解，加水定容到100 ml室温保存。11. NAA母液(1mg/ml)NAA100mg加1.0ml 1N KOH 并搅动直到NAA溶解，加水定容到100 ml室温保存。12. IAA母液(1mg/ml)IAA100mg加1.0 ml 1N KOH摇直到IAA溶解，加水定容到100 ml室温保存。13. 100mM AS母液(1mg/ml)AS0.196gDMSO10ml分装到1.5 ml离心管4保存。14. 1N KOH母液(1mg/ml)KOH5.6g用100ml H2O溶解后室温保存。15. 羧苄青霉素2钠(CN) （200mg/ml）CN干粉 1g用5ml灭菌dH2O溶解后，分装到1.5ml Tub中（无菌操作）。或者用5ml 75酒精溶解，分装到1.5ml Tub中（无菌操作）。 16.A stock solution （继代A）: 硝酸铵 16.5g 硝酸钾 19.0g 磷酸二氢钾 1.7g 七水硫酸镁 3.5g 二水氯化钙 4g/无水氯化钙 3g 加水依次溶解，定容1000ml，室温保存 17.B stock solution （继代B）: 四水硫酸锰 5.0g 硼酸 1.5g 七水硫酸锌 2.0g 碘化钾 0.75g （未完） 二水钼酸钠 0.25g 五水硫酸铜 0.0389g 六水氯化钴 0.025g 加水依次溶解，定容1000ml，室温保存（二水钼酸钠单独称，单独溶，缓慢加入，边加边搅）三 农杆菌介导的水稻愈伤的遗传转化过程1 愈伤诱导1) 成熟种子脱壳后70%酒精灭菌1min，0.15% HgCl2处理15min；2) 灭菌单蒸水洗5-7次；3) 将种子接种到诱导培养基上，每瓶接6-8粒；4) 置黑暗中26±1处理约4-7周。2 愈伤继代挑取浅黄、致密且相对较干的胚性愈伤接种到继代培养基上26±1处理2周，不可接太多。3 预培养挑取致密且相对较干的胚性愈伤接种到预培养基上置黑暗中3至4天。4 农杆菌准备准备浸染的农杆菌扩大培养。在相应抗性平皿中涂菌，28度培养箱中培养23天5 农杆菌悬浮培养准备将农杆菌转移（粳稻：用接种环刮入半环-1环菌，籼稻：3环-4环菌 ）到100ml悬浮培养基中28摇瓶培养30-60min。6 农杆菌侵染（共培养）1) 经过预培养的愈伤转移到一个灭菌的三角瓶中；2) 调整农杆菌悬浮液的OD600值到0.8-1.0之间；3) 用农杆菌悬浮液浸泡愈伤2030min；4) 倒去菌液，将三角瓶倒立于含滤纸的灭菌小皿中约15min；5) 愈伤放在灭菌的滤纸上晾干后，转移到共培养培养基上去。培养物19-20黑暗处理2天。7 水洗和筛选1) 经过共培养的愈伤转移到一个灭菌的三角瓶中；2) 用灭菌单蒸水洗5至7次愈伤；3) 用含有400ppm Cn（羧苄青霉素二钠）的灭菌水浸泡愈伤30min（封好口后，可于28度，180至200RPM摇2030min）；4) 倒去含抗生素的灭菌水，将三角瓶倒立于含滤纸的灭菌小皿中约15min；5) 在灭菌的滤纸上晾干愈伤；6) 转移愈伤到相应抗性的筛选培养基筛选2-3个循环（每个循环约2周）8 预分化与分化1) 经过筛选得到的抗性愈伤转到带抗性的预分化培养基的培养皿中，黑暗处理5-7天；2) 经过预分化的愈伤转移到100ml三角瓶里的分化培养基中，每瓶3粒愈伤，只选亮黄色的抗性愈伤，不必接入太多。；3) 26光照处理，约需4060天。9 生根1) 从分化瓶中挑出要做生根的苗子，同一块愈伤所得的苗子只选一棵；2) 剪掉所有原有的根，注意不要剪掉分生组织；3) 将苗子转入生根培养基，28光照处理7至10天。10 移栽移去生根管的封口膜，倒入约1cm深的自来水，在光照培养室炼苗34天，移栽至准备好的栽种处。四 培养基注意：所有的培养基必须现配现用。（一） 粳稻的转化1. 诱导培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 100mlN6min母液(100×) 10mlFe2-EDTA母液 (100×) 10mlVitamin母液 (100×)10ml2,4-D母液2.5ml脯氨酸0.3g水解酪蛋白 0.6g蔗糖 30gPhytagel3g加H2O 600-700ml并用KOH调节pH到5.9，煮沸后加H2O定容到1000ml，分装到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口灭菌。2. 继代培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 100mlN6min母液(100×) 10mlFe2-EDTA母液 (100×) 10mlVitamin母液 (100×)10ml2,4-D母液2.0ml脯氨酸0.5g水解酪蛋白 0.6g蔗糖 30gPhytagel3g加H2O 900ml并用1N KOH调节pH到5.9，煮开后加H2O定容到1000ml，分装到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口灭菌。3. 预培养培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 12.5mlN6min母液(100×) 1.25mlFe2-EDTA母液 (100×) 2.5mlVitamin母液 (100×)2.5ml2,4-D母液 0.75ml水解酪蛋白 0.15g蔗糖 5g琼脂粉1.75g加H2O 250ml并用1N KOH调节pH到5.6，封口膜封口灭菌。使用前，煮溶培养基，加入5ml葡萄糖母液（灭菌的50%葡萄糖溶液）和250l AS母液，然后分装到培养皿中（25ml/皿）。4. 共培养培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 12.5mlN6min母液(100×) 1.25mlFe2-EDTA母液 (100×) 2.5mlVitamin母液 (100×)2.5ml2,4-D母液 0.75ml水解酪蛋白 0.2g蔗糖 5g琼脂粉1.75g加H2O 250ml并调节pH到5.6，封口膜封口灭菌。使用前，煮溶培养基，加入5ml葡萄糖母液（灭菌的50%葡萄糖溶液）和250l AS母液，然后分装到培养皿中（25ml/皿）。5. 农杆菌悬浮培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 5mlN6min母液(100×) 0.5mlFe2-EDTA母液 (100×) 0.5mlVitamin母液 (100×) 1ml2,4-D母液 0.2ml水解酪蛋白 0.08g蔗糖 2g加H2O 100ml并调节pH到5.4，分装到2个100ml三角瓶（50ml/瓶），封口膜封口灭菌。使用前，加入1ml葡萄糖和100l AS母液。6. 筛选培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 25mlN6min母液(100×) 2.5mlFe2-EDTA母液 (100×) 2.5mlVitamin母液 (100×)2.5ml2,4-D母液 0.625ml水解酪蛋白 0.15g蔗糖 7.5g琼脂粉1.75g加H2O 250ml并调节pH到6.0，封口膜封口灭菌。使用前，煮溶培养基，加入250l Hn（潮霉素）和200ppm Cn（国产），然后分装到培养皿中（25ml/皿）。7. 预分化培养基（用于粳稻）MSmax母液(10×) 25mlMSmin母液(100×) 2.5mlFe2-EDTA母液 (100×) 2.5mlVitamin母液 (100×)2.5ml6-BA母液 0.5mlKT母液 0.5mlNAA母液 50lIAA母液 50l水解酪蛋白 0.15g蔗糖 7.5g琼脂粉1.75g加H2O 250ml并调节pH到5.9，封口膜封口灭菌。使用前，煮溶培养基，加入250l Hn和200ppm Cn（国产），然后分装到培养皿中（25ml/皿）。8. 分化培养基（用于粳稻）MSmax母液(10×) 100mlMSmin母液(100×) 10mlFe2-EDTA母液 (100×) 10mlVitamin母液 (100×) 10ml6-BA母液 2.0mlKT母液 2.0mlNAA母液 0.2mlIAA母液 0.2ml水解酪蛋白 1g蔗糖 30gPhytagel 3g加H2O 1000ml并用1N KOH调节pH到6.0，煮开后分装到100ml三角瓶中（50ml/瓶），封口膜封口灭菌。9. 生根培养基MSmax母液(10×) 50mlMSmin母液(100×) 5mlFe2-EDTA母液 (100×) 10mlVitamin母液 (100×) 10ml蔗糖 20gPhytagel 3g加H2O 1000ml并用1N KOH调节pH到5.8，煮开后分装到生根管中，封口膜封口灭菌。（二） 籼稻的转化1. 诱导培养基（用于籼稻）MSmax母液(10×) 100mlMSmin母液(100×) 10mlFe2-EDTA母液 (100×) 10mlVitamin母液 (100×)10ml2,4-D母液2.5ml脯氨酸0.5g谷氨酰胺 0.5g水解酪蛋白 0.6g蔗糖 30gPhytagel3g加H2O 600-700ml并用KOH调节pH到6.0，煮沸后加H2O定容到1000ml，分装到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口灭菌。2. 继代培养基（用于籼稻）继代A (10×) 100ml继代B (100×) 10mlFe2-EDTA母液 (100×) 10mlVitamin母液 (100×)10ml2,4-D母液3.0ml脯氨酸0.6g谷氨酰胺 0.5g水解酪蛋白 0.8g麦芽糖30gPhytagel3g加H2O 900ml并用1N KOH调节pH到6.0，煮开后加H2O定容到1000ml，分装到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口灭菌。3. 预培养培养基（用于籼稻）MSmax母液(10×) 12.5mlMSmin母液(100×) 1.25mlFe2-EDTA母液 (100×) 1.25mlVitamin母液 (100×)1.25ml2,4-D母液 0.75ml水解酪蛋白 0.15g麦芽糖 5g琼脂粉1.75g加H2O 250ml并用1N KOH调节pH到6.0，封口膜封口灭菌。使用前，煮溶培养基，加入5ml葡萄糖母液（灭菌的50%葡萄糖溶液）和250l AS（乙酰丁香酮）母液，然后分装到培养皿中（25ml/皿）。4. 农杆菌悬浮培养基（用于籼稻）AAmax母液(10×) 5mlAAmin母液(100×) 0.5mlFe2-EDTA母液 (100×) 0.5mlVitamin母液 (100×) 1ml2,4-D母液 0.2ml谷氨酰胺 0.0876天冬酰胺 0.0216精氨酸 0.0176麦芽糖 2g葡萄糖 2g(葡萄糖可以配成50%的母液分开灭，在倒皿时加4ml/100ml瓶)加H2O 100ml并调节pH到5.4，过滤灭菌，加入100l AS母液，分装到2个100ml三角瓶（50ml/瓶）。5. 共培养培养基（用于籼稻）MSmax母液(10×) 6.25mlMSmin母液(100×) 1.25mlFe2-EDTA母液 (100×) 2.5mlVitamin母液 (100×)2.5ml2,4-D母液 0.75ml水解酪蛋白 0.2g麦芽糖 5g琼脂粉1.75g加H2O 250ml并调节pH到5.6，封口膜封口灭菌。使用前，煮溶培养基，加入5ml葡萄糖母液（灭菌的50%葡萄糖溶液）和250l AS母液，然后分装到培养皿中（25ml/皿）。6. 筛选培养基（用于籼稻）A母液(10×) 25mlB母液(100×) 2.5mlFe2-EDTA母液 (100×) 2.5mlVitamin母液 (100×)2.5ml2,4-D母液 0.625ml脯氨酸 0.15ml谷氨酰胺 0.1g水解酪蛋白 0.15g蔗糖 7.5g琼脂粉1.75g加H2O 250ml并调节pH到6.0，封口膜封口灭菌。使用前，煮溶培养基，加入250l Hn（潮霉素）和200ppm CN（国产），然后分装到培养皿中（25ml/皿）。（CN配方：10g/40ml灭菌双蒸水，剧烈摇匀，后分装于1.5ml离心管，-20度保存； CN加量：一筛400-500ul/250ml瓶，二筛300-350ul/250ml瓶，三筛250ul/250ml瓶）7. 预分化培养基（用于籼稻）N6max母液(10×) 25mlN6min母液(100×) 2.5mlFe2-EDTA母液 (100×) 2.5mlVitamin母液 (100×)2.5ml6-BA母液 0.5mlKT母液 0.5mlNAA母液 50lIAA母液 50l水解酪蛋白 0.15g脯氨酸 0.15g麦芽糖 5g蔗糖 2.5g琼脂粉1.75g加H2O 250ml并调节pH到5.9，封口膜封口灭菌。使用前，煮溶培养基，加入250l Hn和200ppm CN（国产），然后分装到培养皿中（25ml/皿）。8. 分化培养基（用于籼稻）N6max母液(10×) 100mlMsmin母液(100×) 10mlFe2-EDTA母液 (100×) 10mlVitamin母液 (100×) 10ml6-BA母液 2.0mlKT母液 2.0mlNAA母液 0.2mlIAA母液 0.2ml脯氨酸 0.6g水解酪蛋白 1g麦芽糖 20g蔗糖 10gPhytagel 3g加H2O 1000ml并用1N KOH调节pH到6.0，煮开后分装到100ml三角瓶中（50ml/瓶），封口膜封口灭菌。9. 生根培养基MSmax母液(10×) 50mlMSmin母液(100×) 5mlFe2-EDTA母液 (100×) 10mlVitamin母液 (100×) 10ml蔗糖 20gPhytagel 3g加H2O 1000ml并用1N KOH调节pH到5.8，煮开后分装到生根管中，封口膜封口灭菌。转化过程中所用各种抗生素浓度为：潮霉素（Hygromycin B, Roche）贮存液浓度50 g/L，培养基中终浓度50 mg/L；羧苄青霉素（Carbenicillin Sodium，上海生工生物工程技术服务有限公司）贮存液浓度200 g/L，培养基中终浓度400 mg/L；头孢霉素（Cefalothin Sodium，上海生工生物工程技术服务有限公司）贮存液浓度200 g/L，培养基中终浓度400 mg/L；G418（Antibiotic G418 Sulfate, Promega）贮存液浓度50 g/L，培养基中终浓度50 mg/L。 提交人：王鹏
