最新大肠杆菌感受态细胞及其制备ppt课件.ppt

大肠杆菌感受态细胞及其大肠杆菌感受态细胞及其制备制备l什么是感受态细胞（Competent cell）？细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态，感受态，经特殊处理后处于此状态的细胞称感受体细胞。感受体细胞。仪器及设备 高速冷冻离心机、超净台、冰盒、冰若干等。离心杯、移液器、吸嘴、EP管、自封袋等。培养基及试剂 液体LB培养基、无抗平板、Amp平板、带Amp抗性的质粒、100mM CaCl2 溶液（含15%甘油）。9准备工作所有使用的移液器、吸嘴、离心杯、EP管以及装培养基的容器最好是专用。洗涤容器时用水清洗干净，尽量不要用洗涤剂（洗涤剂一般含有表面活性剂而表面活性剂对感受态影响很大）离心杯、EP管灭菌后置于-20预冷备用。自封袋写上感受态名称、批号。划板从-80冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板上划线，并将菌种迅速放回-80保存。在划线板上做好相应标记，于37培养16-20小时。接种在照过紫外的超净台中，用灼烧并冷却后的镊子夹住一个20l枪头（或者灭过菌的牙签），挑取单克隆，放入装有LB的试管中，将试管置于37恒温摇床培养10-12小时。转接将过夜菌按比例转接至准备好的液体培养基中。一般转接菌液与培养基体积比例不得大于:，即转接菌液:培养基体积:培养基体积与三角瓶体积比不得小于:，即 培养基体积:三角瓶体积:要有足够的空间提供溶氧。转接完成后，置于37，220r/min培养1小时左右。检测OD600值，一般OD600值不要超过0.6，也不要低于0.2。ODOD值值是一个重要的参数，当OD600值大于一定值时，菌体不会保持对数生长。同时，OD值大时菌体总量达，所以需要在这两个方面的影响中找到一个平衡点。不同的菌种所对应的值不一样。注：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。离心操作过程中低温有助于感受态的形成，以下步骤操作过程中低温有助于感受态的形成，以下步骤都需快速在冰上操作，并严防污染！都需快速在冰上操作，并严防污染！1.将达到浓度的菌液在超净台中转移到事先于-20预冷的离心杯中。将装有菌液的离心杯置于冰上10min，使菌液迅速冷却。2.取出冷却后的离心杯，配平后对称放入冷冻离心机，4000r/min，4，离心15min。此时可以将CaCl2 溶液放入-20预冷（CaCl2 溶液不要放太早，否则会冻住，冷冻结晶后的CaCl2 溶液最好弃去）。不同菌种，离心的转速和时间可以酌情更改。3.离心结束后，小心倒去上清，加入0.2倍菌液体积的预冷CaCl2 溶液。充分悬浮细胞。4.配平后对称放入冷冻离心机，4000r/min，4，离心15min，充分除去上清，加入0.05倍菌液体积的预冷CaCl2 溶液。充分悬浮细胞。冰浴30min。分装在冰上将定容好的细胞以50l/支分装到预冷的EP管中，将EP管插入冰中。分装完成后装入对应的自封袋，立即放入-80备用。检测（转化）转化的原理 溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。另设一组阴阳性对照。阴性对照：即不转入任何质粒，热击后涂 Amp平板。阳性对照：即不转入任何质粒，热击后涂无抗板。待平板表面菌液被吸收，倒置于37过夜培养。检测结果评判正常情况：转入质粒的平板和阳性对照长菌，阴性对照不长菌。若阳性对照不长菌，说明细胞已经死亡；阴性对照长菌，说明已经被污染。应弃去整批感受态。若对照组正常，转入质粒的平板不长菌，应重新再做转化，设如同前一次的对照组。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！23